Een hulpmiddel om automatisch stabiele en reproduceerbare celvrije openingen te creëren voor het verbeteren van de betrouwbaarheid van de celwondgenezingstest

Samenvatting

Door de integratie van interactie-ervaringsontwerp en analyse van gebruikersvereisten, introduceren we een innovatieve celschraper die cellulaire wondgenezingstesten verbetert in termen van reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid, bruikbaarheid, cellulaire integriteit en gebruikerservaring.

Samenvatting

De betrouwbaarheid van cellulaire migratiemeting in wondgenezingstesten wordt vaak ondermijnd door de heersende methodologische instabiliteit, d.w.z. een op tips gebaseerde methode. We introduceren een innovatief instrument dat is ontworpen om deze beperkingen aan te pakken. Onze nieuwe celschraper overtreft de huidige aanpak en genereert een consistentere en stabielere celvrije kloof. Herhaalde biologische experimenten tonen aan dat de celvrije opening die door de celschraper wordt geproduceerd, rechtere randen en een uniforme grootte en vorm vertoont in vergelijking met de op punt gebaseerde techniek (p < 0,05). Wat het productontwerp betreft, heeft de celschraper een verfijnd kleurenschema dat geschikt is voor laboratoriumomgevingen, waardoor de monitoring van experimentele resultaten wordt verbeterd en sterilisatie door middel van autoclaveren voor hergebruik mogelijk is. Met name na de behandeling vertoont de celschraper een verwaarloosbaar effect op de levensvatbaarheid en proliferatie van de cellen (respectievelijk 97,31% en 24,41%). Omgekeerd levert de op tips gebaseerde methode een lagere cellevensvatbaarheid (91,37%) en proliferatie (18,79%) op. Dit onderzoek presenteert de celschraper als een nieuw, herbruikbaar apparaat dat in staat is om reproduceerbare celvrije openingen te genereren met behoud van cellulaire levensvatbaarheid, waardoor de betrouwbaarheid van wondgenezingstesten wordt vergroot in vergelijking met bestaande technieken.

Inleiding

Tumoren worden gekenmerkt door verschillende kenmerken zoals selectieve groeivoordelen, metabole herbedrading en immuunmodulatie, die allemaal intrigerend bijdragen aan verbeterde celmigratie, een kritisch kwaadaardig gedrag van tumorcellen. Deze functie heeft een directe invloed op de metastase op afstand van de primaire tumor, waardoor de overleving van patiënten op lange termijn in gevaar komt ^1,2,3. Selectieve groeivoordelen stellen kankercellen in staat om normale cellen te overtreffen, terwijl metabole herbedrading deze snelle proliferatie ondersteunt door energieroutes te veranderen. Tegelijkertijd zorgt immuunmodulatie ervoor dat tumoren de afweer van het lichaam kunnen ontwijken. Studies onderstrepen de ernst van dit probleem en tonen aan dat longmetastase, vaak een gevolg van verbeterde celmigratie, een terminale gebeurtenis is die leidt tot de dood van patiënten met verschillende vormen van^kanker. Borstkanker⁵, baarmoederhalscarcinoom⁴ en osteosarcoom⁶ zijn bijvoorbeeld goed voor respectievelijk 20%, 9% en 30% van dergelijke gevallen. Daarom is het beoordelen van de migratie van tumorcellen een integraal onderdeel geworden van het huidige oncologisch onderzoek, wat de veelzijdige aard van tumorprogressie verder benadrukt.

Celwondgenezingstest is een gebruiksvriendelijke methode voor het meten van in vitro cellulaire migratie, die vaak wordt gebruikt in oncologische onderzoeken⁷. De meeste onderzoekers gebruiken pipetpunten om handmatig celwonden te maken⁸. Hoewel een dergelijke methode snel en gemakkelijk celwonden kan vormen, heeft deze nog steeds veel beperkingen die de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid voor het evalueren van celmigratie beïnvloeden. Ten eerste wordt het gebruik van pipetpunten om handmatig krassen te maken sterk beïnvloed door de werkhoek, kracht en snelheid van de gebruiker, wat van invloed is op de herhaalbaarheid van de methode⁸. Ten tweede hebben celdefecten die door de punt worden gegenereerd meestal gekartelde randen in plaats van rechte randen, omdat pipetpunten plastic producten zijn met een bepaalde elasticiteit⁹. Sommige onderzoeken genereren wonden door geprefabriceerde kweekinzetstukken rechtstreeks in de celkweekplaat te plaatsen om het bereik van celproliferatie te beperken¹⁰. Deze aanpak omzeilt de beperkingen van de op tips gebaseerde methode, zoals gekartelde randen en reproduceerbaarheid. Maar zelfs met biocompatibele materialen heeft de langdurige coëxistentie van de inbedding met de cellen nog steeds invloed op de celgroei¹¹. Bovendien kan de inbedding ook cellulaire epigenetische veranderingen in de marginale zone veroorzaken als gevolg van contactbeperking¹². Ook zijn contactinzetstukken gemaakt van biocompatibele materialen duur en moeilijk te hergebruiken, waardoor de haalbaarheid ervan wordt beperkt¹³. Daarom is een nieuw, reproduceerbaar en praktisch hulpmiddel nodig om in vitro cellulaire migratie gemakkelijk te kwantificeren.

Het primaire doel van deze methode is het introduceren van een innovatief hulpmiddel voor het kwantificeren van in vitro cellulaire migratie in oncologische studies, het aanpakken van de beperkingen van bestaande technieken en het verbeteren van de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid bij het beoordelen van cellulaire migratie.

De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze techniek ligt in het cruciale belang van het evalueren van tumorcelmigratie in de oncologie. Tumoren vertonen onderscheidende kenmerken, waaronder selectieve groeivoordelen, metabole herbedrading en immuunmodulatie, die allemaal bijdragen aan verbeterde celmigratie, een fundamenteel aspect van kankermaligniteit. Deze methode is bedoeld om een betrouwbaardere manier te bieden om cellulaire migratie te bestuderen, wat bijdraagt aan een beter begrip van tumorgedrag.

Deze methode biedt substantiële voordelen ten opzichte van bestaande technieken. Handmatige krastesten kunnen last hebben van operatorafhankelijke interferentie, terwijl kweekinserts de celgroei en genexpressie kunnen beïnvloeden. Deze methode daarentegen biedt verbeterde herhaalbaarheid, nauwkeurigheid en bruikbaarheid, en biedt een kosteneffectieve oplossing voor het meten van in vitro cellulaire migratie in oncologisch onderzoek. Het voorziet in een cruciale behoefte aan een betrouwbaar en toegankelijk hulpmiddel om celmigratie bij verschillende soorten kanker te bestuderen, waardoor het een waardevolle aanvulling is op het veld.

Protocol

Alle deelnemers hebben volledige schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven. Ethische goedkeuring was niet van toepassing, aangezien er geen dierlijke of menselijke weefselmonsters in de huidige studie waren opgenomen.

1. Onderzoek naar de eisen van de gebruikersgemeenschap

1. Lever vragenlijsten aan de biologen/experimentatoren die werken aan celwondgenezingstests. Verzamel de ingevulde vragenlijsten en gebruik ze voor het onderzoek. Voor dit onderzoek zijn van 12 okt 2021 tot en met 3 feb 2022 100 vragenlijsten afgeleverd bij 100 biologen. Het responspercentage was 97%.
2. Vraag respondenten om vragen te beantwoorden als: welke van de experimenten met celkrabben stoorde u het meest? En welk hulpmiddel is gebruikt om het celkrassen uit te voeren? Volg deze vragen met subvragen om de oorzaken op te sporen.
3. Onderzoek de perceptie van de experimentalisten van hulpmiddelen zoals pipetpunten en celkweekinzetstukken in experimenten met celwondgenezing. Begrijp en verzamel hun redenen om het ene hulpmiddel boven het andere te kiezen, met behulp van de Means-end-chain-theorie op basis van ladderingtechnieken in de vragenlijsten sectie^14,15.
   OPMERKING: De laddermethode is onderverdeeld in twee soorten: de zachte laddermethode met diepte-interviews en de harde laddermethode met vragenlijsten of papier-en-potloodquizzen¹⁶. De harde laddermethode was de primaire techniek die in dit onderzoek werd gebruikt. De Means-end-chain-theorie suggereert dat de expliciete kennis van de doelgebruikers oppervlakkig en concreet is, terwijl de stilzwijgende kennis diep en abstract is 17,18,19.

2. Ontwerp en driedimensionale modellering

1. Maak een schets van de inzichten die zijn verzameld uit de vorige vragenlijstenquête en start het ontwerpproces. Gebruik deze voorlopige schets als de fundamentele blauwdruk.
   1. Werk de afmetingen en lay-out van elk onderdeel uit door de functies Dim, DimRadius en DimDiameter toe te passen in de modelleringssoftware.
   2. Voer metingen uit met de schuifmaat met een precisie van 0,02 mm op echte 6-putjes platen om de uiteindelijke afmetingen van de celschraper vast te stellen. Controleer of deze 42,1 mm lang, 42,1 mm breed en 18,5 mm hoog zijn. Besteed aandacht aan de details in de ontwerpfase, met name de producthoogte en de geschiktheid in de put, om een vlottere montage te vergemakkelijken.
2. Bouw een driedimensionaal model en render het.
   1. Begin met 3D-ontwerpen in software door een basismodel te maken. Klik op knoppen zoals ExtrudeCrv voor het uitrekken en Loft voor het vormgeven van het ontwerp. Verfijn het model en klik vervolgens op Fitaalrand voor gladde randen.
      OPMERKING: Andere gebruikte functieknoppen zijn onder meer: Lijnen - Om rechte lijnsegmenten te tekenen, Polylijnen - Om ononderbroken lijnen te maken die zijn samengesteld uit meerdere segmenten, Rechthoeken - Om rechthoekige vormen te tekenen, Cirkels - Om cirkelvormige vormen te tekenen, Arcs - Om boog- of elliptische vormen te tekenen, Punten - Om enkelpuntsmarkeringen te plaatsen, Tekst - Om tekstlabels toe te voegen, Afmetingen - Om gemeten afmetingen aan modellen toe te voegen, Array - Om gekopieerde patronen van objecten te maken, Roteren - Om objecten in de gewenste hoeken te roteren, Verplaatsen - Om objecten naar nieuwe locaties te verplaatsen, Schaal - Om objecten groter of kleiner te maken, Bijsnijden/Verlengen - Om objecten bij te snijden of uit te breiden om aan andere geometrie te voldoen, Booleaanse Unie/Verschil/Snijpunt - Om objecten te combineren, af te trekken of het snijpunt van objecten te vinden, Lagen - Om objecten op verschillende lagen te ordenen, Render - Om gerenderde weergaven met materialen en belichting te genereren en Exporteren - Om modelgeometrie te exporteren naar andere bestandsindelingen.
   2. Importeer het model in een 3D-renderingsoftware. Breng materialen aan zoals plastic, spons en staal en pas vervolgens de belichting aan voor een realistische weergave.
      OPMERKING: Een algemene lijst met functieknoppen omvat: Drag & Drop - Om materialen rechtstreeks op onderdelen of modellen toe te passen door een materiaal uit de bibliotheek te slepen en neer te zetten op het gewenste onderdeel in de real-time weergave, Klik met de rechtermuisknop - Wanneer u met de rechtermuisknop op een materiaal in de bibliotheek klikt, ziet u meestal opties om: Toepassen op selectie - Pas het materiaal toe op een geselecteerd onderdeel in de real-time weergave. Materiaal bewerken - Pas de materiaaleigenschappen aan. Materiaaleigenschappen (na het selecteren van een materiaal) - Om toegang te krijgen tot specifieke eigenschappen van het materiaal en deze te wijzigen, zoals kleur, ruwheid, brekingsindex en andere kenmerken. Zoekbalk - Om snel een materiaal in de bibliotheek te vinden door de naam of bijbehorende trefwoorden te typen. Categorieën/mappen - Om te navigeren door verschillende categorieën of mappen met materialen zoals metalen, kunststoffen, glas, enz. Toevoegen aan favorieten - Om bepaalde materialen als favorieten te markeren voor gemakkelijke toegang tijdens toekomstige sessies. Sneltoetsen - Sommige bewerkingen zijn toegankelijk via sneltoetsen. M is bijvoorbeeld meestal de sneltoets om snel de materiaaleigenschappen van een geselecteerd onderdeel op te roepen.
   3. Verbeter ten slotte het contrast (+56) en de verzadiging (levendigheid +19, verzadiging +7) van de afbeelding in foto- en ontwerpsoftware en voeg achtergrondelementen toe (tekstinformatie en kleur van witte naar lichtgrijze gradiëntachtergrond) voor context om een hoogwaardige, realistische productweergave te garanderen.
      1. Gebruik Afbeelding > Aanpassingen, Helderheid/Contrast om het contrast van een afbeelding aan te passen. Gebruik Afbeelding > Tint/Verzadiging om het verzadigingsniveau van de afbeelding te wijzigen. Gebruik het tekstgereedschap (T-pictogram) om tekstinformatie aan de afbeelding toe te voegen.
         OPMERKING: Een algemene lijst met functieknoppen omvat Ellipse Tool (U) - Om stippen/cirkels te tekenen. Stel het gereedschap in om een vorm te tekenen, kies de gewenste vulkleur en klik en sleep vervolgens (houd de Shift-toets ingedrukt om een perfecte cirkel te behouden) om een stip te maken. Lijngereedschap (U) - Om rechte lijnen op de afbeelding te tekenen. Selecteer het gereedschap, stel de gewenste lijndikte in en klik en sleep vervolgens om een lijn te tekenen. Penseel (B) - Een alternatieve manier om stippen en lijnen te tekenen. Selecteer de grootte en vorm van het penseel en klik (voor stippen) of klik en sleep (voor lijnen).
3. Na het voltooien van het driedimensionale model, gaat u verder met het produceren van de celschraper via de maal- en montagemethode 20,21,22.

3. Productie

1. Gebruik de kleur, materialen, afwerking (CMF) theorie in de huidige studie om de prototypes van de celschraper te ontwerpen. De CMF-theorie dient als ontwerpmethodologie in wetenschappelijk onderzoek. Het verbetert de bruikbaarheid van het product, geeft vorm aan de perceptie van de gebruiker en stuurt de selectie van materialen 23,24,25.
   1. Selecteer de kleuren die in de celschraper moeten worden gebruikt uit het standaard kleurensysteem, waaronder Zwart 6 C, Cool Gray 6 C en 11-0601TPG^26,27.
   2. Om de celschraper te bouwen die voldoet aan de laboratoriumnormen, kiest u geschikte materialen, waaronder polypropyleen (PP), spons en koolstofstaal. Voor de fabricage van fysieke prototypes begint u met het gebruik van een 3D-printer om het structurele raamwerk te produceren. Gebruik vervolgens connectoren of kleefmiddelen om de montage van de schraper te voltooien.
      NOTITIE: Om het fysieke product van de celschraper voor te bereiden, maalt en monteert u de benodigde materialen. Veiligheidsprotocollen moeten gedurende het hele proces worden gevolgd om een veilig en effectief eindproduct te garanderen.
   3. Ga verder met het afwerkingsproces, dat kan bestaan uit snijden, slijpen, polijsten, stempelen of andere technieken. Begin met het schuren van het model met schuurpapier met een gemiddelde korrel en korrel 120 om eventuele ruwe randen te verwijderen.
   4. Volg dit met een schuurpapier met korrel 220 om een glad oppervlak te krijgen.
   5. Naschuren om de oppervlakken glad te strijken en ervoor te zorgen dat de plug-in of ingebouwde connectoren correct op elkaar zijn afgestemd.
   6. Verbind dia I en II stevig met behulp van de connectoren (vaste staven) om een robuuste en duurzame montage van de celschraper te garanderen. Bereik de uiteindelijke vaste vorm van de celschraper door een combinatie van mechanische bevestiging en lijmverbinding. Gebruik bevestigingsmiddelen, met name een pen-en-gatstructuur, om onderdelen met mechanische kracht aan elkaar te bevestigen. Om de sterkte van de assemblage te verbeteren, brengt u bovendien lijm (lijm) aan om de componenten verder te hechten.
   7. Autoclaaf de schraper bij 121,3 °C gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat hij zijn oorspronkelijke vorm en fysische eigenschappen behoudt.

4. Celcultuur

1. Kweek HOS-cellen in minimaal essentieel medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Kweek ze bij 37 °C met 5% CO₂ .
2. Verander het kweekmedium elke 2 dagen.
3. Wanneer de celgroei de confluentie van 80% overschrijdt, voeg dan 1 ml trypsine met 0,25% EDTA toe en verteer gedurende 60 seconden. Centrifugeer de cellen daarna 5 minuten bij 300 x g voor de subcultuur. Verwijder het supernatans en voeg kweekmedium toe om een uiteindelijke concentratie van 5 x 10⁴ cellen per putje te krijgen. Gebruik een geautomatiseerde cellenteller voor het tellen van cellen.

5. Beoordeling van het potentieel voor celbeschadiging van de celschraper en op tips gebaseerde methode

1. Bereid alle materialen voor op verwonding en steriliseer ze met ultraviolette straling door ze 30 minuten bloot te stellen.
2. Wikkel na sterilisatie 100% confluente HOS-cellen in platen met 6 putjes in een concentratie van 5 x 10⁴ cellen per putje met behulp van de celschrapermethode of de op tips gebaseerde methode.
   1. Gebruik voor de op punt gebaseerde methode een punt van 100 μL en sleep deze met 1 streek in horizontale richting en de andere in verticale richting over de cel met medium.
   2. Voor de celschrapermethode plaatst u het prototype van de schraper in een van de putjes en drukt u met behulp van het pincet één keer voorzichtig aan. De cellen zijn gewond. Voer elk verwondingsexperiment in drievoud uit.
3. Analyseer alle celwonden met behulp van een digitaal microscoopsysteem en beeldvormingssoftware.

6. Meten van de levensvatbaarheid en celproliferatie van cellen

1. Voer alle cellevensvatbaarheidstests uit volgens het protocol in de CCK-8-kit.
2. Incubeer de cellen met CCK-8-oplossing gedurende 2 uur bij 37 °C en meet vervolgens hun absorptie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer om de levensvatbaarheid van de cellen te kwantificeren.
3. Ontwerp de 5-ethynyl-20-deoxyuridine (EdU) incorporatietest om DNA-duplicatie nauwkeurig te kwantificeren en de celproliferatieverhouding direct te kwantificeren. Bepaal de invloed van verschillende methoden om celwonden te genereren op celproliferatie met behulp van de EdU-test, volgens het protocol beschreven in eerdere publicatie²⁸.
4. Kleur de cellen en breng ze in beeld met een digitaal microscoopsysteem. Zorg ervoor dat elk experiment in drievoud wordt uitgevoerd.

Resultaten

Het ontleden van de vraag van gebruikers naar gereedschappen om celwonden te genereren
De huidige experimentele methode om celwonden te genereren vereist verdere verbetering om veel problemen aan te pakken die de biologische reproduceerbaarheid, robuustheid, economische consumptie en gebruikerservaring van celwondgenezingstest in gevaar brengen. We gebruikten de harde laddering-methode om de behoeften van gebruikers die betrokken zijn bij biologische experimenten te analyseren via vragenlijsten²⁹ (Figuur 1A). De informatie in de vragenlijst, zoals namen, werd geanonimiseerd om hun privacy te beschermen. De details van de vragenlijst zijn weergegeven in tabel 1. Gedurende 6 weken van onderzoek voor 100 personen werden 97 volledig ingevulde vragenlijsten ontvangen, 3 verdachte en ongeldige vragenlijsten werden uitgesloten; De respons was 97,00%.

De resultaten tonen aan dat de meest verontrustende problemen bij de celwondgenezingstest gekartelde rand (niet recht) en onstabiele breedte of wondgebieden waren, goed voor respectievelijk 55,67% en 29,90%. Deze waren significant hoger dan die van een lagere celgroeisnelheid, celcontaminatie en andere opties met respectievelijk 3,09%, 5,15% en 6,19% (p < 0,001, figuur 1B). Wat betreft de selectie van hulpmiddelen om wonden te maken, kwam het gebruik van pipetpunten veel vaker voor dan voor celkweekinserts (Figuur 1C). Het werd voornamelijk toegeschreven aan het feit dat celkweekinserts vrij duur en niet-herbruikbaar zijn (Figuur 1D), terwijl pipetpunten goedkoop zijn, experimentele reproduceerbaarheid (6,59%) en levensvatbaarheid van cellen vertonen (20,88%, Figuur 1E). Belangrijk is dat tot 69,23% van de gebruikers betoogde dat de prijs van celkweekinserts boven hun budget lag (figuur 1D). Daarentegen kozen slechts 6 proefpersonen voor celkweekinserts, waarbij slechts 16,67% de prijs acceptabel vond (figuur 1F). Ten slotte, wat betreft het innovatieve hulpmiddel om celwonden te genereren, was 86,60% optimistisch, terwijl slechts minder gebruikers niet bereid waren (4,12%, figuur 1G).

Vervolgens werden productkenmerken die gebruikers dringend nodig hadden ontleed 30,31,32. Deze kenmerken omvatten rechte wonden, stabiele breedte en oppervlakte van wonden, hoge reproduceerbaarheid en acceptabele prijs. Dienovereenkomstig werden latere ontwerpactiviteiten uitgevoerd.

Beslissing om elementen en materialen te ontwerpen die worden gebruikt bij het ontwikkelen van een celschraper
Uit de bovenstaande gegevens blijkt dat laboratoriumbenodigdheden die in routinematig biologisch onderzoek worden gebruikt, strikt steriel moeten zijn om celbesmetting te voorkomen³³. Daarom moet de voorgestelde celschraper steriel zijn. Hoewel wegwerpgereedschap kan worden gesteriliseerd door ethyleenoxide, zullen de experimentele kosten onvermijdelijk^met 34,35,36 stijgen. Daarom stellen we voor om in plaats van wegwerpmaterialen de celschraper te ontwerpen met een herbruikbaar materiaal met een grote tolerantie voor hogedrukstoomsterilisatie (121,3 °C), om de kosten te verlagen en de flexibiliteit te vergroten wanneer deze in verschillende gevallen wordt toegepast³⁷. Om aan deze eisen te voldoen, moet het materiaal dat wordt gebruikt om de celschraper te construeren bepaalde fysische en chemische kenmerken hebben, waaronder weerstand tegen hitte, hoge druk en waterdampcorrosie.

Voor het beoogde gebruik van de celschraper moet deze niet alleen voldoen aan de basisfuncties zoals het maken van de randrechte wonden, maar ook een aantrekkelijk ontwerp en kleur hebben. Op het gebied van modellering, rekening houdend met de doel- en toepassingsgebieden, moet de algemene stijl geschikt zijn voor de laboratoria. Het uiterlijk mag niet te opzichtig zijn om het personeel te belemmeren de experimentele voortgang te observeren. Bovendien moet de grootte geschikt zijn voor platen met zes putjes en moet het oppervlak een uitsteeksel hebben zodat het pincet het stabiel kan oppakken.

CMF in design is een cruciaal aspect van productontwerp dat van invloed is op esthetiek en gebruikerservaring. Kleurkeuze heeft invloed op de emotionele reactie, materiaalkeuze heeft invloed op functionaliteit en duurzaamheid, en afwerking bepaalt het tactiele gevoel en de visuele aantrekkingskracht. CMF-ontwerpers harmoniseren deze elementen, rekening houdend met markttrends en merkidentiteit, om producten te creëren die resoneren met gebruikers.

Volgens de CMF-theorie werden drie kritische factoren, waaronder kleur, materiaal en afwerkingsproces, in overweging genomen om hun impact op de functie en het visuele effect te^bepalen24. De kleurselectie werd eerst uitgevoerd. In deze context verwijst kleur naar de intrinsieke kleur, de inherente kleur van een object of stof onder standaard lichtomstandigheden, zonder de invloed van externe lichtbronnen of reflecties. Aangezien de zeswells plaat is gemaakt van PP met een transparant oppervlak, is er gekozen voor donkergrijs als intrinsieke kleur. Deze keuze is gemaakt voor eenvoudige identificatie en bediening, aangezien donkergrijs optimaal contrast en zichtbaarheid biedt wanneer het over andere kleuren wordt gelegd. Bovendien veroorzaakt donkergrijs minder snel kleurvervorming in combinatie met andere kleuren, wat ook cruciaal is voor observatie. Essentiële functionele componenten werden verder onderscheiden door zwart (Figuur 2A).

Het commerciële kleurafstemmingssysteem werd geselecteerd als de standaard voor kleurselectie vanwege de wijdverbreide acceptatie en het gebruik ervan in verschillende industrieën. Vertrouwend op het vermogen van het bedrijf om consistente kleuren op verschillende media te reproduceren, werd het gekozen voor het onderzoek omdat dit cruciaal is om een nauwkeurige en consistente kleurweergave te garanderen.

De materiaalselectie is uitgevoerd op basis van de eerder genoemde resultaten van vragenlijsten. De schaal en de onderdelen van de schraper zijn gemaakt van een hittebestendige kunststof, polypropyleen (PP), om te voldoen aan de eis van sterilisatie via autoclaveren, zoals bijvoorbeeld weergegeven in figuur 2B. Koolstofstaal is geschikt voor veren, omdat het stabiel is tegen corrosiebestendige laboratoriumomgevingen bij hoge en lage temperaturen. Sponzen met een hoge dichtheid werden gebruikt voor buffering en aan het einde van de dia geplaatst.

Tot slot is het afwerkingsproces ontwikkeld. Aangezien de celschraper vaak wordt gebruikt en gemakkelijk besmet raakt en de oppervlaktekwaliteit van invloed is op de sterilisatie, heeft een glad en glanzend oppervlak de voorkeur voor de celschraper, omdat het de gebruiker helpt de bron van besmetting snel te identificeren en ermee om te gaan, wat een gevoel van reinheid geeft. De punten zijn gedeeltelijk geschuurd om schade aan de bodem van de kweekschaal te voorkomen, wat de kweekomgeving kan aantasten en kan leiden tot beperking van de celproliferatie³⁸.

Ontwerp en prototype van de celschraper
Op basis van de hierboven genoemde resultaten zijn drie prototypes van een celschraper ontworpen (figuur 3A). Studies tonen aan dat de meest gebruikte celwonden in celkweekplaten kruisvormig^{waren 39}, wat heel anders is dan het prototype I dat rechthoekige wonden gebruikte; dus prototype I was kwijtgescholden (Figuur 3A). Hoewel prototype II en III beide kruisvormige celvrije gebieden konden creëren, was de glijrail van prototype II moeilijk te bevestigen in celkweekschijven en was de infrastructuur nogal gecompliceerd (Figuur 3A). Na voorzichtige discussies werd prototype III onderscheiden als het uiteindelijke model voor de productie van een celschraper.

Met name gezien het feit dat de vorm van de uiteinden rechtstreeks van invloed kan zijn op het celvrije gebied in termen van randen en afmetingen, werden drie schetsen ontworpen voor selectie. De schets Ik had een scherpe bovenkant, die hele rechte randen kon geven; de kweekinterface die celproliferatie mogelijk maakt, kan echter worden aangetast als de uiteinden te scherp zijn (figuur 3B). Schets II bood een vierkante bovenkant, die aantasting van de celkweekplaten zou kunnen voorkomen. Omdat het contactoppervlak tussen de punt en de onderkant van de kweekplaat echter vierkant is, is het onstabiel bij gebruik (Figuur 3B). Schets III voorzag in een stompe afgeronde punt, waardoor de bovenstaande problemen effectief werden vermeden (Figuur 3C). Daarom werd het geselecteerd als het definitieve ontwerp.

Het ontwerp is op drie aspecten geoptimaliseerd: respectievelijk de bevestigingsmethode van de fixeermachine, de ingebouwde kussenspons en het gemak van vastpakken. Ten eerste omvatten de verwachte productbevestigingsmethoden knik⁴⁰, pengat⁴¹ en zwenken⁴². Rekening houdend met de werkelijke productiekosten en de bruikbaarheid, werd een klauw ontworpen onder de kruisvormige fixeermachine om het klemmen van de rand van de put te vergemakkelijken. Bovendien zagen we in de celkrasgenezingstest dat de uiteinden terugkaatsten nadat ze de muur aan het einde hadden geraakt vanwege de vaste lengte en hardheid van de dia's, wat de krastoestand beïnvloedde. Daarom hebben we een dempende spons aan het einde van de glijbaan toegevoegd om de beweging van de tips te stabiliseren. (Figuur 3A,C). Ten slotte werd een oppervlakte-uitsparing aan het uitsteeksel toegevoegd om het vastgrijpen met een pincet te vergemakkelijken.

Met behulp van de 3D-ontwerpsoftware werd verder een driedimensionaal model geconstrueerd. De weergave ervan wordt weergegeven in figuur 4A. De explosieve plot werkt de gedetailleerde interne structuren van de celschraper uit, die de noodzakelijke kenmerken vertoont die hierboven zijn besproken (Figuur 4B). Om het doel van soepel glijden van de uiteinden en rechte randen te bereiken, wordt bovendien de interne mechanische krachtoverbrengingsstructuur aangenomen. De hele functionele eenheid van de celschraper bestaat uit het besturingsgedeelte. In het echte werk is de koppelingshendom in de celschraper verbonden met de bovenste knop en beweegt het uiteinde naar beneden nadat er druk is uitgeoefend om het uiteinde te laten knikken. De veer in de slede wordt losgelaten om de punten te duwen om te bewegen. Ten slotte stopt het bij de spons met een smalle spleet om het schrapen af te maken en schakelt het vervolgens om om te resetten wanneer het opnieuw wordt gebruikt (Figuur 5A). Bovendien zijn het leergemak en de gemakkelijke bediening de criteria voor een bioloog om de productkwaliteit te meten. Daarom volgde de lay-out van het oppervlak voor het uiterlijk van het product het principe van symmetrie en netheid^43,44, waarbij verschillende componenten werden onderscheiden en benadrukt door middel van verschillende tinten zwarte, witte en grijze kleuren (Figuur 5A).

Celschraper is in de praktijk superieur aan de tips krabmethode
Het fysische product van de celschraper werd bereid met behulp van de maal- en assemblagemethode (figuur 5B). Zoals verwacht integreerde de celschraper uitstekend met de plaat met zes putjes, waarbij de bovenste kruisvormige houder nauw aansluit op de rand van de plaat, wat zorgt voor een sterke fixatie (Figuur 5C). Bovendien pasten de tips precies op de bodem van de plaat met zes putjes, wat het soepel genereren van celvrije gebieden vergemakkelijkte. Ten slotte werd de celschraper geautoclaveerd om te testen of deze herbruikbaar zou kunnen zijn. Zoals de resultaten in figuur 5D laten zien, behield de huidige celschraper de oorspronkelijke vorm en fysieke prestaties, zelfs na autoclaveren onder 121,3 °C gedurende 30 minuten.

De celschraper presteerde beter dan de bestaande methode voor het maken van celwonden in de benchmarktest. Na herhaalde tests vertoonde de celkrabber een hoge stabiliteit en reproduceerbaarheid in de voorbereiding van de wond, vertoonde een lage fluctuatie in het gebied van elke wond en bijna rechte randen, met een standaarddeviatie van het celvrije gebied van 483,73 en een afwijking van de rechte rand van 5041,33 ± 2420,00. Daarentegen vertoonde het gebied van elke wond dat door de pipetpunten werd voorbereid een hogere fluctuatie, met een standaarddeviatie van het celvrije gebied van 3905,80 en een afwijking van de rechte rand van 19562,33 ± 1068,39 (Figuur 6A-C).

Ten slotte werd het effect op de levensvatbaarheid van cellen na celwonden geëvalueerd (figuur 6D). De resultaten toonden aan dat 12 uur na voltooiing van de celwond de levensvatbaarheid van de cel iets maar significant hoger was in de groep met de celschraper dan in de groep met tips. EdU-test werd uitgevoerd om deze resultaten verder te bevestigen en de impact van verschillende methoden voor de voorbereiding van celwonden op celproliferatie, d.w.z. DNA-replicatie, te verduidelijken. De resultaten van de EdU-test toonden aan dat het percentage prolifererende cellen in de cellenschrapergroep (24,41% ± 0,48) na 12 uur significant hoger was dan dat in de tips-methode (18,79% ± 1,46) (Figuur 6E,F).

Deze gegevens bevestigden sterk dat de huidige celwondgenerator beter presteerde dan de huidige methode om celwonden te creëren in termen van stabiliteit en biologische reproduceerbaarheid. Het had een lage impact op de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen. Al deze opmerkelijke voordelen van de celwondgenerator bevestigden het potentieel ervan om de huidige celwondtesten te verbeteren door de betrouwbaarheid en herhaalbaarheid van de resulterende gegevens te waarborgen.

Figuur 1: Analyse van de gebruikersvraag. (A) Sankey plot geeft de workflow weer van op vragenlijsten gebaseerd onderzoek voor experimentatoren. (B) tot en met (G) tonen de resultaten van vragenlijsten, met inbegrip van de vragen 1 tot en met 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Productontwerp met gebruikte kleuren en materialen. (A) Selectie van kleuren. (B) Autoclaaf gebruikt in biologische experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Productontwerp van gedetailleerde structuren. (A) Drie prototypes van een celschraper. (B) Drie schetsen van het ontwerp van de tip. (C) Tekening in drie aanzichten van geselecteerd prototype III, met het algemene ontwerp en de fysische en ruimtelijke parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Weergave van het gerenderde driedimensionale model en interne structuren. (A) Render van het driedimensionale model. (B) Ontplofbaar plot dat de inwendige structuren van de voorgestelde celschraper aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Werkingsmechanismen van de celschraper. (A) De schetsen laten zien hoe de celschraper werkt. (B) Fysisch product van de celschraper. (C) De celschraper past in een plaat met 6 putjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Experimentele validatie van de celschraper. (A) Celwonden gegenereerd met verschillende methoden en hun gegroepeerde vergelijkingsresultaten werden weergegeven in (B) en (C), de schaalbalk is 100 μm. (D) Resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen. (E) en (F) Edu-testresultaten, de schaalbalk is 50 μm. Voor de statistische evaluatie werd de t-toets uitgevoerd voor gegroepeerde vergelijking en werd de oorspronkelijke p-waarde aangepast door de Holm-Bonferroni-test om vals-positieve resultaten te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

I) Welke van de volgende kwesties is voor u het meest verontrustend in het experiment met het krabben van cellen?

A) Geen rechte randen

B) Onstabiele breedte

C) Langzame proliferatie

D) Celcontaminatie

E) andere

II) Welke gereedschappen gebruik je voor het genereren van celwonden?

A) Pipetpunten (ga naar vraag III)

B) Celcultuur inserts (ga naar vraag IV-V)

III) Waarom kiest u niet voor celkweekinserts?

A) Levensvatbaarheid van de cellen

B) Niet herbruikbaar

C) Kosten

D) Overig

IV) Waarom heeft u gekozen voor celkweekinserts?

A) Kosten

b) Herhaalbaarheid

C) andere

V) Wat zijn volgens u de ernstigste problemen met celkweekinserts?

A) Status van de cel

B) Niet herbruikbaar

c) Duur

D) Overig

e) Tevreden

VI) Als er een goedkoop, herbruikbaar (autoclaveerbaar), zeer reproduceerbaar krabgereedschap was, hoe bereid zou u dan zijn om het te kopen en te gebruiken?

A) Zeer bereidwillig

b) Bereid

C) Ik weet het niet zeker

D) Onwillig

Tabel 1: De vragenlijst die in dit onderzoek wordt gebruikt, bestaat uit zes vragen die bedoeld zijn om situaties te begrijpen die biologen tegenkomen tijdens celwondgenezingstests.

Discussie

De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een automatisch gemechaniseerd hulpmiddel voor het genezen van celwonden. Voor zover wij weten, is het de eerste poging om een gemechaniseerde aangedreven structuur toe te passen om automatisch celwonden te maken op een manier met één klik. Hiermee willen we de tekortkomingen van de traditionele, op tips gebaseerde methode aanpakken, zoals een lage reproduceerbaarheid en een onstabiele krastoestand. Profiterend van de positieve resultaten en de bemoedigende feedback van de gebruikersgemeenschap, wordt verwacht dat de celschraper de onderzoekers een efficiënt en stabiel alternatief zal bieden voor het maken van celwonden, waardoor het betrouwbaarheidsniveau van de experimentele analyseresultaten aanzienlijk wordt verbeterd.

Voor het gebruik van de huidige celschraper moet de gebruiker 1) cellen voorbereiden in afwachting van het creëren van een celvrije kloof, vergelijkbaar met traditionele methoden zoals de op tips gebaseerde methode, d.w.z. cellen met een bepaalde dichtheid op een plaat met zes putjes zaaien; 2) wacht tot de cellulaire convergentiesnelheid > 90% bereikt; 3) plaats de steriele celschraper in een putje van de plaat, klik op de knop zoals geïllustreerd in afbeelding 5, en de celvrije opening wordt automatisch gecreëerd binnen 1-2 s.

De celwondgenezingstest is op grote schaal gebruikt om de celmigratiecapaciteit te meten. Meestal gebruiken onderzoekers pipetpunten om celwonden te maken. Tariq et al. gebruikten bijvoorbeeld een pipetpunt om celwonden te maken om de celmigratiecapaciteit te beoordelen⁴⁵; niet toevallig gebruikten Rahimi et al. een pipetpunt in een test om de migratiecapaciteit van PC3-cellen te observeren⁴⁶; in de muizen mesenchymale celmigratietest gebruikten Cormier et al. ook een pipetpistool⁴⁷; om het effect van arseen op de migratie van huidcellen aan te tonen, gebruikten Pinto et al. onder andere een pipetpunt voor verticaal schrapen⁴⁸.

Zoals eerder vermeld, heeft het gebruik van een punt om cellulaire wonden te maken echter verschillende problemen, zoals een variabel celvrij gebied, gekartelde randen en afhankelijkheid van de kracht en krashoek van de operator, wat resulteert in een lage reproduceerbaarheid⁴⁹. De huidige resultaten van vragenlijsten toonden ook aan dat de op tips gebaseerde methode meer duidelijke voordelen heeft ten opzichte van celkweekinserts, met name in termen van prijs, celoverlevingspercentage en herbruikbaarheid van gereedschappen. Als alternatief zijn celinzetstukken te duur en moeilijk opnieuw te gebruiken, terwijl beide gereedschappen defecten vertonen. Daarom is de gebruikersgemeenschap over het algemeen optimistisch en bereid om innovatieve tools uit te proberen. Deze studie ontwierp en ontwikkelde een nieuw hulpmiddel voor de voorbereiding van celvrije gebieden om de vorming van celwonden te vergemakkelijken en te stabiliseren.

De belangrijkste bijdrage van de huidige studie ligt in de ontwikkeling en experimentele validatie van een celschraper. Vergeleken met de vorige studies omvatten de verbeteringen van de huidige celschraper de volgende drie hoofdpunten. 1) stabiele en gemakkelijke fabricage van celwonden. Deze studie toonde aan dat, in vergelijking met de traditionele methode op basis van tips, de celwonden die door de huidige celschraper werden vervaardigd, rechte randen hadden en soortgelijke wonden konden creëren in herhaalde experimenten, wat de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de experimenten met celwondgenezing aanzienlijk verbeterde. 2) De huidige celschraper had minder effect op de celstatus. Het had geen invloed op de levensvatbaarheid en proliferatie van de cellen (DNA-amplificatie), die significant beter was dan de op tips gebaseerde methode. Daarom wordt verwacht dat deze celschraper de invloed van externe factoren op de celwondgenezingstest in routine-experimenten verder zal verminderen. 3) Deze celschraper is in goede overeenstemming met de eisen van de gebruikersgemeenschap. Uit de resultaten van de vorige enquête bleek dat de eisen van de gebruikers aan het nieuwe gereedschap voor celwonden voornamelijk een uniforme slagbreedte, een hoge reproduceerbaarheid, een eenvoudige bedieningsprocedure en een gematigde prijs omvatten, die zijn bereikt in de huidige celschraper. Bovendien is de celschraper ontworpen in neutrale kleuren om het eenvoudige en praktische ontwerpconcept van dit product over te brengen. Tegelijkertijd benadrukt het sterke zwart-witcontrast de functionele gebieden effectief. De algehele stijl is een kruisvorm gevormd door de afgeronde articulatie van het gebogen oppervlak, verwijzend naar de conventionele wondvorm en de rol van het product suggereren. De moeilijkheidsgraad van de bediening wordt verminderd door de bediening en de handmatige resetfunctie te vereenvoudigen. Samenvattend wijzen de resultaten op een veelbelovend alternatief hulpmiddel voor onderzoekers om celkrassen met één klik op een geautomatiseerde en robuuste manier voor te bereiden, waardoor de reproduceerbaarheid van wetenschappelijke resultaten wordt verbeterd.

De beperkingen van deze studie moeten worden erkend. De steekproefomvang van de geïnterviewden op de vragenlijst beperkt de generaliseerbaarheid van dit onderzoek; Daarom zullen we in een vervolgstudie de steekproefomvang verder uitbreiden om de celschraper te verbeteren. Ten tweede moet de celkrabber worden opgenomen in een goed geplande studie met een grotere populatie gebruikers, zodat de prestaties van deze celschraper uitgebreider kunnen worden geëvalueerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CCK-8 Kit	Beyotime Company, China	C0037
digitaal microscoopsysteem	Olympus	IX81
foetaal bovien serum	Gibco, USA	16000044
HOS	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	versie 6.0
KeyShot	Luxion	versie 11.0	3D rendersoftware
microplatelezer	BioTek, Duitsland	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, USA	11095080
Pantone-matchsysteem	Pantone		commercieel kleurmatchsysteem
penicilline-streptomycine	Beyotime Company, China	ST488
Photoshop	Adobe		foto- en ontwerpsoftware
Rhinoceros 3D	Robert McNeel & Associates	versie 7.0	3D ontwerpsoftware
TC20 geautomatiseerde celteller	Bio-Rad	TC20
Trypsine	Cytiva HyClone, Verenigde Staten	SH30042.01