Methodenartikel

Toepassing van Ha-CoV-2-pseudovirus voor snelle kwantificering van SARS-CoV-2-varianten en neutraliserende antilichamen

DOI:

10.3791/65793

⸱

8 september 2023

 ,  , 
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology, George Mason University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de toepassing van een nieuw hybride alfavirus-SARS-CoV-2-pseudovirus (Ha-CoV-2) als platform voor snelle kwantificering van de besmettelijkheid van SARS-CoV-2-varianten en hun gevoeligheid voor neutraliserende antilichamen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) heeft de noodzaak benadrukt van snelle tests om de besmettelijkheid van opkomende SARS-CoV-2-varianten en de effectiviteit van door vaccins geïnduceerde neutraliserende antilichamen tegen virale varianten nauwkeurig te meten. Deze tests zijn essentieel voor pandemische surveillance en het valideren van vaccins en variantspecifieke boosters. Dit manuscript demonstreert de toepassing van een nieuw hybride alfavirus-SARS-CoV-2-pseudovirus (Ha-CoV-2) voor snelle kwantificering van de besmettelijkheid van SARS-CoV-2-varianten en vaccin-geïnduceerde neutraliserende antilichamen tegen virale varianten. Ha-CoV-2 is een SARS-CoV-2-virusachtig deeltje dat bestaat uit virale structurele eiwitten (S, M, N en E) en een snel tot expressie komend RNA-genoom dat is afgeleid van een alfavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 bevat ook zowel groen fluorescerend eiwit (GFP) als luciferase-reportergenen die een snelle kwantificering van virale besmettelijkheid mogelijk maken. Zo wordt de besmettelijkheid van de varianten SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) en Omicron (B.1.1.529) gekwantificeerd en wordt ook hun gevoeligheid voor een neutraliserend antilichaam (27VB) gemeten. Deze voorbeelden tonen het grote potentieel van Ha-CoV-2 aan als een robuust platform voor snelle kwantificering van SARS-CoV-2-varianten en hun gevoeligheid voor neutraliserende antilichamen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanaf mei 2023 zijn er nu meer dan 766 miljoen COVID-19-gevallen1. Ondanks wereldwijde vaccinatiecampagnes circuleert SARS-CoV-2 voortdurend en infecteert het mensen, grotendeels als gevolg van de opkomst van nieuwe varianten zoals Delta (B.1.617.2) en Omicron (B.1.1.529) die nieuwe infectiegolven veroorzaken 2,3,4. Aangezien SARS-CoV-2 voortdurend evolueert, is het belangrijk om snelle tests te ontwikkelen die de besmettelijkheid van opkomende varianten en de effectiviteit van door vaccins geïnduceerde neutraliserende antilichamen tegen deze varianten nauwkeurig kunnen meten. Deze tests zijn essentieel voor pandemische surveillance en voor het bepalen van de werkzaamheid van vaccins en hun variantspecifieke boosters.

Vanwege de zeer besmettelijke aard van SARS-CoV-2 vereist het Center for Disease Control and Prevention (CDC) dat de studie van SARS-CoV-2 en zijn varianten wordt uitgevoerd in bioveiligheidsniveau (BSL) 3-faciliteiten 5,6. Deze BSL-3-vereiste beperkt het gebruik van levende virussen voor het kwantificeren van de besmettelijkheid van virale varianten en hun neutraliserende antilichamen in gemeenschappelijk onderzoek en klinische laboratoria. Bovendien zijn traditionele SARS-CoV-2-neutralisatietests, zoals de op plaque of cytopathische effecten gebaseerde assays met replicatiecompetente levende virussen, tijdrovend en vereisen ze lange incubatieperioden7. Er zijn verschillende spike (S)-eiwit-pseudogetypeerde SARS-CoV-2-pseudovirussen ontwikkeld om de effectiviteit van neutraliserende antilichamente kwantificeren 8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2 is het S-eiwit het belangrijkste eiwit dat virale toegang13 bemiddelt, en is het het belangrijkste antigeen dat wordt gebruikt in SARS-CoV-2-vaccins 9,10,14,15,16. De S-proteïne-pseudogetypeerde virionen, zoals die van het vesiculaire stomatitisvirus (VSV-G) of lentivirus, zijn gebruikt voor de kwantificering van neutraliserende antilichamen 17,18,19. Desalniettemin heeft het op lentivirus gebaseerde pseudovirus normaal gesproken 2 tot 3 dagen infectie nodig om de signalen van de verslaggever te kwantificeren. Op VSV gebaseerde pseudovirussystemen bevatten vaak resterende VSV-virussen, wat kan leiden tot een hoog percentage vals-positieve resultaten en doorgaans 24 uur infectievereist20.

Een nieuw SARS-CoV-2 pseudovirussysteem, het hybride alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), is onlangs ontwikkeld door Hetrick et al12. Ha-CoV-2 biedt een nieuw hulpmiddel voor de snelle kwantificering van virusbesmettelijkheid en virusgevoeligheid voor neutraliserende antilichamen in gewone BSL-2-laboratoria. Structureel lijkt Ha-CoV-2 op het SARS-CoV-2-viriondeeltje, bestaande uit structurele eiwitten van SARS-CoV-2, waaronder het S-eiwit (S), het membraan (M), het nucleocapside (N) en de envelop (E), en er is geen structureel eiwit van andere virussen. Bovendien bevat het Ha-CoV-2-deeltje een RNA-genoom dat snel tot expressie komt van een alfavirus voor snelle expressie van reporters in cellen. Van Ha-CoV-2 is aangetoond dat het snel de neutraliserende activiteit van antilichamen meet in de sera van gevaccineerde en herstellende personen12. Zoals aangetoond door Hetrick et al., in vergelijking met het op lentivirus gebaseerde SARS-CoV-2-pseudovirus in een tijdsverlooptest, bracht Ha-CoV-2 de Luc-verslaggever al 2-4 uur na infectie tot expressie, terwijl het lentivirus-pseudovirus Luc na 24 uur12 tot expressie bracht. Bovendien wordt de mogelijke toepassing van Ha-CoV-2-varianten voor het kwantificeren van neutraliserende antilichamen verder aangetoond door gebruik te maken van een standaard monoklonaal neutraliserend antilichaam, 27BV (zie aanvullende figuur 1)12. Dit werk beschrijft het gebruik van het Ha-CoV-2-platform voor snelle kwantificering van de besmettelijkheid van SARS-CoV-2-varianten, met de Delta (B.1.617.2) en de Omicron (B.1.1.529) varianten als voorbeelden. Bovendien wordt de mogelijke toepassing van Ha-CoV-2-varianten voor het kwantificeren van neutraliserende antilichamen verder aangetoond door gebruik te maken van een standaard monoklonaal neutraliserend antilichaam, 27BV12.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Assemblage van virussen en virale deeltjes

  1. Vectoren: Koop expressievectoren voor SARS-CoV-2 M, E of N, evenals de SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2) en Omicron (B.1.1.529) commercieel.
    OPMERKING: Eiwitsequenties van de expressievectoren zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. De leverancier van deze expressievectoren is ook te vinden onder de Tabel met materialen.
  2. Cellen en celkweek: Onderhoud HEK293T cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 50 eenheden/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine.
    OPMERKING: Al het celkweekwerk moet worden gedaan in een laminaire luchtstroombioveiligheidskast. De polyethyleenimine (PEI)-transfectie vereist doorgaans 5-6 uur incubatie. Starttijden moeten vooraf zorgvuldig worden overwogen.
  3. Virusassemblage en op PEI gebaseerde cotransfectie: Assembleer Ha-CoV-2-deeltjes door cotransfectie van HEK293T cellen. Zaadcellen in een 10 cm celkweek petrischaaltje (4-5 x 10,6 cellen per schaaltje) in 10 ml compleet DMEM-medium de dag voorafgaand aan de cotransfectie. Voor deze studie worden drie petrischaaltjes gebruikt om cellen te zaaien voor de assemblage van respectievelijk Ha-CoV-2 wildtype, Delta en Omicron.
  4. Incubeer petrischaaltjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C. Controleer de vaat de volgende ochtend om er zeker van te zijn dat de cellen voor 80% samenvloeien. Verwijder het volledige medium en vervang het door 9 ml DMEM serumvrije media.
  5. Bereid voor elk gerecht een cotransfectiemengsel met 2,5 μg van elk van de SARS-CoV-2 structurele eiwitexpressievectoren (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-genoom) en 2,5 μg van de S-eiwitexpressievector, de Delta- of de Omicron S-varianten en 45 μL op PEI gebaseerd transfectiereagens. Laat het cotransfectiemengsel complexen vormen door 13 minuten te incuberen (niet langer dan 30 minuten incuberen).
  6. Voeg na de incubatie het cotransfectiemengsel langzaam druppelsgewijs toe aan elke petrischaal. Plaats de schalen gedurende 6 uur in een CO2 -incubator bij 37 °C. Verwijder na 6 uur serumvrije DMEM en vervang deze door volledig DMEM-medium. Oogst het virus 48-60 uur na cotransfectie.
  7. Oogsten en opslaan van virussen: Oogst deeltjes 48 uur na cotransfectie. Maak de cellen los door herhaaldelijk over het oppervlak van de monolaag te pipetteren en verzamel de cellen van elke schaal, doe ze in centrifugebuisjes van 15 ml en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 400 x g . Vang het supernatans op en haal het door een filter van 0,22 μM. Bewaar het Ha-CoV-2 pseudovirus bij -80 °C.

2. Virale infectiviteitstest

  1. Cellen en celkweek: Onderhoud HEK293T (ACE2/TMPRSS2) cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% warmte-geïnactiveerde FBS, 50 eenheden/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine.
  2. Zaaien van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen: De dag vóór de virale infectiviteitstest, zaad HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen in een plaat met 96 putjes in 50 μL complete DMEM-media. Zaai voor elke plaat met 96 putjes 2,5 x 104 cellen in elk putje, en er zijn in totaal 2,5 x 106 cellen nodig voor één plaat. Plaats de plaat met 96 putjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C.
  3. Infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Gebruik deeltjes van Ha-CoV-2-varianten om HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen te infecteren. Verwijder op de ochtend van de infectie 50 μL DMEM uit de vooraf gezaaide plaat met 96 putjes. Vervang media door 50 μL Ha-CoV-2 Wild-type, Delta of Omicron gedurende 18 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt totdat de infectie 18 uur incubatie heeft bereikt en de plaat klaar is om te worden geanalyseerd via Luciferase Assay. Het succes van de infectie wordt bepaald door de Luciferase-test die het resultaat is van het Luciferase-reportergen, dat tot expressie komt in de geïnfecteerde cellen, dus hoe meer signaal wordt geproduceerd, hoe succesvoller de infectie van de Ha-CoV-2-variant is.
  4. Luciferase-test: Voeg na 18 uur incubatie 7,5 μL cellysebuffer rechtstreeks toe aan elk putje en meng door orbitaal schudden gedurende 2 minuten. Lysecellen in lysisbuffer gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Bereid de Firefly luciferase assay-oplossing door de D-luciferine-oplossing te mengen met de Firefly luciferase-assay-oplossing in een verhouding van 1:50. Combineer voor een hele plaat met 96 putjes 3 ml van de luciferase-substraatoplossing met 60 μl van de D-luciferine-oplossing met 2940 μl van de Firefly luciferase-bufferoplossing.
  6. Voeg 25 μL van de Firefly luciferase-testoplossing toe aan de cellysaten en meng de plaat door orbitaal te schudden gedurende 1 minuut. Analyseer de luciferase-activiteit met behulp van een in de handel verkrijgbare luciferase-microplaatlezer.

3. RNA-extractie van Ha-CoV-2 en kwantitatieve reverse transcriptase PCR (RT-qPCR)

  1. Virale RNA-extractie: Extraheer het virale RNA uit Ha-CoV-2 Wild-type en de Ha-CoV-2 Delta- en Omicron-variantdeeltjes met behulp van een commerciële virale RNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het geëxtraheerde virale RNA bij -80 °C of gebruik het onmiddellijk voor RT-qPCR.
  2. RT-qPCR: Voer RT-qPCR uit op viraal RNA met behulp van een mastermix in één stap. Voer de reactie uit in een in de handel verkrijgbare PCR-machine. Houd er rekening mee dat het doelwit van amplificatie het genomische RNA van Ha-CoV-2 is. Gebruik Ha-CoV-2-vector-DNA als standaard voor het maken van een standaardcurve en het berekenen van het RNA-kopienummer van elke variant.

4. Neutraliserende antilichaamtest

  1. Zaaien van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen: De dag voor de test HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen in een plaat met 96 putjes in 50 μL volledige DMEM-media. HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen worden commercieel aangekocht.
  2. Voor het tellen van cellen worden cellen van 20 μl verkregen uit een T75-kolf met HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen en mengen met 20 μl trypanblauwoplossing. Voeg 20 μL van dit mengsel toe aan de telkamer van de cellen en tel het aantal cellen per ml. Om een plaat met 96 putjes voor infectie te zaaien, gebruikt u 2,5 x 104 cellen per putje, en in totaal zijn 2,5 x 106 cellen nodig. Plaats de plaat met 96 putjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C.
  3. Neutraliserende antilichaamtest: Bereid in een steriele polypropyleen plaat met 96 putjes het standaard 27BV-neutraliserende antilichaam en Ha-CoV-2-mengsel. Voeg 8 μL 27BV (45 mg/ml) toe aan de plaat en voer seriële verdunningen van het antilichaam uit met 6 μL serumvrije DMEM.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u pipetpunten verwisselt tussen putoverdrachten en zorg ervoor dat het antilichaam en het serumvrije medium grondig worden gemengd om nauwkeurige resultaten te produceren.
  4. Voeg aan het serieel verdunde antilichaam 54 μL Ha-CoV-2-deeltje toe en meng het virus en het antilichaam. Pre-incubeer Ha-CoV-2-deeltjes met serieel verdund 27BV gedurende 1 uur bij 37 °C bij 5% CO2. Breng na de incubatie van 1 uur 50 μL van het antilichaam- en Ha-CoV-2-mengsel aan op de plaat met 96 putjes met de HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen (2,5 x 104 cellen per putje) die de dag ervoor zijn gezaaid.
  5. Laat voor de controles ten minste drie putjes over die alleen de HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen bevatten. Voeg 50 μL compleet medium toe aan deze putjes om te dienen als niet-geïnfecteerde putjes voor het achtergrondsignaal van de luciferase-testmetingen.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt totdat de infectie 18 uur incubatie bij 37 °C heeft bereikt, en dan is de plaat klaar om te worden geanalyseerd via een luciferase-test.
  6. Luciferase-test: Voeg na 18 uur incubatie 7,5 μl lysisbuffer rechtstreeks toe aan elk putje en meng door orbitaal schudden gedurende 2 minuten. Lysecellen in lysisbuffer gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Bereid de Firefly luciferase assay-oplossing door de D-luciferine-oplossing te mengen met de Firefly luciferase-assay-oplossing in een verhouding van 1:50. Combineer voor een hele plaat met 96 putjes 3 ml van de luciferase-substraatoplossing met 60 μl van de D-luciferine-oplossing met 2940 μl van de firefly luciferase-bufferoplossing.
  8. Voeg 25 μL van de Firefly luciferase-testoplossing toe aan de cellysaten en meng de plaat door orbitaal te schudden gedurende 1 minuut. Analyseer de luciferase-activiteit met behulp van een in de handel verkrijgbare luciferase-microplaatlezer.

5. Kwantificering en statistische analyse

  1. Gegevensverzameling: Voer infectie- en luciferasetests in drievoud uit zoals aangegeven (Figuur 1). Kwantificeer de luciferase-expressie met luciferase-testmetingen. Het gemiddelde is de gemiddelde waarde van de drie luciferase-testwaarden. Achtergrondsignaalmetingen van niet-geïnfecteerde putten worden van deze gemiddelde waarde afgetrokken. De standaarddeviatie (SD) wordt bepaald aan de hand van de gemiddelde waarde van de luciferase-testwaarden.
  2. Gegevensanalyse: Uitzetten van de neutralisatieactiviteit van antilichamen en het berekenen van de ID50-waarden (50% remmingsdosering) met behulp van commerciële grafische software. De ID50-waarde wordt gedefinieerd als de antilichaamremmende verdunningen waarbij een vermindering van 50% van de infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen (op basis van luciferase-testmetingen) wordt bereikt.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ha-CoV-2-deeltjes werden geassembleerd met behulp van vijf verschillende DNA-vectoren die het Ha-CoV-2 RNA-genoom en de structurele eiwitten (M, N, E en S) van SARS-CoV-2 in HEK293T cellen tot expressie brengen. De S-eiwitvector varieert afhankelijk van de S-variant. Het S-eiwit van de oorspronkelijke Ha-CoV-2 Wuhan-stam (Wild-type, Wt) werd gebruikt als positieve controle en werd samen met het S-eiwit samengesteld uit elk van de andere twee varianten: de Delta (B.1.617.2) of de Omicron (B.1.1.529). Dezelfde M, N, E werden in alle varianten gebruikt. Ha-CoV-2(Wt) en variantdeeltjes werden 48 uur na cotransfectie verzameld en vervolgens gebruikt om HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen te infecteren. Infectiviteit werd gemeten aan de hand van expressie van luciferase 18 uur na infectie. In dit systeem weerspiegelen hogere expressieniveaus van het luciferasesignaal een hogere infectie van cellen door Ha-CoV-2. Het luciferasesignaal werd genormaliseerd met genomische RNA-kopieën door RT-qPCR voor elke variant. Zoals te zien is in figuur 1, genereerde de Ha-CoV-2 Omicron-variant een 4 tot 10 keer hoger signaal dan de oorspronkelijke Ha-CoV-2(Wt), wat wijst op een hogere besmettelijkheid.

Verder werd de capaciteit van 27BV om HaCoV-2(Wt), Delta en Omicron-varianten te neutraliseren gekwantificeerd. 27BV is een monoklonaal antilichaam van konijnen dat is ontwikkeld tegen het RBD-domein van het SARS-COV-2 S1-eiwit. Voor neutralisatietests werden seriële verdunningen van 27BV uitgevoerd in een plaat met 96 putjes, vooraf geïncubeerd met Ha-CoV-2 en vervolgens toegevoegd aan HEK293T(ACE2/TMPRSS2) doelcellen. De resultaten toonden aan dat 27BV neutraliserende werking had tegen alle geteste varianten (Figuur 2). Interessant is dat de ID50 van 27VB voor Omicron ongeveer 10 keer minder krachtig was dan de ID50 voor Ha-CoV-2(WT) en Ha-CoV-2(Delta; Figuur 2). Deze resultaten tonen aan dat het Ha-COV-2-platform kan worden gebruikt als een snelle methode voor het kwantificeren van vaccin-geïnduceerde neutraliserende antilichamen in opkomende varianten.

figure-results-1
Figuur 1. Assemblage en kwantificering van Ha-CoV-2 varianten. (A) Illustratie van de assemblage van de Ha-CoV-2 en variantdeeltjes. De vectoren die het Ha-CoV-2-reportergenoom en structurele eiwitten (M, S, N en E) tot expressie brengen, worden in HEK293T cellen gecotransfecteerd. Deeltjes werden 48 uur na cotransfectie geoogst (de beeldvorming van viriondeeltjes en HEK293T cellen werden gemaakt met Biorender.com). (B) Kwantificering van de besmettelijkheid van Ha-CoV-2-varianten. De relatieve besmettelijkheid van de twee varianten (Delta en Omicron) wordt gekwantificeerd en genormaliseerd met behulp van genomische RNA-kopieën van individuele Ha-CoV-2 (Luc)-varianten. Wildtype is de Ha-COV-2 (Wt), die ter vergelijking als controle wordt gebruikt. Infectie- en luciferase-assays werden 3x uitgevoerd. RU, relatieve eenheid. Het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Kwantificering van 27BV-neutralisatieactiviteit tegen Ha-CoV-2(Luc)-varianten De neutralisatieactiviteit van 27BV werd 18 uur na infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen geanalyseerd. De ID50 werd berekend aan de hand van de relatieve infectiesnelheid (luciferase-activiteit) versus de concentratie van 27BV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2) met Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2(GFP)-deeltjes werden geassembleerd en vervolgens gebruikt om HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen te infecteren. GFP-expressie werd 48 uur na infectie waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie. Het witte veld van geïnfecteerde cellen wordt aan de linkerkant weergegeven en GFP-beeldvorming wordt aan de rechterkant weergegeven. De witte balk staat voor 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.

Aanvullende figuur 1. Grafische samenvatting. De structuur en toepassing van het Ha-CoV-2 pseudovirus. Afbeelding gemaakt met Biorender.com. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1. Eiwit sequenties. Lijst van de sequenties van SARS-CoV-2 S-, M-, N- en E-eiwitten. De S-eiwitsequenties omvatten ook de SARS-CoV-2-varianten Omicron (B.1.1.529) en Delta (B.1.617.2). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Ha-CoV-2-platform biedt een snelle, robuuste en eenvoudige workflow om virale varianten te kwantificeren en antilichamen te neutraliseren. Er zijn echter een paar cruciale stappen die aandacht behoeven. De productie van het Ha-CoV-2-pseudovirus moet worden uitgevoerd met behulp van HEK293T cellen met een hoge levensvatbaarheid. De cotransfectie-efficiëntie kan 24 uur na transfectie worden gecontroleerd met behulp van het GFP-reporter-gen uit het Ha-CoV-2-genoom. Het Ha-CoV-2-genoom kan twee reporters bevatten (GFP en Luc), en GFP kan tot expressie worden gebracht tijdens cotransfectie en na Ha-CoV-2-infectie van doelcellen12. De GFP+-cellen van infectie hebben normaal gesproken een laag percentage (1% tot 5%), maar elke geïnfecteerde cel vertoont sterke GFP-signalen (Figuur 3). Dit lage GFP-percentage kan het gebruik van GFP beperken als een robuuste uitlezing voor het kwantificeren van antilichaamneutralisatie, in vergelijking met de Luc-reporter, die de hele populatie van geïnfecteerde cellen kwantificeert.

Bij het uitvoeren van de neutralisatietest is het essentieel om de pipetpunten tussen puttransfers te verwisselen en ervoor te zorgen dat het antilichaam en het serumvrije medium grondig worden gemengd om nauwkeurige resultaten te produceren. Bovendien moeten cellen bij het uitvoeren van het luciferase-testprotocol gedurende ten minste 3 minuten volledig worden gelyseerd om volledige lysis van cellen en de afgifte van het luciferase-enzym te garanderen. Dit garandeert de nauwkeurigheid van de test. Bovendien, zodra de Firefly-luciferase-testoplossing is toegevoegd aan de optische witwandige platen met 96 putjes, moet de plaat binnen 10 minuten worden geanalyseerd, aangezien de initiële lichtemissie hoog is, maar in de loop van de tijd afneemt naarmate de ATP uitgeput is21.

Naarmate meer SARS-CoV-2-varianten zich blijven ontwikkelen, is er een grotere behoefte aan platforms zoals Ha-CoV-2 om snel te screenen op de besmettelijkheid van varianten en de gevoeligheid van varianten voor door vaccins geïnduceerde neutraliserende antilichamen. Het Ha-CoV-2-platform biedt een hogere snelheid, een hogere signaal-ruisverhouding en een eenvoudig protocol in vergelijking met bestaande op pseudovirussen gebaseerde neutralisatietests 8,9,10,11. Het Ha-CoV-2-platform biedt ook het voordeel dat het kan worden gebruikt in BSL-2-laboratoria en dat er geen BSL-3-faciliteiten nodig zijn. Hierdoor kan SARS-CoV-2 onderzoek worden voortgezet in gemeenschappelijke onderzoeks- en klinische laboratoria. Bovendien levert het Ha-CoV-2 platform snelle resultaten op in vergelijking met andere systemen. Zo wordt bij het onderzoek naar neutraliserende antilichamen tegen infectieus SARS-CoV-2-virus vaak gebruik gemaakt van de plaquereductieneutralisatietest (PRINT)22. Hoewel PRINT betrouwbare resultaten oplevert, is het handmatig tellen van plaquevormende eenheden (PFU's) traag en duurt het 3-5 dagen om resultaten te verkrijgen23,24. Andere pseudotypesystemen, zoals het lentivirus-pseudovirus, hebben 24-72 uur nodig om een detecteerbaar reportersignaalte produceren 12. Ter vergelijking: de Ha-CoV-2-neutralisatietest kan binnen 18 uur resultaten opleveren. De Ha-CoV-2 biedt een handig hulpmiddel voor snelle screening en kwantificering van virale varianten en neutraliserende antilichamen voor pandemische monitoring.

Het monitoren van de besmettelijkheid van SARS-CoV-2 is essentieel naarmate er meer zorgwekkende varianten (VOC's) opduiken. Ha-CoV-2 biedt het voordeel dat de besmettelijkheid van VOC's snel kan worden bepaald. Eerdere studies hebben op kunstmatige intelligentie (AI) gebaseerde modellering gebruikt om de besmettelijkheid van de Omicron-subvariant en de andere SARS-CoV-2-varianten, zoals de Delta-variant25, kwantitatief te analyseren. Deze studies hebben aangetoond dat de Omicron-variant besmettelijker is dan het oorspronkelijke virus en meer kans heeft om te ontsnappen aan neutraliserende antilichamen25. In deze studies, met behulp van Ha-CoV-2, werden vergelijkbare fenotypes waargenomen. Bovendien is de kans dat de Omicron-variant in de antilichaamneutralisatietests tien keer minder snel wordt geneutraliseerd door 27BV dan de Wuhan- en Delta-stammen. Deze resultaten komen ook overeen met de gerapporteerde hogere overdraagbaarheid van de Omicron-variant, die ten minste 15 mutaties heeft op zijn receptorbindingsdomein (RBD), waardoor de virale bindingsaffiniteit met de ACE2-receptor waarschijnlijk wordt versterkt voor een hogere overdraagbaarheid en een grotere immuunontsnapping26.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een patent aangevraagd door de George Mason University en in licentie gegeven aan Virongy Biosciences Inc. voor productontwikkeling. Y.W. is oprichter en lid van de adviesraad van Virongy Biosciences. B. H is momenteel de CEO en Chief Scientific Officer van Virongy Biosciences. De auteurs hebben geen andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het interne onderzoeksfonds van de George Mason University.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing AntibodyVirongy Biosciences27VBI-01
500 mL - US Origin FBSNeuromicsFBS001
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit Genesee ScientificCat# 24-300 
Allegra 6R CentrifugeBeckman Coulter2043-30-1158
DMEM (1x) ThermoFisher 11995-073
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/UnitGenesee Scientfic25-209
GlowMax Discover Microplate readerPromega GM3000 
Ha-CoV-2 E Vector Virongy BiosciencespCoV2_E
Ha-CoV-2 M Vector Virongy BiosciencespCoV2_M
Ha-CoV-2 N Vector Virongy BiosciencespCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S VectorVirongy BiosciencespCoV2_WT S
Hek293T cellsATCCCRL-3214
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assaysGold Bio I-930-1000
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) VWR Cat# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector In house
PEI-based Transfection ReagentVirongy BiosciencesTransfectin
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)Invitrogen10378016
Polyethylenimine, branchedMillipore Sigma408727-100ML
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR SystemThermoFisher A43163
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) CellsVirongy BiosciencesReady-To-Use-Cells
SARS-CoV-2 S  Omicron (B.1.1.529) VectorVirongy BiosciencespCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) VectorVirongy BiosciencespCoV2- B.1.617.2
Syringe Filters, PES, 0.22µmGenesee Scientfic25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermoFisher 4444432
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher 15250061

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1(2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116(2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181(2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389(2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386(2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963(2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199(2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Viraal infectiviteitsassayvirusachtige deeltjesHEK293T cellenluciferase reporterOmicron variantDelta variantpseudovirusneutralisatie

Gerelateerde artikelen