Method Article

Een te vroeg geboren rattenmodel voor pijnstudies

DOI:

10.3791/65800

⸱

February 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neuroscience, Neuromodulation and Study of Pain (LANNED), UNIFAL-MG, 2SINPAIN Faculty

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een beknopt protocol voor het maken van een te vroeg geboren rattenmodel, dat onderzoek naar vroege postnatale pijnbestrijding vergemakkelijkt. De methode omvat het uitvoeren van een keizersnede drie dagen voor de verwachte geboorte, het extraheren van premature rattenpups via hysterectomie en het integreren ervan met de biologische nakomelingen van een draagmoeder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek gaat in op de gevolgen van consistente speldenprikstimulatie op te vroeg geboren nakomelingen om de langetermijnimplicaties voor pijngevoeligheid vast te stellen. Het primaire doel van dit protocol was om de impact van neonatale speldenprikstimuli op de pijngrens in de latere levensfasen te onderzoeken met behulp van een te vroeg geboren rattenmodel. Door dit model op te zetten, willen we het onderzoek naar het begrijpen en beheersen van vroege postnatale pijn in verband met prematuriteit bevorderen. De bevindingen van deze studie geven aan dat, hoewel de basisdrempels voor mechanische stimuli onaangetast bleven, er een opmerkelijke toename was van mechanische overgevoeligheid na volledige injectie met Freund's adjuvans (CFA) bij volwassen ratten. Interessant is dat vrouwelijke ratten in vergelijking met mannelijke ratten een verhoogde inflammatoire overgevoeligheid vertoonden. Met name het gedrag van de moeder, het gewicht van de nesten en het groeitraject van de nakomelingen bleven onveranderd door de stimulatie. De manifestatie van veranderde nociceptieve responsen in de volwassenheid na neonatale pijnlijke stimuli kan een indicatie zijn van veranderingen in sensorische verwerking en de werking van glucocorticoïde receptoren. Er is echter verder onderzoek nodig om de onderliggende mechanismen te begrijpen en om interventies te ontwikkelen voor de gevolgen van prematuriteit en neonatale pijn bij volwassenen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de neonatale periode ondergaan nociceptieve routes een aanzienlijke structurele en functionele rijping, en de aanwezigheid van weefselbeschadiging en bijbehorende pijn heeft ingrijpende gevolgen voor de ontwikkeling van somatosensorische verwerking1.

Het gebruik van diermodellen maakt de gecontroleerde experimentele manipulatie van niet-menselijke dieren mogelijk, waardoor een beter begrip van de gevolgen van neonatale pijn op gedrag later in het leven mogelijk wordt, terwijl mogelijke verstorende variabelen worden verminderd 2,3. Een vaak waargenomen uitkomst is de invloed van neonatale pijn op verhoogde pijngevoeligheid op volwassen leeftijd 2,4,5. Op de neonatale intensive care (NICU) is neonatale pijn een veel voorkomende bron van stress, waarbij te vroeg geboren baby's doorgaans gemiddeld 10 invasieve procedures per dag ondergaan6. Premature pasgeborenen in de NICU krijgen te maken met een reeks stressfactoren, waaronder pijn, beperkt contact van de moeder, auditieve prikkels en overmatige verlichting 7,8,9.

Het gebruik van diermodellen is essentieel voor het vergroten van ons begrip van de onderliggende mechanismen die bij deze processen betrokken zijn en het faciliteren van nieuwe ontwikkelingen op dit gebied. Met name het gebruik van te vroeg geboren diermodellen in studies kan een grote bijdrage leveren aan het vergroten van de kennis over te vroeg geboren baby's en waardevolle inzichten verschaffen in pijnbestrijdingsinterventies voor te vroeg geboren baby's10.

Momenteel is er een beperkt aantal knaagdiermodellen die specifiek gericht zijn op prematuriteit, waarbij de meeste van deze onderzoeken voornamelijk de effecten van prematuriteit op de hersenenonderzoeken 11, longontwikkeling12, necrotiserende enterocolitis13 of immuunvoedingsstudies14. Geen van deze modellen onderzoekt echter de rijping van het pijnsysteem, dat bijzonder kwetsbaar is in gevallen van prematuriteit.

Vroeggeboorte en de gevolgen ervan voor vroege postnatale pijnbestrijding blijven cruciale studiegebieden. Daarom was het huidige werk bedoeld om bij te dragen aan de literatuur door een te vroeg geboren rattenmodel op te stellen. Dit model geeft inzicht in de impact van neonatale speldenprikstimuli op pijndrempels in latere levensfasen, waardoor we meer inzicht krijgen in prematuriteitsgerelateerde pijn.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures volgden de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die is aangenomen door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Federale Universiteit van Alfenas (protocol 32/2016).

1. Dieren

  1. Verkrijg volwassen mannelijke en nullipara Wistar vrouwelijke ratten (ongeveer acht weken oud) van de Centrale Dierenfaciliteit van de Federale Universiteit van Alfenas.
  2. Huisvest de ratten onder gecontroleerde temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden in een 12:12 uur licht: donker-cyclus en voed ze ad libitum met voer en water in de Faculteit Fysiotherapie dierenfaciliteiten (Federale Universiteit van Alfenas).

2. Controleren op zwangerschap

  1. Vervoer gedurende 1 maand elke ochtend tussen 8.00 en 9.00 uur elke dierenkooi naar de proefruimte. Om een vaginale wassing uit te voeren, brengt u voorzichtig een plastic pipet met 10 μL 0,9% NaCl-oplossing in de vagina van de rat. Zorg voor een ondiepe inbrenging om diepe penetratie te voorkomen en trek u vervolgens voorzichtig terug om vaginale afscheidingen te verzamelen.
  2. Plaats het verzamelde vaginale vocht op individuele glasplaatjes en wijs een apart objectglaasje toe aan elke kooi met dieren.
    1. Verkrijg van elke rat een enkele druppel ongekleurd materiaal met behulp van een schone pipetpunt. Onderzoek het materiaal onder een lichtmicroscoop met behulp van 10x en 40x objectieflenzen, zonder de condensorlens te gebruiken.
    2. Identificeer drie verschillende celtypen op basis van hun kenmerken: ronde en kernvormige epitheelcellen, onregelmatige verhoornde cellen zonder kern en kleine en ronde leukocyten15.
  3. Stel vrouwelijke Wistar-ratten met intense keratinisatie en vaginale afschilfering, kenmerkend voor de oestrische cyclus en indicatief voor een verhoogde mannelijke ontvankelijkheid, bloot aan paring. Paren de ratten door 2 vrouwtjes en 1 mannetje per kooi te plaatsen. Bepaal zwangerschapsdag 0 door te controleren op de aanwezigheid van sperma en oestrische fasecellen in vaginale uitstrijkjes.

3. Classificatie en beheer van drachtige moederdieren en hun nakomelingen

  1. Gooi drie soorten drachtige moederdieren weg (elk 2 moederdieren) op basis van hun zwangerschapsduur: prematuur, voldragen en surrogaatmoederdieren. Laat de voldragen drachtige moederdieren op natuurlijke wijze bevallen op dag 22 van de dracht en gebruik hun nesten voor de voldragen groep.
  2. Voer op dag 19 van de zwangerschap een keizersnede uit op de te vroeg geboren zwangere moeders, 3 dagen voorafgaand aan hun verwachte bevallingsdatum. Gebruik deze nesten voor de te vroeg geboren groep. Aangezien deze procedure niet bevorderlijk is voor de overleving van de moeder, vertrouwt u de te vroeg geboren pups toe aan draagmoeders, die 2 dagen voorafgaand aan de keizersnede van de te vroeg geboren moeders op natuurlijke wijze zijn bevallen.
  3. Houd de pups van de draagmoeder een paar uur bij haar, zodat hun geuren zich kunnen vermengen met de premature nesten. Introduceer na deze periode de premature nesten en verwijder de oorspronkelijke pups van de draagmoeder, en offer ze vervolgens op met hoge doses inhalatie van isofluraan.
    OPMERKING: Deze stap is essentieel om ervoor te zorgen dat de draagmoeders de melkproductie in hun borstklieren al hebben gestimuleerd, zodat ze de te vroeg geboren pups effectief kunnen voeden16.

4. Keizersnede

  1. Verdoof de te vroeg geboren drachtige moederdieren gedeeltelijk met 2% isofluraan en euthanaseer ze 3 dagen voor de verwachte bevallingsdatum met behulp van cervicale dislocatie. Na euthanasie worden de nakomelingen één voor één geëxtraheerd door middel van hysterectomie.
  2. Maak een snede van 3 cm in de middellijn van de onderbuik, gevolgd door een snede van 2 cm in de lengterichting. Maak van deze sneden een incisie langs de antimesenteriale grens in het middelste gedeelte van elke baarmoederbuis.
  3. Pak de pups en de placenta van ratten voorzichtig uit via hysterectomie17,18. Haal de nakomelingen er één voor één onmiddellijk uit.

5. Postoperatieve zorg en voorbereiding van pups op adoptie

  1. Gebruik de adoptieprocedure om te voorkomen dat de geopereerde moeder ongepast gedrag vertoont als gevolg van de chirurgische ingreep en mogelijke pijn, die het volwassen gedrag van de puppy's zou kunnen beïnvloeden.
  2. Maak na de geboorte de luchtwegen van de rattenpups vrij met keukenpapier. Maak de rattenpups schoon door ze een bad te geven om kannibalisme door surrogaatdammen te voorkomen. Was de rattenpups in water van 28 °C en droog ze af.
  3. Verwijder eventuele bloedsporen en plaats de pups in petrischaaltjes onder verwarmd infraroodlicht, houd een temperatuur van ongeveer 28 °C aan totdat hun ademhaling regelmatig wordt.
  4. Knip hun navelstreng net onder de placenta door en gebruik katoen gedrenkt in H2O2 om het bloeden van de navelstreng te stoppen. Bied ze ten slotte aan de pleegmoeders aan voor adoptie.

6. Bevorder de interactie tussen de moeder en de adoptie van te vroeg geboren nakomelingen

  1. Huisvest elke pleegmoeder met hun nest in aparte plastic kooien. Markeer voor het overdragen elke termijnpuppy uit de pleeghand. Deze markering is cruciaal voor latere analyses van het gedrag van de moeder. Behoud de integriteit van de kooien van de pleegmoeders tijdens het adoptieproces.
  2. Plaats de premature pups in eerste instantie buiten het nest. Deze strategie stelt de draagmoeder in staat om de geur van de nieuwe pups te herkennen en ermee vertrouwd te raken in een neutraal territorium. Selecteer ook een of twee van de eigen pups van de pleegmoeder en plaats ze buiten het nest naast de te vroeg geboren pups. Deze mix zet de draagmoeder ertoe aan om zowel haar eigen als de te vroeg geboren pups te verzamelen, waardoor de acceptatie en integratie van de nieuwe pups in haar nest wordt bevorderd.
  3. Meng de adoptienakomelingen in eerste instantie met de biologische nakomelingen. Bevestig de effectieve adoptie. Haal de pups van de pleegmoeder uit het nest en offer ze19.
    OPMERKING: In deze studie was de levensvatbaarheid van te vroeg geboren ratten 100% en werden ze niet afgewezen door de draagmoeder.

7. Standaardisatie van nesten

  1. Houd een worpgrootte van 8 pups per nest aan in alle groepen surrogaat-opgevoede pups, met 4 mannetjes en 4 vrouwtjes. Offer de resterende pup ratten na standaardisatie.

8. Experimenteel ontwerp en protocolimplementatie

OPMERKING: Het doel van dit protocol was om levensvatbare premature pups te verkrijgen voor de ontwikkeling van de volgende experimentele procedures.

  1. Gebruik in totaal 20 drachtige moeders voor de procedures. Verdeel ze in twee experimentele groepen, elk bestaande uit 10 dammen.
    1. Stimuleer de pups in de eerste groep, de PP-groep, met speldenprikprikkels van PND 2 tot PND 15.
    2. Wijs de tweede groep aan als de CC-groep, die als controle dient, waarbij de pups in deze groep geen speldenprikstimulatie krijgen.
    3. Houd het moedergedrag van de moederdieren en het gewicht van de nesten gedurende deze periode nauwlettend in de gaten.

9. Beoordelingen na het spenen en gedragstesten

  1. Spenen van de nakomelingen op PND 22. Sorteer ze op geslacht en huisvest ze in kooien met een maximale capaciteit van 4 dieren elk tot ze ongeveer 8 weken oud zijn.
  2. Onderwerp deze dieren vervolgens aan evaluaties op gevoeligheid voor pijnlijke stimuli met behulp van de elektronische von Frey-test. Richt u specifiek op door ontstekingen veroorzaakte pijn van CFA.
  3. Om mogelijke strooiselgerelateerde invloeden te verminderen, selecteert u 1 mannelijke en 1 vrouwelijke rat uit elk nest voor elke experimentele groep om tijdens de volwassenheid gedragstests te ondergaan.
  4. Gebruik elk dier in een enkel experiment om interferentie van hormonale factoren in de nociceptieve reacties van vrouwelijke nakomelingen van ratten te voorkomen. Zorg er in het bijzonder voor dat tests worden uitgevoerd op vrouwtjes tijdens de diestrusfase van hun oestrische cyclus.

10. Herhaalde neonatale pijninductie

  1. Herhaalde neonatale pijn induceren met behulp van een speldenpriktechniek die vergelijkbaar is met degene die in een eerdere studie is beschreven20. Start dagelijkse speldenprikstimuli voor de rattenpups vanaf postnatale dag 2 (PND 2) en ga hiermee door tot PND 15.
  2. Steek voorzichtig een naald van 22 G op een ondiepe diepte in het midden van de plantaire zone van de rechter achterpoot.
    1. Zorg ervoor dat de penetratie net voldoende is om te stimuleren zonder onnodig letsel te veroorzaken. Kalibreer de meter om diepere penetratie te voorkomen, rekening houdend met het risico dat deze op deze leeftijd volledig door de poot gaat.
    2. Als er een bloeding optreedt, stop deze dan onmiddellijk met een wattenstaafje; Meestal duurt deze interventie slechts enkele seconden. Dien 4 keer stimuli toe, met een tussenruimte van 2 minuten tussen elk, in totaal 8 prikken per dag.
  3. Om mogelijke verstorende factoren in verband met de scheiding van de moeder en de neonatale behandeling tot een minimum te beperken, moet u de rattenpups maximaal 5 minuten van hun moeders scheiden. Pas dezelfde scheidingsduur toe op de controlegroep. Breng de rattenpups na elke reeks stimuli onmiddellijk terug naar hun moeders 5,21,22.

11. Evaluatie van maternale gedragingen

  1. Om het gedrag van de moeder te evalueren, beoordeelt u het gedrag van moederdieren in beide experimentele groepen (n = 10 per groep) van PND 2 tot PND 15. Voer de beoordeling uit in twee sessies: één in de ochtend, vóór de speldenprikprikkels op de rattenpups (tussen 08:00 en 09:30 uur), en één in de middag, na de speldenprikprikkels op de rattenpups (tussen 15:00 en 16:30 uur).
  2. Tijdens deze sessies observeert, registreert en scoort u tijdens deze sessies elke 3 minuten het gedrag van elke moeder, wat leidt tot 30 observaties per periode per dag. Dit komt neer op een totaal van 60 observaties per moeder per dag.

12. Registratie van maternale en niet-moederlijke gedragingen

  1. Leg maternale gedragsparameters vast die acties omvatten zoals verzorgen of likken (op het lichaam of anogenitale regio), borstvoeding, het handhaven van een gebogen rug in een "deken"-achtige houding door over de pups te liggen, passief op zijn rug of zij te liggen tijdens het geven van borstvoeding, deel te nemen aan het bouwen van nesten en maternale zelfverzorging (inclusief stimulatie van borsten door zelfreiniging).
  2. Documenteer niet-maternale gedragsparameters, inclusief acties zoals voeren, het verkennen van de kooibehuizing, niet verkennen en de afwezigheid van maternale zelfverzorging.
  3. Presenteer de gegevens als het percentage van het totale maternale gedrag en niet-moederlijk gedrag. Deel het aantal geregistreerde waarnemingen van doelgedrag door het totale aantal waarnemingen en vermenigvuldig het resultaat met 100 5,23,24.

13. Beoordeling van het gewicht van het zwerfvuil

  1. Controleer gedurende de stimulatiefase van de speldenprik (PND 2-15) het gewicht van de nesten in zowel de PP- als de CC-groep, die elk uit 8 nesten bestaan.
  2. Houd tijdens de speldenprikstimulatiefase (PND 2-15) het gewicht van de nesten in zowel de PP- als de CC-groep, elk bestaande uit 8 nesten, continu in de gaten.

14. Mechanische drempeltest

  1. In dit experiment worden injecties met zoutoplossing of CFA toegediend, elk in een volume van 100 μl, aan ratten (8 weken oud) uit de PP- en CC-groepen. Plaats ze daarna 15-30 minuten voor de test afzonderlijk in acrylkooien (42 cm × 24 cm × 15 cm) met draadroostervloeren om mechanische hyperalgesie te beoordelen.
  2. Induceer tijdens de test een flexiereflex van de achterpoot met behulp van een draagbare krachtopnemer die is uitgerust met een punt van 0,5 mm2 polypropyleen (Electronic von Frey).
    1. Breng de punt geleidelijk aan tussen de vijf distale voetzolen van de rechter achterpoot en verhoog de druk totdat een reactie wordt waargenomen.
      OPMERKING: Wanneer de poot wordt teruggetrokken, stopt de stimulus automatisch en wordt de kracht ervan gedocumenteerd. De test wordt afgesloten met een duidelijke terugdeinzende reactie, gevolgd door het terugtrekken van de poot. Subcutane toediening van CFA induceert langdurige ontsteking, met een piek na 24 uur en aanhoudend gedurende ten minste 7 dagen25.
  3. Voer tests uit op de dieren voor en 4 uur, 7 uur, 10 uur en 24 uur na de toediening van zoutoplossing of CFA4. Presenteer de resultaten in termen van onttrekkingsdrempel, gemeten in gram (g), en bereken deze door het gemiddelde te nemen van drie metingen.
  4. Om de interferentie van mogelijke hormonale factoren in nociceptieve reacties bij vrouwelijke nakomelingen te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de tests uitsluitend worden uitgevoerd tijdens de diëstrusfase van hun oestrische cyclus.

15. Analyse van de gegevens

  1. Verwerk de gegevens met behulp van statistische analysesoftware en presenteer deze als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Om statistisch significante verschillen tussen groepen te identificeren, past u een tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) toe met herhaalde metingen, waarbij rekening wordt gehouden met factoren zoals de beoordeling van maternale versus niet-maternale parameters en evaluatie van het worpgewicht.
  2. Analyseer in het bijzonder PND- en speldenprikstimuli voor maternale parameters en von Frey: CFA- en speldenprikstimuli voor de beoordeling van het strooiselgewicht. Voer indien nodig een post-hocanalyse uit met behulp van de Bonferroni-test.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie waren er geen verschillen in maternale of niet-maternale gedrag tussen moeders, ongeacht of hun nakomelingen tijdens de neonatale periode speldenprikexperimenten ondergingen of te vroeg of voldragen waren (Figuur 1). Met betrekking tot het maternale gedrag van adoptiemoeders van te vroeg geboren kinderen, toonde tweerichtings-ANOVA aan dat er een effect was van PND (postnatale dag) maar geen effect van speldenprikstimuli of enige interactie tussen de twee factoren bij het evalueren van het waargenomen maternale gedrag om 8 uur 's ochtends [PND-factor: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; speldenprik stimulusfactor: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; speldenprik stimulus x PND interactie: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; Figuur 1A]; of om 15.00 uur [PND-factor: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07; speldenprikstimulus x PND-interactie: F(13, 140) = 1,82, p = 0,04; Figuur 1C]. In termen van niet-materrisch gedrag was er een merkbaar effect als gevolg van PND, maar er was geen significante invloed van de speldenprikstimuli of interactie tussen deze twee factoren om 8 uur 's ochtends. [PND-factor: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; interactie tussen de speldenprikstimulus en PND: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; zie figuur 1B]. Evenzo, terwijl het PND-effect aanhield, waren de invloed van de speldenprikstimuli en de interactie ervan met PND niet statistisch significant om 3 uur 's middags [PND-factor: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07. Tweerichtings-ANOVA onthulde een opmerkelijk effect van PND, en, belangrijker nog, een significante interactie tussen speldenprikstimuli en PND om 15.00 uur (PND-factor: F(13, 182) = 13.82, p < 0.001; speldenprikstimulifactor: F(1, 182) = 3.78, p = 0.05; Interactie PND x speldenprikstimuli: F(13, 182) = 1,82, p = 0,04; zie figuur 1D]. Deze interactie onderstreept een duidelijke impact van speldenprikstimuli op niet-moederlijk gedrag, vooral duidelijk in de middagevaluatie.

figure-results-1
Figuur 1: Effecten van speldenprikken tijdens de neonatale periode (PND 2-15) op het maternale gedrag van adoptiemoeders van te vroeg geboren nakomelingen. (A) Aantal geregistreerde maternale gedragingen beoordeeld om 8.00 uur (B) Aantal geregistreerde niet-maternale gedragingen beoordeeld om 8.00 uur (C) Aantal geregistreerde maternale gedragingen beoordeeld om 15.00 uur. (D) Aantal geregistreerde niet-moederlijke gedragingen beoordeeld om 15.00 uur Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 toont de gewichtstoename van het te vroeg geboren nest gedurende de periode waarin de speldenprikprikkel werd toegepast (PND 2-15). Er werden geen veranderingen in het gewicht van het worp waargenomen tussen de CC-groep (controlegroep) en de PP-groep (speldenprik). Tweerichtings-ANOVA toonde een significant effect van PND, maar geen significante effecten van speldenprikstimulus of interactie tussen de twee factoren op het strooiselgewicht [PND-factor: F(13, 140) = 247,5, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(1, 140) = 0,89, p = 0,34; speldenprikstimulus × PND-interactie: F(13, 140) = 0,05, p = 1,00].

figure-results-2
Figuur 2 - Effecten van speldenprikken tijdens de neonatale periode (PND 2-15) op het gewicht van het te vroeg geboren nest in grammen. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 8 dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Significante hoofdeffecten van speldenprikstimuli en CFA op de onttrekkingsdrempel van de poten werden waargenomen, met een substantiële afname (p < 0,001) die op alle tijdstippen zichtbaar was bij mannelijke pups uit de CC/CFA- en PP/CFA-groepen in vergelijking met die in de CC/Sal- en PP/Sal-groepen (Figuur 3A). Dit onderstreept de robuuste impact van zowel speldenprikstimuli als CFA op nociceptieve reacties bij mannelijke pups. Met name 4 uur na de CFA-injectie werd een significante vermindering van de PWT (p < 0,001) waargenomen in de PP/CFA-groep in vergelijking met de CC/CFA-groep [CFA-factor: F(4,112) = 13,12, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(3,112) = 14,45, p < 0,05; CFA x speldenprik stimulusinteractie: F(12,112) = 5,14, p < 0,05]. Met betrekking tot vrouwelijke pups (figuur 3B) werd een daling van de wachtdrempel (p < 0,001) waargenomen in de CC/CFA- en PP/CFA-groepen op alle tijdstippen in vergelijking met die in de CC/Sal- en PP/Sal-groepen. In het bijzonder werd 4 uur na de CFA-injectie een significante verlaging van de onttrekkingsdrempel (p < 0,05) waargenomen in de PP/CFA-groep in vergelijking met de CC/CFA-groep [CFA-factor: F(4,112) = 31,16, p < 0,001; speldenprikstimulusfactor: F(3,112) = 18,22, p < 0,01; CFA x speldenprik stimulusinteractie: F(12,112) = 58,13, p < 0,01]. Zowel mannelijke als vrouwelijke volwassenen vertoonden een verlaagde drempel voor het terugtrekken van de poten tussen de PP/CFA-groep en de CC/CFA-groep op alle tijdstippen vanaf de 4-uursmarkering.

figure-results-3
Figuur 3 - Effecten van speldenprikken tijdens de neonatale periode (PND 2-15) in te vroeg geboren nesten op nociceptie volgens de von Frey-test voor en na injectie van intraplantaire CFA of zoutoplossing. Drempel voor het terugtrekken van de poten, in grammen, bij (A) mannelijke ratten of (B) vrouwelijke ratten. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 8 dieren. * p < 0,05 en *** p < 0,001 vergeleken met de controle- en PP/zoutoplossing groepen ten opzichte van de controle- en PP/CFA-groepen; # p < 0,01 waarbij de Control CFA-groep wordt vergeleken met de PP/CFA-groep. BASAL vertegenwoordigt de nociceptieve drempel die wordt gemeten voorafgaand aan intraplantaire injectie van CFA of zoutoplossing. De pijl geeft het tijdstip van intraplantaire injectie van CFA of zoutoplossing aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit onderzoek zagen we dat maternale en niet-maternale gedragingen van moeders onaangetast bleven door neonatale speldenprikexperimenten. Deze trend breidde zich ook uit tot niet-moederlijk gedrag. Bovendien was de gewichtstoename van te vroeg geboren nesten tijdens de speldenprikstimulusperiode niet significant verschillend tussen de controlegroep en de speldenprikgroep. Analyses van de pootterugtrekkingsdrempel onthulden een opmerkelijke vermindering van zowel mannelijke als vrouwelijke pups uit de speldenprik- en CFA-groepen in vergelijking met die uit de controlegroepen. Bijzonder opvallend was de waarneming van een verdere verlaging van de drempel voor het terugtrekken van de poot 4 uur na de CFA-injectie in de speldenprik/CFA-groep in vergelijking met de controle/CFA-groep. Deze genuanceerde resultaten onderstrepen de veelzijdige effecten van neonatale speldenprikstimulatie op het gedrag van de moeder, gewichtstoename van het nest en nociceptieve reacties bij nakomelingen, en benadrukken het belang van het overwegen van zowel premature als voldragen aandoeningen bij het interpreteren van resultaten.

Ons onderzoek naar nociceptieve reacties sluit aan bij en breidt de bevindingen uit van de Carvalho et al.26, die veranderingen in nociceptieve reacties en inflammatoire overgevoeligheid op volwassen leeftijd rapporteerden als gevolg van herhaalde speldenprikstimulatie bij te vroeg geboren nakomelingen. Deze convergentie van de resultaten onderstreept de blijvende impact van neonatale ervaringen op nociceptieve paden, en benadrukt de robuustheid van deze resultaten in verschillende onderzoeken. De waargenomen verhoogde gevoeligheid voor schadelijke stimuli bij zowel mannelijke als vrouwelijke pups die werden onderworpen aan neonatale speldenprikstimulatie suggereerde een consistente trend in de modulatie van nociceptieve reacties, wat verder bijdroeg aan ons begrip van de langetermijngevolgen van stressoren in het vroege leven.

De bevindingen van deze studie komen ook overeen met het werk van Gieré et al.27, die nociceptieve overgevoeligheid bij volwassen ratten onderzochten na neonatale maternale scheiding. Hun studie suggereerde een centrale oorsprong van nociceptieve overgevoeligheid, wat het idee versterkte dat stressoren in het vroege leven blijvende veranderingen in pijnverwerkingsmechanismen kunnen veroorzaken. De convergentie van de resultaten benadrukt de complexe wisselwerking tussen gebeurtenissen in het vroege leven en nociceptieve reacties, wat de noodzaak van een uitgebreid begrip van de centrale mechanismen die bijdragen aan langetermijnveranderingen in pijngevoeligheid verder onderstreept.

De impact van ervaringen in het vroege leven op nociceptieve routes wordt verder ondersteund door de bevindingen van Chang et al.28, die veranderingen in functionele pijnconnectiviteit in de somatosensorische en mediale prefrontale cortex van ratten onderzochten na pijnervaringen in het vroege leven. Hun werk benadrukte langetermijnveranderingen in pijnverwerkingsmechanismen veroorzaakt door stressoren in het vroege leven, en benadrukte het belang van het begrijpen van de neurale correlaten van nociceptieve reacties. Het integreren van deze resultaten met de observaties van verhoogde gevoeligheid voor schadelijke stimuli bij te vroeg geboren nakomelingen die worden onderworpen aan neonatale speldenprikstimulatie draagt bij aan een beter begrip van de blijvende gevolgen van pijnervaringen in het vroege leven op pijncircuits bij volwassenen.

Bovendien toonden Van den Hoogen et al.29 aan dat herhaalde stimulatie van aanraking en naaldprik tijdens de neonatale periode de mechanische gevoeligheid bij aanvang en de overgevoeligheid na letsel bij volwassen spinale sensorische neuronen verhoogde. De huidige bevindingen, in lijn met eerder onderzoek, onderstrepen de blijvende gevolgen van neonatale pijnervaringen op nociceptieve paden. Samen benadrukken deze studies het belang van het erkennen van de langetermijnimpact van ervaringen in het vroege leven op de pijngevoeligheid bij volwassenen, wat bijdraagt aan een alomvattend begrip van de complexe wisselwerking tussen neonatale stimuli en nociceptieve reacties.

Door vroeggeboorte te combineren met blootstelling aan pijnlijke stimuli tijdens de neonatale periode, ontwikkelden we een model dat de vroege levenservaringen van menselijke premature baby's nauw nabootst, rekening houdend met de dwingende behoefte aan intensieve zorg die nodig is door prematuriteit. Desalniettemin vereist de translationele relevantie van dit model, met name met betrekking tot de NICU-ervaringen van te vroeg geboren baby's, verdere verduidelijking. Er werden met name geen studies geïdentificeerd die een vergelijkbaar prematuriteitsmodel gebruikten als het model dat in de huidige studie werd gebruikt. Wanneer we echter de eerste levensdagen (1-2) beschouwen als een weergave van prematuriteit, heeft eerder onderzoek aangetoond dat mannen in deze kritieke periode kwetsbaarder zijn voor nociceptieve stimuli dan vrouwen. Deze kwetsbaarheid werd bevestigd door nociceptieve tests die op volwassen leeftijd werden toegepast, wat een gedeeltelijke rechtvaardiging bood voor de waargenomen resultaten van deze studie30.

De huidige studie was een pionier in het gebruik van te vroeg geboren dieren met een keizersnede na 19 dagen zwangerschap om de nociceptieve drempel op volwassen leeftijd te evalueren. Dit nieuwe model voor het bestuderen van pijn bij te vroeg geboren pasgeborenen biedt een uniek perspectief op deze populatie. Dit model roept nieuwe vragen op over nociceptieve tests, zoals de von Frey-test, bij volwassen dieren van beide geslachten, evenals alle aspecten die betrokken zijn bij de nociceptieve drempels van deze dieren, zowel tijdens de neonatale periode als op volwassen leeftijd.

Hoewel de huidige studie zich voornamelijk richtte op de impact van neonatale speldenprikstimuli op pijndrempels in latere levensfasen, is er een veelbelovende weg om dit onderzoek uit te breiden naar interventies en postnatale pijnstillende strategieën. Toekomstige studies zouden de werkzaamheid van verschillende pijnbestrijdingsinterventies in een te vroeg geboren rattenmodel kunnen beoordelen, waarbij mogelijke wegen worden onderzocht om de langetermijneffecten van neonatale pijn te verminderen. Dit kan bestaan uit het onderzoeken van nieuwe pijnstillende benaderingen, het beoordelen van de duur en intensiteit van de benodigde interventies en het onderzoeken van de onderliggende mechanismen die de effectiviteit van deze interventies beïnvloeden.

Concluderend was het uitgebreide onderzoek dat in deze studie werd uitgevoerd, gericht op het ontleden van het ingewikkelde samenspel van neonatale speldenprikstimulatie, moederlijk gedrag en vroeggeboorteaandoeningen op nociceptieve reacties bij het nageslacht. De nauwgezette analyse van het gedrag van de moeder, in combinatie met de uitsluiting van mogelijke verstorende factoren zoals vroeggeboorte en adoptieve zorgverlening, bevestigde opnieuw de veerkracht van het moederlijke gedrag tegen de toegediende nociceptieve stimulus. De gewichtstoename van de premature nesten bleef onaangetast, wat aangeeft dat de waargenomen veranderingen in nociceptieve reacties tijdens de volwassenheid waarschijnlijker werden toegeschreven aan stimulatie van speldenprikken in het vroege leven dan aan maternale zorg of de ontwikkeling van het nageslacht. De bevindingen van deze studie komen overeen met de literatuur over de blijvende gevolgen van neonatale pijnervaringen, waarbij de nadruk ligt op een verhoogde gevoeligheid voor schadelijke stimuli op volwassen leeftijd. Bovendien biedt de verkenning van mogelijke mechanistische theorieën, waaronder veranderingen in neurale verwerking en glucocorticoïde receptorfunctie, waardevolle inzichten in de onderliggende routes die bijdragen aan nociceptieve veranderingen. Samen onderstrepen de hier gepresenteerde resultaten en die van eerdere studies de complexiteit van vroege levenservaringen in nociceptieve paden, en werpen ze licht op de blijvende gevolgen van neonatale stimuli op pijncircuits bij volwassenen. Hoewel verder onderzoek gerechtvaardigd is om de genuanceerde onderliggende mechanismen op te helderen, draagt deze studie bij aan de groeiende hoeveelheid kennis die gericht is op het onthullen van de langetermijnimpact van gebeurtenissen in het vroege leven op nociceptieve reacties bij volwassen nakomelingen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Federale Universiteit van Alfenas - UNIFAL-MG en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazilië (CAPES Fellowship, Laura Pereira Generoso; Natalie Lange Candido en Maria Gabriela Maziero Capello) - Financiële Code 001.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% NaCl solutionConcare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floorsInsight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA) Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)ACS Cientifica, Brazil
Infrared lightingCarci, Brazil
Isoflurane (2%)Cristália, Brazil
Upright microscopeNikon, BrazilECLIPSE EiMicroscope with 10x and 40x objective lenses

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neonatal complete Freund's adjuvant-induced inflammation does not induce or alter hyperalgesic priming or alter adult distributions of C-fibre dorsal horn innervation. Pain Reports. 5 (6), e872(2020).">Cooper, A. H., Hanmer, J. M., Chapman, V., Hathway, G. J. Neonatal complete Freund's adjuvant-induced inflammation does not induce or alter hyperalgesic priming or alter adult distributions of C-fibre dorsal horn innervation. Pain Reports. 5 (6), e872(2020).
  2. Inflammatory neonatal pain disrupts maternal behavior and subsequent fear conditioning in a rodent model. Developmental Psychobiology. 62 (1), 88-98 (2020).">Davis, S. M., Rice, M., Burman, M. A. Inflammatory neonatal pain disrupts maternal behavior and subsequent fear conditioning in a rodent model. Developmental Psychobiology. 62 (1), 88-98 (2020).
  3. Neonatal pain and reduced maternal care alter adult behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity in a sex-specific manner. Developmental Psychobiology. 62 (5), 631-643 (2020).">Mooney-Leber, S. M., Brummelte, S. Neonatal pain and reduced maternal care alter adult behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity in a sex-specific manner. Developmental Psychobiology. 62 (5), 631-643 (2020).
  4. Experiencing early life maternal separation increases pain sensitivity in adult offspring. International Journal of Developmental Neuroscience. 62, 8-14 (2017).">Vilela, F. C., Vieira, J. S., Giusti-Paiva, A., Silva, M. L. D. Experiencing early life maternal separation increases pain sensitivity in adult offspring. International Journal of Developmental Neuroscience. 62, 8-14 (2017).
  5. Repeated neonatal needle-prick stimulation increases inflammatory mechanical hypersensitivity in adult rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 78, 191-197 (2019).">de Carvalho, R. C., et al. Repeated neonatal needle-prick stimulation increases inflammatory mechanical hypersensitivity in adult rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 78, 191-197 (2019).
  6. Epidemiology and treatment of painful procedures in neonates in intensive care units. JAMA. 300 (1), 60-70 (2008).">Carbajal, R., et al. Epidemiology and treatment of painful procedures in neonates in intensive care units. JAMA. 300 (1), 60-70 (2008).
  7. The impact of cumulative pain/stress on neurobehavioral development of preterm infants in the NICU. Early Human Development. 108, 9-16 (2017).">Cong, X., et al. The impact of cumulative pain/stress on neurobehavioral development of preterm infants in the NICU. Early Human Development. 108, 9-16 (2017).
  8. Noise levels of neonatal high-flow nasal cannula devices - An in-vitro study. Neonatology. 103 (4), 264-267 (2013).">König, K., Stock, E. L., Jarvis, M. Noise levels of neonatal high-flow nasal cannula devices - An in-vitro study. Neonatology. 103 (4), 264-267 (2013).
  9. Measuring preterm cumulative stressors within the NICU: the Neonatal Infant Stressor Scale. Early Human Development. 85 (9), 549-555 (2009).">Newnham, C. A., Inder, T. E., Milgrom, J. Measuring preterm cumulative stressors within the NICU: the Neonatal Infant Stressor Scale. Early Human Development. 85 (9), 549-555 (2009).
  10. Development, evaluation and adaptation of a critical realism informed theory of procedural pain management in preterm infants: The PAIN-Neo theory. Journal of Advanced Nursing. 79 (6), 2155-2166 (2023).">De Clifford-Faugère, G., Aita, M., Arbour, C., Colson, S. Development, evaluation and adaptation of a critical realism informed theory of procedural pain management in preterm infants: The PAIN-Neo theory. Journal of Advanced Nursing. 79 (6), 2155-2166 (2023).
  11. Nitric oxide production in the striatum and cerebellum of a rat model of preterm global perinatal asphyxia. Neurotoxicity Research. 31 (3), 400-409 (2017).">Barkhuizen, M., et al. Nitric oxide production in the striatum and cerebellum of a rat model of preterm global perinatal asphyxia. Neurotoxicity Research. 31 (3), 400-409 (2017).
  12. Effect of prenatal steroidal inhibition of sPLA2 in a rat model of preterm lung. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 36, 31-36 (2016).">Remesal, A., et al. Effect of prenatal steroidal inhibition of sPLA2 in a rat model of preterm lung. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 36, 31-36 (2016).
  13. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist pioglitazone reduces the development of necrotizing enterocolitis in a neonatal preterm rat model. Pediatric Research. 81 (2), 364-368 (2017).">Corsini, I., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist pioglitazone reduces the development of necrotizing enterocolitis in a neonatal preterm rat model. Pediatric Research. 81 (2), 364-368 (2017).
  14. A preterm rat model for immunonutritional studies. Nutrients. 11 (5), 999(2019).">Grases-Pintó, B., et al. A preterm rat model for immunonutritional studies. Nutrients. 11 (5), 999(2019).
  15. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).">Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  16. Establishment of the patent ductus arteriosus model in preterm rats. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics. 18, 372-375 (2016).">Zhu, M. -R., Liu, H. -Y., Liu, P. -P., Wu, H. Establishment of the patent ductus arteriosus model in preterm rats. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics. 18, 372-375 (2016).
  17. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 185 (3), 614-617 (2001).">Bowers, D., McKenzie, D., Dutta, D., Wheeless, C. R., Cohen, W. R. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 185 (3), 614-617 (2001).
  18. Whey peptides improve wound healing following caesarean section in rats. The British Journal of Nutrition. 104 (11), 1621-1627 (2010).">Wang, J., et al. Whey peptides improve wound healing following caesarean section in rats. The British Journal of Nutrition. 104 (11), 1621-1627 (2010).
  19. Magnetic resonance imaging of pulmonary damage in the term and premature rat neonate exposed to hyperoxia. Pediatric Research. 50 (4), 502-507 (2001).">Appleby, C. J., Towner, R. A. Magnetic resonance imaging of pulmonary damage in the term and premature rat neonate exposed to hyperoxia. Pediatric Research. 50 (4), 502-507 (2001).
  20. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rat pups. Physiology & Behavior. 66 (4), 627-637 (1999).">Anand, K. J., Coskun, V., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rat pups. Physiology & Behavior. 66 (4), 627-637 (1999).
  21. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain. 57 (3), 375-382 (1994).">Tal, M., Bennett, G. J. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain. 57 (3), 375-382 (1994).
  22. Neonatal repetitive pain in rats leads to impaired spatial learning and dysregulated hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in later life. Scientific Reports. 6 (1), 39159(2016).">Chen, M., et al. Neonatal repetitive pain in rats leads to impaired spatial learning and dysregulated hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in later life. Scientific Reports. 6 (1), 39159(2016).
  23. Continuous central infusion of cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases maternal care in lactating rats: consequences for fear conditioning in adulthood males. Behavioural Brain Research. 257, 31-38 (2013).">Costa, H. H., Vilela, F. C., Giusti-Paiva, A. Continuous central infusion of cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases maternal care in lactating rats: consequences for fear conditioning in adulthood males. Behavioural Brain Research. 257, 31-38 (2013).
  24. The CB1 cannabinoid receptor mediates glucocorticoid-induced effects on behavioural and neuronal responses during lactation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (8), 1197-1207 (2013).">Vilela, F. C., Ruginsk, S. G., de Melo, C. M., Giusti-Paiva, A. The CB1 cannabinoid receptor mediates glucocorticoid-induced effects on behavioural and neuronal responses during lactation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (8), 1197-1207 (2013).
  25. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).">Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
  26. Effects of repetitive pinprick stimulation on preterm offspring: Alterations in nociceptive responses and inflammatory hypersensitivity in adulthood. Behavioural Brain Research. 454, 114633(2023).">de Carvalho, R. C., et al. Effects of repetitive pinprick stimulation on preterm offspring: Alterations in nociceptive responses and inflammatory hypersensitivity in adulthood. Behavioural Brain Research. 454, 114633(2023).
  27. Towards a central origin of nociceptive hypersensitivity in adult rats after a neonatal maternal separation. The European Journal of Neuroscience. 58 (10), 4155-4165 (2023).">Gieré, C., et al. Towards a central origin of nociceptive hypersensitivity in adult rats after a neonatal maternal separation. The European Journal of Neuroscience. 58 (10), 4155-4165 (2023).
  28. Early life pain experience changes adult functional pain connectivity in the rat somatosensory and the medial prefrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 42 (44), 8284-8296 (2022).">Chang, P., Fabrizi, L., Fitzgerald, M. Early life pain experience changes adult functional pain connectivity in the rat somatosensory and the medial prefrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 42 (44), 8284-8296 (2022).
  29. Repeated touch and needle-prick stimulation in the neonatal period increases the baseline mechanical sensitivity and postinjury hypersensitivity of adult spinal sensory neurons. Pain. 159 (6), 1166-1175 (2018).">vanden Hoogen, N. J., et al. Repeated touch and needle-prick stimulation in the neonatal period increases the baseline mechanical sensitivity and postinjury hypersensitivity of adult spinal sensory neurons. Pain. 159 (6), 1166-1175 (2018).
  30. Long-term effects of neonatal pain and stress on reactivity of the nociceptive system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 161 (6), 755-758 (2016).">Butkevich, I. P., Mikhailenko, V. A. Long-term effects of neonatal pain and stress on reactivity of the nociceptive system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 161 (6), 755-758 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Preterm Rat ModelPain SensitivityNeonatal PainPinprick StimulationMechanical HypersensitivityInflammatory HypersensitivityMaternal BehaviorGlucocorticoid ReceptorsHysterectomy ProcedureFoster Adoption

Related Articles