Methodenartikel

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

DOI:

10.3791/65822

⸱

10 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, vormt een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in het algemeen. Tijdens griepseizoenen kan de verspreiding van SARS-CoV-2 en andere respiratoire virussen een bevolkingsbrede last van luchtwegaandoeningen veroorzaken die moeilijk te beheersen is. Daarvoor zullen de respiratoire virussen SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) in de komende herfst- en winterseizoenen zorgvuldig in de gaten moeten worden gehouden, met name in het geval van SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B, die vergelijkbare epidemiologische factoren delen, zoals vatbare populaties, wijze van overdracht en klinische syndromen. Zonder doelwitspecifieke tests kan het een uitdaging zijn om onderscheid te maken tussen gevallen van deze virussen vanwege hun overeenkomsten. Dienovereenkomstig zal een gevoelige en gerichte multiplextest die gemakkelijk onderscheid kan maken tussen deze virale doelwitten nuttig zijn voor beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg. In deze studie ontwikkelden we een real-time reverse transcriptase-PCR-gebaseerde assay met behulp van een in-house ontwikkelde R3T eenstaps RT-qPCR-kit voor gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV. Met slechts 10 kopieën van hun synthetische RNA's kunnen we met succes SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en MERS-CoV-doelen tegelijkertijd identificeren met 100% specificiteit. Deze test blijkt nauwkeurig, betrouwbaar, eenvoudig, gevoelig en specifiek te zijn. De ontwikkelde methode kan worden gebruikt als een geoptimaliseerde SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostische test in ziekenhuizen, medische centra en diagnostische laboratoria, evenals voor onderzoeksdoeleinden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pandemie van de aanhoudende coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het nieuwe coronavirus dat bekend staat als het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Vanwege de sterke besmettelijkheid van SAR-CoV-2 en het vermogen tot snelle overdracht, ontstond de COVID-19-pandemie in Wuhan City, China, en verspreidde zich snel over de hele wereld. Dit leidde uiteindelijk tot het begin van tekenen van ademnood en zelfs de dood 2,3,4. COVID-19 is in meer dan 213 landen uitgeroepen tot pandemie, waarbij een sterke toename van het aantal bevestigde gevallen wordt verwacht, zoals blijkt uit de artikelen die door verschillende onderzoeken zijn gepubliceerd 3,5. COVID-19 wordt voornamelijk overgedragen door kleine ademhalingsdruppeltjes die geïnfecteerde personen in het milieu afgeven en vervolgens worden blootgesteld aan kwetsbare personen door inademing of nauw contact met besmette oppervlakken. Wanneer deze druppeltjes in contact komen met het slijmvlies van de ogen, mond of neus, kan een persoon besmet raken6. Uit statistieken van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijkt dat er wereldwijd meer dan 76 miljoen bevestigde gevallen van de pandemie zijn geweest, met maar liefst 7 miljoen doden7. Zo classificeerden de Verenigde Naties de pandemie veroorzaakt door de ziekte COVID-19 als een ramp vanwege de directe impact op het leven van miljarden mensen over de hele wereld en had verstrekkende economische, ecologische en sociale gevolgen.

Initiatieven op het gebied van de volksgezondheid, waaronder grondige tests, vroege opsporing, contactopsporing en isolatie van gevallen, blijken allemaal cruciaal te zijn om deze pandemie onder controle te houden 8,9,10,11. De wintermaanden zullen de circulatie van andere respiratoire virussen zoals Influenza A en B met COVID-19-achtige symptomen verhogen, waardoor het moeilijk wordt om COVID-19-gevallen in een vroeg stadium te identificeren, op te sporen en te isoleren. Elk jaar begint de uitbraak van influenza A en B in de late herfst of begin januari met een voorspelbare seizoensgebondenheid12. Talrijke epidemiologische kenmerken worden gedeeld door SARS-CoV-2- en influenzavirussen. Bovendien delen ze overeenkomsten in de vatbare populaties, waaronder kinderen, ouderen, immuungecompromitteerden en personen met chronische comorbiditeiten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, hart- en nierfalen of diabetes12,13. Deze virussen delen niet alleen kwetsbare populaties, maar ook transmissieroutes van contact en ademhalingsdruppeltjes14. Verwacht wordt dat patiënten waarschijnlijk meer dan één van deze respiratoire virussen kunnen oplopen naarmate het griepseizoennadert 14. Daarvoor moet de screening van SARS-CoV-2 en de influenzavirussen worden uitgevoerd op symptomatische patiënten voordat ze worden geïsoleerd. Het uitvoeren van afzonderlijke tests voor de drie virussen (SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B) is niet mogelijk vanwege het wereldwijde gebrek aan middelen voor nucleïnezuurextractie en diagnostiek. Om ze allemaal in één reactie te screenen, moet een methode of test worden ontwikkeld.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is een familielid van het menselijke coronavirus (CoV). De eerste isolaten van het MERS-CoV-virus waren afkomstig van een gehospitaliseerde patiënt in Saoedi-Arabië die in september 2012 was overleden als gevolg van acute ademhalingsproblemen. Er zijn aanwijzingen dat dromedariskamelen een prominente reservoirgastheer voor MERS-CoV zijn. Het is bewezen dat virussen van geïnfecteerde dromedariskamelen zoönotisch zijn en dus mensen kunnen infecteren16,17. Mensen die met dit virus zijn besmet, kunnen het via nauw contact naar anderen verspreiden18. Op 26 januari 2018 waren er 2143 laboratoriumbevestigde gevallen van MERS-CoV-infectie, waaronder 750 sterfgevallen wereldwijd. De meest typische MERS-CoV-symptomen zijn hoesten, koorts en kortademigheid. Er is ook gemeld dat MERS-CoV-infecties symptomen van longontsteking, diarree en gastro-intestinale misselijkheid vertonen20. Momenteel is er geen commercieel vaccin of specifieke behandeling voor MERS-CoV beschikbaar. Daarom is een snelle en nauwkeurige diagnose essentieel om de wijdverbreide MERS-CoV-uitbraken te voorkomen en MERS-CoV te onderscheiden van de ziekte SARS-CoV-2.

Tot op heden zijn er veel benaderingen voorgesteld om deze virussen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 en CRISPR/Cas329, laterale flow-immunoassay30, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren31, SHERLOCK-testen in één pot32, DNA-aptameer 33, lusgemedieerde isotherme versterking (LAMP)19,34, enz. Elk van de bovengenoemde methoden heeft unieke voor- en nadelen op het gebied van gevoeligheid en specificiteit. Van deze methoden is de op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde test: multiplex qRT-PCR, de meest voorkomende en wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en MERS-CoV.

In deze studie hebben we verschillende primercombinaties en sondes ontworpen en beoordeeld voor de effectieve, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV met behulp van standaard twist synthetische virale RNA's. De gemultiplexte tests die zijn ontwikkeld voor MERS-CoV- of SARS-CoV-2-doelgenen worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze genen coderen over het algemeen voor eiwitten en complexen die bijdragen aan de vorming van een replicatie/transcriptiecomplex (RTC)35, zoals het gebied binnen het open leesframe 1a (ORF1a) dat wordt gebruikt voor de MERS-CoV-test. Bovendien worden structurele eiwitten gecodeerd door de genen die worden gebruikt in diagnostische tests, zoals het stroomopwaartse gebied van het envelopgen (upE) en het nucleocapside-gen (N) die worden gebruikt voor respectievelijk MERS-CoV- en SARS-Cov-2-assays35,36. We gebruikten de interne R3T eenstaps RT-qPCR-kit om de RT-qPCR voor de detectie van virussen vast te stellen37. Virusdetectie, gevoeligheid, specificiteit en dynamisch bereik van onze R3T one-step RT-qPCR kit en primersets werden getest en geëvalueerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard twist synthetische RNA's. De laagste praktische detectielimiet was ongeveer 10 transcriptiekopieën per reactie. Als gevolg hiervan kunnen de interne R3T-eenstaps RT-qPCR-kit en primer-/sondesets met succes worden gebruikt en geïmplementeerd voor routinematige gelijktijdige diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Taq-polymerase-expressie en -zuivering

  1. Construeer een plasmide met een splitsbare hexa-histidine-tag aan de C-terminus van het enzym.
  2. Transformeer 50 ng van de expressievector in E. coli BL21-(DE3)-stam volgens het standaardprotocol38.
  3. Inoculeer de getransformeerde cellen in vier kolven van 6 l met elk 2 l 2YT-mediabouillon bij 37 °C en schud bij 170 omw/min totdat de OD 600 van 0,8 of celnummer 6,4 x10,8 is bereikt.
  4. Induceer Taq-polymerase-expressie met 0,5 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) en incubeer verder bij 16 °C gedurende 18 uur met schudden.
  5. Oogst de cellen door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 4 °C bij 7808 x g . Resuspendeer de pellets in 200 ml ijskoude Taq-polymeraselysisbuffer (tabel 1) in 5 ml/g celpellet.
  6. Incubeer de cellen met lysozym (2 mg/ml lysisbuffer) en proteaseremmers gedurende 45 minuten en laat het lysaat vervolgens door een celverstoorder bij 30 kPsi lopen en centrifugeer bij 22.040 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om het celafval te scheiden.
  7. Verwarm het supernatans gedurende 15 minuten op 85 °C. Centrifugeren bij 95.834 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Vang het supernatans op en filtreer het op ijs met een filter van 0,45 μm.
  8. Voer eiwitzuivering uit met behulp van Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) door het monster eerst door een Ni-NTA HP 5 ml-kolom te halen met een stroomsnelheid van 4 ml/min met behulp van Taq-polymerasebuffer A (tabel 2; Figuur 1A).
  9. Wassen met 10 kolomvolumes (CV) Taq-polymerasebuffer A en 4% Taq-polymerasebuffer B (tabel 2). Elueer het gebonden eiwit met een lineaire gradiënt met behulp van Taq-polymerasebuffer B over 20 CV in een fles van 100 ml.
  10. Laat het eluent in de fles van 100 ml door een kationenuitwisselingskolom van 5 ml lopen met een snelheid van 4 ml/min met behulp van Taq-polymerasebuffer C (tabel 2; Figuur 1A).
  11. Wassen met 20 CV 100% Taq-polymerasebuffer C en 5% Taq-polymerasebuffer D (tabel 2).
  12. Elute met een lineaire gradiënt met behulp van Taq-polymerasebuffer D (tabel 2) vanaf 5% tot 100%.
  13. Controleer de geëlueerde fracties door SDS-PAGE-gelelektroforese 39 uit te voeren, gevolgd door gelkleuring 40 zoals eerder beschreven. Neem in het kort 10 μL van elke fractie en voeg een gelijk volume van 2x SDS-laadkleurstof toe. Denatureer het monster bij 90°C gedurende 10 min. Laad de monsters op 10% SDS-PAGE gel en laat de gel 25 minuten draaien op 200 V. Kleur de gel met Coomassie Brilliant Blue en verwijder vervolgens de vlek.
  14. Verzamel alle fracties die gezuiverd Taq-polymerase bevatten en dialyseer tegen de taq-polymerase-opslagbuffer (tabel 3) bij 4 °C. Bereid kort 2 L van de opslagbuffer voor en dompel de dialysecassette 2 minuten onder in de buffer om te hydrateren. Injecteer de opgevangen fracties met een naald in de dialysecassette en laat deze een nacht in de dialysebuffer bij 200 toeren per minuut op de roerder staan.
  15. Meet na dialyse de eiwitconcentratie met behulp van een spectrofotometer, maak aliquots van 10 μL, vries vast in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    NOTITIE: Filter alle buffers voor zuivering met behulp van een filter van 0.45 μm voordat u ze in het FPLC-systeem laadt.

2. MMLV-RT-expressie in het expressiesysteem en de zuivering van insectencellen

  1. Bacmid-DNA-generatie en -isolatie
    1. Kloon de sequentie van MMLV-RT met een C-terminus splitsbare TEV-8xHis-Strep tag zoals eerder beschreven41.
    2. Meng 100 ng van de expressievector in 50 μL DH10Bac-cellen en meng voorzichtig door op de buis te tikken.
    3. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten op ijs. Geef de cellen een hitteschok gedurende 1 minuut bij 42 °C.
    4. Breng onmiddellijk over op ijs en voeg 400 μL SOC-medium toe. Incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 4 uur.
    5. plaat 10 μl en 15 μl van het mengsel op LB Agar-platen met drie antibiotica; 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 7 μg/ml gentamicine samen met 40 μg/ml IPTG en 100 μg/ml X-Gal voor blauw-witte selectie.
    6. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 °C. Kies verschillende witte kolonies en één blauwe kolonie als controle en streep ze opnieuw op verse LB-agarplaten met de bovenstaande antibiotica. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
    7. Nadat je het witte fenotype hebt bevestigd, kies je een paar kolonies en inoculeer je ze in 10 ml LB-media met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 7 μg/ml gentamicine in buisjes van 50 ml.
    8. Incubeer de cultuur bij 37 °C en schud gedurende een nacht bij 170 tpm. Pellet de cellen door ze gedurende 10 minuten op 22.040 x g te draaien.
    9. Decanteer het supernatans en resuspendeer de pellet in 250 μL resuspensieoplossing uit de miniprep-kit (deze oplossing moet worden behandeld in overeenstemming met de instructies van de fabrikant) en breng de oplossing vervolgens over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    10. Voeg 250 μL lysisoplossing toe, meng voorzichtig en incubeer gedurende 3 minuten. Voeg 350 μL neutraliserende oplossing toe, keer 2x-3x om en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 22.040 x g .
    11. Breng het supernatans over in een verse tube en voeg een gelijk volume ijskoude isopropanol toe en incubeer gedurende 30 minuten bij -20 °C.
    12. Pellet het neergeslagen DNA door gedurende 10 minuten te draaien op 22.040 x g . Gooi het supernatans weg en was de pellet met 700 μL 70% ijskoude ethanol, 2x.
    13. Verwijder het supernatans met een pipet zonder de pellet aan te raken. Laat de pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen in de laminaire stroomkap of totdat er geen vloeistof meer in de buis te zien is. Los de pellet op in 100 μL EB-buffer.
  2. Bacmidetransfectie en virusamplificatie
    1. P1 virus voorbereiding
      1. In een weefselkweekplaat met 6 putjes, zaad ~ 9 x 105 cellen/putje in 2 ml insectencelkweekmedium.
      2. Incubeer de plaat gedurende ~30 minuten bij kamertemperatuur zodat de cellen zich kunnen hechten.
      3. Bereid het bacmide/fugene-mengsel als volgt: meng 1 μg bacmide-DNA en 300 μl insectencelmedia in één buisje. Meng in een ander buisje 8 μL transfectiereagens en 300 μL insectencelmedia. Meng beide mengsels door voorzichtig te pipetteren en laat ~30 minuten bij kamertemperatuur staan om het bacmide/transfectiereagenscomplex te vormen.
      4. Voeg druppelsgewijs een bacmidecomplexmengsel (~210 μL) toe aan elk putje en sluit de plaat af met een transparante film.
      5. Incubeer de plaat 3-4 dagen bij 27 °C.
      6. Neem het medium dat het virus bevat, voeg FBS (eindconcentratie 2%) toe, filtreer met een 0,45 μm filter en bewaar bij 4°C in het donker als P1-virusvoorraad.
    2. P2-virus voorbereiding
      1. Transfecteer 50 ml insectencellen bij 2 x 106 cellen/ml met 3 ml P1-virus in een kweekkolf.
      2. Incubeer bij 27 °C met schudden bij 100 tpm gedurende 4-6 dagen tot het percentage dode cellen 25%-30% bereikt.
      3. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g en vang het supernatans op dat het virus bevat.
      4. Voeg FBS toe tot een eindconcentratie van 2%, filtreer door een filter van 0,45 μm en aliquot elk 1 ml en bewaar bij -80 °C als P2-virusvoorraad.
    3. P3 virus voorbereiding
      1. Transfecteer 100 ml insectencellen bij 2 x 106 cellen/ml met de 2 ml P2-virus in een kweekkolf.
      2. Incubeer bij 27 °C met schudden bij 100 tpm gedurende 3-4 dagen tot het percentage dode cellen 15%-20% bereikt.
      3. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en verzamel het supernatans dat het virus bevat.
      4. Voeg FBS toe tot een eindconcentratie van 2%. Filtreer door een filter van 0,45 μm. Het kan 1 maand in het donker bij 4 °C worden bewaard.
  3. Expressie en zuivering van MMLV-RT in insectencellen
    1. Voeg 5 ml P3-virus toe aan verse insectencellen met een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml (700 ml/2 l kolf) in totaal 6 kolven.
    2. Oogst de cellen na 55-60 uur posttransfectie door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren op 7808 x g.
    3. Resuspendeer de celpellets in 200 ml MMLV-RT lysisbuffer (tabel 4). Haal het lysaat door een celverstoorder bij 15 kPsi en centrifugeer bij 22.040 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    4. Breng het supernatans over in nieuwe buizen en centrifugeer het opnieuw bij 95.834 x g bij 4 °C gedurende 1 uur. Vang het supernatans op en filtreer het op ijs met behulp van een filter van 0,45 μm.
    5. Start de eiwitzuivering met behulp van FPLC door het monster eerst door de Ni-NTA Excel 5 ml-kolom (Figuur 1B) te halen met een stroomsnelheid van 4 ml/min met behulp van MMLV-RT-buffer A (tabel 5).
    6. Was de kolom met 10 CV MMLV-RT buffer A en 4% MMLV-RT buffer B (tabel 5) en elueer het eiwit met de lineaire gradiënt van MMLV-RT buffer B over 20 CV in een fles van 100 ml.
    7. Haal het geëlueerde monster door de Strep 5 ml-kolom (Figuur 1B) in evenwicht met MMLV-RT-buffer C (tabel 5).
    8. Was de kolom met 10 CV 100% MMLV-RT buffer C en eluer het eiwit met een lineaire gradiënt met 20 CV buffer D (Tabel 5).
    9. Controleer de geëlueerde breuken door SDS-PAGE uit te voeren zoals gedaan in stap 1.13.-1.14. en verzamel de fracties die gezuiverd MMLV-RT bevatten om bij 4 °C te worden gedialyseerd tegen de MMLV-RT-opslagbuffer (tabel 6).
    10. Meet de eiwitconcentratie met behulp van Nanodrop, aliquot, snap freeze in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
      NOTITIE: Filter alle buffers voor zuivering met behulp van een filter van 0.45 μm voordat u ze in het FPLC-systeem laadt.

3. Voorbereiding van in-house multiplex R3T one-step RT-qPCR kit componenten

  1. Voorbereiding buffermix
    1. Bereid de 2x-buffer voor op de RT-qPCR-reactie die de eerder in37 getoonde reagentia bevat. Bereid alle reagentia in DNase/RNase-vrij water en het buffermengsel in een vriezer van -20 °C.
  2. Primer en sonde Sets en primers mengselvoorbereiding
    OPMERKING: De gebruikte sondes en primers staan vermeld in tabel 7. De Influenza en SARS-CoV-2 multiplexed kit bevat 3 sondes en 4 voorwaartse en achterwaartse primersets. De sondes zijn aan de 5′-uiteinden gelabeld met reporters 6-carboxyfluoresceïne (FAM) voor InfA, Texas Red-XN voor SARS-CoV-2 (N-gen) en Yakima Yellow voor InfB. De MERS-CoV en SARS-CoV-2 multiplexed kit bevat 3 sondes en 3 voorwaartse en achterwaartse primersets. De sondes zijn ook gelabeld aan de 5′-uiteinden met behulp van reporters Texas Red-XN voor MERS-CoV (ORF1a-gen), VIC voor MERS-CoV (UpE-gen) en 6-carboxyfluoresceïne (FAM) SARS-CoV-2 (N-gen).
    1. Maak een primermengsel met alle primers en sondes vermeld in tabel 7 met een eindconcentratie van 6,7 μM voor elke voorwaartse en achterwaartse primer en 1,25 μM voor elke sonde in een buis van 1,5 ml. Bewaar de primermix in de vriezer van -20 °C. Gebruik elutiebuffer om het vereiste volume aan te vullen.
  3. Bereiding van enzymenmix
    1. Bereid Taq-polymerase (30 E/μL) en MMLV-RT (60 ng/μL) enzymmengsel in de Taq-polymeraseopslagbuffer zoals weergegeven in tabel 3 om het vereiste volume te vormen. Voer deze stap uit op ijs en bewaar het enzymmengsel bij -20 °C.
  4. RNA-sjabloon
    1. Resuspendeer synthetische RNA's van SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B en MERS-CoV afzonderlijk in 100 μL 1x Tris-EDTA-buffer (10 mM Tri-Cl en 1 mM EDTA (pH 8,0) om een voorraad van 1 x 106 RNA-kopieën/μL te maken.
    2. Meng synthetische RNA's voor RT-qPCR in de volgende configuraties: 1) SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B door 5 μL van elke virusvoorraad toe te voegen aan het volume van 50 μL om 1 x 105 RNA-kopieën/μL te maken; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV door 5 μL van elke virusvoorraad toe te voegen aan een volume van 50 μL om 1 x 105 RNA-kopieën/μL te maken. Maak 10-voudige seriële verdunningen van elk synthetisch RNA-mengsel, variërend van 1 x 105 RNA-kopieën/μL tot 10 RNA-kopieën/μL.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u ijskoud DNase/RNase-vrij water gebruikt om de seriële verdunning van de sjablonen voor te bereiden.

4. Interne gemultiplexte SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en SARS-CoV-2-, MERS-CoV-eenstaps RT-qPCR-test

OPMERKING: Desinfecteer de oppervlakken van het werkstation en gebruik een plaatsjabloon met 96 putjes om de lay-out van de PCR-plaat te plannen.

  1. Bereiding van een plaat met 96 putjes
    1. Ontdooi 2x buffer en primer mix. Bewaar het enzymmengsel op ijs.
    2. Voeg aan elk putje 10 μL 2x buffermix, 1,5 μL van de primermix, 1 μL enzymmix, 6,5 μL DNase/RNasevrij water en 1 μL corresponderend RNA-mengsel toe dat moet worden getest. Het uiteindelijke volume in elk putje is 20 μL. Raadpleeg de voorbereide lay-out voor hulp bij deze stap.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een mastermix te maken op basis van het aantal reacties dat alle reagentia behalve het RNA-monster bevat om pipetteerbias te voorkomen. Voer bovendien de reacties in tweevoud of drievoud uit om technische fouten te voorkomen.
    3. Sluit de plaat af met een zelfklevende PCR-plaatafdichting en centrifugeer kort gedurende 1 minuut om alle vloeistof op de bodem van de plaat op te vangen. Zorg ervoor dat elk putje hetzelfde vloeistofvolume heeft en vrij is van luchtbellen voordat u de monsters overbrengt naar de qPCR-machine.
      OPMERKING: Alle PCR-reacties moeten op ijs worden ingesteld.
  2. PCR-programma
    1. Open het real-time qPCR-machineprogramma en kies de volgende experimentele eigenschappen:
      Het bloktype: Snel 96-wells (0,1 ml)
      Experimentinstellingen: Standaardcurve
      Reagentia: TaqMan-reagentia
      Eigenschappen uitvoeren: Standaard.
    2. Definieer alle gendoelwitten en hun reporterkleurstof zoals weergegeven in tabel 7. Definieer bovendien monsternamen voor elke te testen reactie om de analyse van de amplificatiecurven te vergemakkelijken.
    3. Wijs doelen en monsters toe aan de plaatlay-out van het programma op basis van de plaat met 96 putjes.
    4. Stel het volgende cyclusprogramma in het PCR-instrument als volgt in:
      55 °C gedurende 10 min
      40 cycli: 94 °C gedurende 1 min
      94 °C gedurende 10 s
      68 °C gedurende 10 s
      68 °C gedurende 20 s; hier fluorescentie verwerven.
    5. Breng de plaat over naar de real-time qPCR-machine en plaats deze in de houder, zorg voor de juiste oriëntatie van de plaat en start de run.
    6. Kies de bestandslocatie om de experimentele gegevens op te slaan.
  3. Data-analyse
    1. Het is essentieel om eerst de amplificatieplots te onderzoeken die door het qPCR-programma worden geproduceerd. Analyseer de detectielimiet om de minimale RNA-concentratie te beoordelen die kan worden gedetecteerd.
    2. Plot het logboek van het RNA-kopienummer op de x-as en de bijbehorende gemiddelde Ct-waarde op de y-as om de gevoeligheid van de test te beoordelen. De helling en de R2 geven de betrouwbaarheid en efficiëntie van de reactie aan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de diagnostische benadering voor het detecteren van veel voorkomende respiratoire virussen met behulp van PCR-benaderingen 21,22,23,24,25. Ondanks deze vooruitgang is de multiplex-benadering, die het mogelijk maakt om meerdere virussen in één test te detecteren, echter niet op grote schaal geïmple...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is wereldwijd een zware economische last voor het gezondheidszorgsysteem als gevolg van de hoge infectie- en sterftecijfers als gevolg van de verspreiding van veel voorkomende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV-varianten 12,19,20. Gemotiveerd door het verantwoordelijkheidsgevoel om deze last te verlichten, realiseerden we ons de noodzaak van een snelle, nauwkeurige en toegankelijke diagnostische...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology door middel van kernfinanciering en de National Term Grand Challenge (NTGC) aan SMH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450(2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1(2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3(2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101(2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335(2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960(2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867(2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295(2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328(2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129(2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830(2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042(2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412(2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151(2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634(2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplex RT qPCRReal time PCRSARS CoV 2 detectieInfluenza A detectieInfluenza B detectieMERS CoV detectieassay voor respiratoire virussenvirale RNA detectieTaq polymerase96 wells plaat

Gerelateerde artikelen