Dit protocol beschrijft een kwantitatieve benadering om microbiële autoaggregatie te meten met behulp van beeldvormende flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nuttige en probiotische bacteriën spelen een essentiële rol in hun gastheren en bieden verschillende gezondheidsvoordelen, waaronder immuniteit tegen infectieziekten. De familie Lactobacillaceae bestaat uit Gram-positieve bacteriën met bevestigde probiotische eigenschappen. Deze studie maakt gebruik van Lactobacillaceae-soorten als model om de effectiviteit van single-cell high throughput-analyse aan te tonen bij het bestuderen van cellulaire aggregatie. De focus ligt op het analyseren van de reactie van deze nuttige soorten op enkelvoudige koolhydraten uit de voeding.
De studie laat zien hoe Imaging Flow Cytometry (IFC) de fundamentele verschillen in de assemblage van probiotische bacteriën in de aan- en afwezigheid van koolhydraten kan overwinnen. IFC combineert de kracht en snelheid van conventionele flowcytometrie met de ruimtelijke resolutie van microscopie, waardoor complexe morfometrische metingen met hoge snelheid op een fenotypisch gedefinieerde manier mogelijk zijn in een bibliotheek van gunstige bacteriestammen en omstandigheden. Dit protocol geeft inzicht in de autoaggregatie van Lactobacillaceae-soorten en werpt licht op hun reactie op koolhydraten in de voeding, en draagt bij aan het begrijpen van de mechanismen achter de gunstige effecten van deze probiotische bacteriën.
Inleiding
Bacteriële autoaggregatie wordt beschouwd als een primaire stap in de vorming van biofilm. In dit proces (soms ook autoagglutinatie of flocculatie genoemd) vormen bacteriën van hetzelfde type meercellige klonten die zich uiteindelijk op de bodem van kweekbuisjes nestelen of zich hechten aan hun doelweefsel of oppervlak1.
Autoaggregatie is een veel waargenomen fenomeen en is tot nu toe aangetoond bij Gram-negatieve pathogenen zoals de opportunistische ziekteverwekker Acinetobacter baumannii2, de tandpathogeen Aggregobacter actinomycetemcomitans3 en de o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het .ast-bestand, met het sjabloon voor Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als voorbeeld, wordt geleverd in aanvullend coderingsbestand 1.
1. Voorbereiding van de media
- Bereid Lactobacill MRS-bouillon volgens de instructies van de fabrikant (55 g in 1 L gedeïoniseerd water) en Lactobacill MRS-agarplaten met 1,5% (w/v) agar (zie Materiaaltabel). Na sterilisatie in de autoclaaf is het medium direct klaar voor gebruik of kan het bij 4 °C worden bewaard.
- Bereid 50% (15 g in 1 L gedeïoniseerd water) tryptische sojabouillon (TSB) (zie materiaaltabel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De resultaten tonen aan dat deze methode gemakkelijk de verschillen in autoaggregatie als reactie op voedingssuikers in LAB-bacteriën kan meten. Door individuen te scheiden van aggregaten, maakt de methode het mogelijk om het percentage van de populatie van de aggregatiegebeurtenissen uit alle gebeurtenissen te berekenen als reactie op fermenteerbare of niet-fermenteerbare suikers uit het dieet. Bovendien was het mogelijk om te meten of er verschillen zijn in de gemiddelde grootte van de populatie van het aggregaat tusse.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Flowcytometrie is een veelgebruikte methode voor het kwantificeren van fluorescentie-intensiteiten in eukaryote cellen, maar het levert mogelijk geen nauwkeurige metingen op voor bacteriële cellen vanwege hun grotere omvang of kleine aggregaten. Deze factoren kunnen een aanzienlijke invloed hebben op de precieze kwantificering van autoaggregatie en het basale niveau van aggregaatvorming in verschillende omstandigheden. Om dit aan te pakken, werd beeldvormende flowcytometrie (IFC) gebruikt om een betere resolutie te krijg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Israeli Science Foundation (Grant 119/16) en IMoh grant (3-15656) aan IKG. R.S. ondersteund door de Kreitman fellowship.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 14 mL culture tubes | Falcon | 352051 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Bacto Agar | Baeton,Dickinson and Company | 214010 | |
| Bacto Typtic Soy Broth | Baeton,Dickinson and Company | 211825 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma | 83400-25G | |
| Difco Lactobacilli MRS broth | Baeton,Dickinson and Company | 288130 | |
| EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf) | FL medical | 23053 | |
| IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details beschikbaar op: https://www.merckmillipore.com/INTL/nl/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1 |
| ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details beschikbaar op: https://www.merckmillipore.com/INTL/nl/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| MOPS, 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur | Fisher bioreagents | BP308-500 | |
| Kaliumfosfaat dibasisch | Fisher Scientific, 174,18 g/mol | BP363-1 | |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma, 136,09 g/mol | P0662-500G |
Referenties
- Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
- Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
