Methodenartikel

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65828

⸱

25 augustus 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

Samenvatting

ATP-bindende cassette (ABC)-transporters vormen in lipiden ingebedde membraaneiwitten. Het extraheren van deze membraaneiwitten uit de lipidedubbellaag naar een waterige omgeving wordt meestal bereikt door gebruik te maken van wasmiddelen. Deze wasmiddelen desintegreren de lipide dubbellaag en lossen de eiwitten op. De intrinsieke habitat van membraaneiwitten in de lipidedubbellaag vormt een uitdaging bij het handhaven van hun stabiliteit en uniformiteit in oplossing voor structurele karakterisering. Bicellen, die bestaan uit een mengsel van fosfolipiden met een lange en korte keten en wasmiddelen, repliceren de natuurlijke lipidenstructuur. Het gebruik van lipidebicellen en detergenten dient als een geschikt modelsysteem voor het verkrijgen van hoogwaardige diffractiekristallen, met name om de hogeresolutiestructuur van membraaneiwitten te bepalen. Door deze synthetische micro-omgevingen behouden membraaneiwitten hun oorspronkelijke conformatie en functionaliteit, waardoor de vorming van driedimensionale kristallen wordt vergemakkelijkt. Bij deze benadering werd het in detergent opgeloste heterodimeer ABCG5/G8 gereïntegreerd in DMPC/CHAPSO-bicellen, aangevuld met cholesterol. Deze opstelling werd gebruikt in de experimentele procedure voor dampdiffusie voor eiwitkristallisatie.

Inleiding

ATP-bindende cassette (ABC)-transporters vormen een superfamilie van membraaneiwitten die verantwoordelijk zijn voor diverse ATP-afhankelijke transportprocessen over biologische membranen 1,2,3,4,5. Deze transporteiwitten zijn betrokken bij hart- en vaatziekten en spelen een belangrijke rol bij het vergemakkelijken van de uitstroom van cholesterol naar de gal voor latere uitscheiding in de lever. Bijgevolg hebben het cholesterolmetabolisme en de balans in de loop der jaren veel belangstelling gewekt6. Een specifiek mechanisme dat betrokken is bij de eliminatie van cholesterol en andere sterolen uit het lichaam betreft leden van de menselijke ABCG-subfamilie, met name het heterodimeer ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutaties in een van deze genen verstoren het heterodimeer, wat leidt tot functieverlies en sitosterolemie veroorzaakt, een aandoening die het sterolverkeer beïnvloedt11,12,13. Gezien de relevantie van de ziekte en hun rol bij het bevorderen van cholesteroluitvloeiing, hebben steroltransporters veel aandacht getrokken. Desalniettemin blijven de ingewikkelde details van hun moleculaire mechanisme en substraatselectiviteit grotendeels onbekend. De opheldering van de kristalstructuur van ABCG5/G8 is dus een cruciale stap in de richting van het begrijpen van de mechanismen en stroomafwaartse functies in het cholesteroltransport.

Membraaneiwitten moeten in membranen worden verankerd om te vouwen en correct te functioneren. Bijgevolg resulteert het extraheren van membraaneiwitten uit hun natuurlijke omgeving vaak in eiwitinstabiliteit, misvouwing en functieverlies14,15. Deze uitdagingen onderstrepen de belangrijkste hindernissen bij de kristallisatie van membraaneiwitten. De reconstitutie van eiwitten tot synthetische detergentdubbellagen, zoals bicellen, is echter naar voren gekomen als een oplossing voor deze hachelijke situatie, waardoor membraaneiwitten in stand kunnen worden gehouden in een inheems-achtig dubbellaags milieu16. Bicellen zijn assemblages van synthetische fosfolipiden en wasmiddelen die zijn gesuspendeerd en opgelost in water. Ze nemen met name een dubbellaagse structuur aan die biologische membranen nabootst16,17,18. Bicellen kunnen overgaan tussen vloeistof- en gelfasen op basis van temperatuur en viscositeit. Bicelle-kristallisatie maakt gebruik van de kleine dubbellaagse schijven en de lage viscositeit bij verlaagde temperaturen, waardoor een grondige menging van eiwitten en bicelle-oplossingen mogelijk wordt. De grootte van de bicellen is afhankelijk van de wasmiddel-lipidenverhouding tijdens de bereiding19,20. De meest voorkomende reinigingsmiddelen voor de vorming van bicellen zijn 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propaansulfonaat (CHAPSO), samen met 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaat (CHAPS) en 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-fosfocholine (DHPC)21. Deze wasmiddelen worden gebruikt in combinatie met lipiden zoals di-myristoyl-fosfatidylcholine (DMPC) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylcholine (POPC). Bovendien hebben recente studies de volledige functionaliteit van membraaneiwitten in bicellen onder fysiologische omstandigheden aangetoond. Lee en collega's hebben bijvoorbeeld met succes de kristalstructuur van ABCG5/ABCG8 gekristalliseerd en gerapporteerd op basis van een lipide dubbellaag22,23. In het kristallisatieproces kunnen eiwit-bicellemengsels worden ondergebracht met behulp van standaardapparatuur, waaronder kristallisatierobots met hoge doorvoer24. De haalbaarheid van het gebruik van bicellen hangt echter af van de thermostabiliteit van de eiwitten vanwege de kristallisatieomstandigheden bij hogere temperaturen. Niettemin blijven in vergelijking met andere technieken de vereiste kristallisatieomstandigheden voor membraaneiwitten over het algemeen mild, met lage concentraties neerslag, zout en buffer. Dit maakt zowel eiwit-bicellemengsels als dampdiffusie effectieve en gemakkelijk implementeerbare hulpmiddelen voor structurele studies van membraaneiwitten.

Dit protocol schetst essentiële stappen in eiwitbereiding en bicellekristallisatie voor het bepalen van de röntgenkristalstructuur van ABCG5/G8 bij hoge resolutie (Figuur 1).

Protocol

1. Klonen en eiwitexpressie

  1. Kloon het menselijke ABCG5/G8-gen in Pichia pastoris-gist volgens eerdere protocollen25,26. Leid in het kort pSGP18- en pLIC-expressievectoren af van pPICZB. Voeg een tag toe die codeert voor een rhinovirus 3C-proteaseplaats gevolgd door een calmodulinebindend peptide (CBP) aan de C-terminus van ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. Voeg een zes-histidine-tag gescheiden door een glycine(His 6 GlyHis6) toe aan de C-terminus van ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). Co-transformeer de plasmiden in Pichia-stam KM71H met behulp van elektroporatie.
      OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de details van de gebruikte plasmiden, media en buffers.
    2. Kweek getransformeerde gistcellen op MD-agarplaten bij 28 °C.
  2. Selecteer na 1-2 dagen 10-12 kolonies en inoculeer ze in 10 ml minimale glycerolgiststikstofbasis (MGY) media met behulp van centrifugebuisjes van 50 ml voor kleinschalige kweek.
    1. Maak drie kleine gaatjes in het deksel van de centrifugebuis voor een betere beluchting. Laat cellen groeien bij 28 °C met constant schudden bij 250 tpm totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) 10 bereikt, meestal 1-2 nachten.
      OPMERKING: Celgroei duurt meestal tussen de 12-24 uur.
  3. Neem de volgende dag 1 l steriele MGY-media en inoculeer deze met de primaire cultuur in een kolf van 2,4 l. Incubeer de kolf bij 28 °C in een schudincubator bij 250 omw/min gedurende 24 uur.
    1. Om de pH tussen 5-6 te houden, voegt u 10% ammoniumhydroxide (NH4OH) toe totdat de pH stabiliseert.
  4. Pas de pH aan en induceer eiwitexpressie door 1 ml pure methanol per 1 L-cultuur (0,1% (v/v) methanol) toe te voegen.
    OPMERKING: Voer de cellen vervolgens elke 12 uur met 5 ml pure methanol per liter cultuur (0,5 % (v/v) methanol) gedurende een totale duur van 36-48 uur.
  5. Oogst de cellen door te centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  6. Verzamel celpellets en resuspendeer ze in lysisbuffer (0,33 M sucrose, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M aminohexaanzuur, 1 mM EDTA en 1 mM EGTA) tot een concentratie van 0,5 g/ml. Bewaar de suspensie bij -80 °C. Doorgaans kan men 30 ± 5 g celmassa terugwinnen uit 1 L gekweekte cellen.
    OPMERKING: Bewaar celpellets direct in de vriezer of voer onmiddellijke resuspensie uit in lysisbuffer voor membraanpreparaten.

2. Voorbereiding van microsomaal membraan

  1. Ontdooi de cellen en voeg proteaseremmers toe (2 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml pepstatine A, 2 mM PMSF, zie materiaaltabel).
    1. Om cellen verder te lyseren, gebruikt u een ijsgekoelde emulgator of microfluïdizer (zie Materiaaltabel) bij 25.000-30.000 psi. Herhaal dit proces 3-4 keer.
    2. Centrifuge om celresten te verwijderen: centrifugeer op 3.500-4.000 x g gedurende 15 minuten, gevolgd door een tweede centrifuge op 15.000 x g gedurende 30 min. Houd beide centrifuges op 4 °C.
  2. Om microsomale membraanblaasjes te isoleren, brengt u het supernatans over in ultracentrifugebuisjes en onderwerpt u het gedurende 1,5 uur bij 4 °C aan ultracentrifugatie bij 2,00.000 x g .
    1. Resuspendeer de membraanpellet in 50 ml Buffer A (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl en 10% glycerol) met behulp van een dounce-homogenisator. Bewaar de suspensie bij -80 °C.

3. Eiwitbereiding - zuivering van heterodimeren

  1. Ontdooi de bevroren microsomale membranen en pas de concentratie aan tot 4-6 mg/ml met behulp van een oplosbare buffer. De buffer moet 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1% (m/v) β-dodecylmaltoside (β-DDM), 0,5% (m/v) cholaat, 0,1% (m/v) cholesterylhemisuccinaat (CHS), 5 mM imidazool, 5 mM β-mercaptoethanol (β-ME), 2 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml pepstatine A en 2 mM PMSF bevatten (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Men kan gelijke volumes van het membraanpreparaat en de oplosbaarheidsbuffer mengen, of 2x oplosbaarheidsbuffer gebruiken zonder proteaseremmers en reductiemiddelen. Kort koken van de buffer helpt CHS efficiënt op te lossen. Gebruik voor de zuivering alleen de 4 °C-gekoelde buffer.
    1. Roer het mengsel op gemiddelde snelheid gedurende 1 uur bij 4 °C. Volg dit met extra roeren op kamertemperatuur (RT) gedurende 20-30 minuten.
    2. Centrifugeer het mengsel bij 1,00,000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om onoplosbare membranen te verwijderen. Vang het opgeloste supernatans op en voeg 20 mM imidazol en 0,1 mM TCEP toe.
  2. Voer affiniteitskolomchromatografie26 uit: bind het opgeloste supernatans 's nachts aan vooraf gebalanceerde Ni-NTA-korrels (10-15 ml) (zie materiaaltabel) in buffer A (stap 2.2.1).
    OPMERKING: Vermijd vanaf dit punt het gebruik van glycerol in lopende buffers.
    1. Was de kolom tweemaal met 10 kolomvolumes buffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (m/v) β-DDM, 0,05 % (m/v) cholaat, 0,01 % (m/v) CHS, 0,1 mM TCEP) met 25 mM imidazool.
    2. Was de kolom met 10 kolomvolumes buffer B met 50 mM imidazool.
    3. Elueer het eiwit met behulp van buffer C (buffer B met 200 mM imidazool).
    4. Voeg 1 mM TCEP (zie materiaaltabel) en 10 mM MgCl2 toe aan de geëlueerde eiwitten.
    5. Valideer de geëlueerde fracties op een SDS-PAGE-gel om de juiste eiwitgrootte26 te bevestigen.
      OPMERKING: Typische eiwitopbrengst (1st Ni-NTA): 10-20 mg eiwit per 6 L cultuur. Gebruik DDM in een dosis van 10x of 5x van de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,01%. Dit protocol maakt gebruik van 0,1% DDM.
    6. Verdun de piekfracties van Ni-NTA-elutie met een gelijk volume buffer D1 (buffer B met 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), meng en laad de eiwitfracties op een CBP-kolom (3-5 ml) (zie materiaaltabel) die vooraf is geëgaliseerd met CBP-wasbuffer D1.
    7. Voer opeenvolgende wasbeurten uit op de CBP-kolom om wasmiddelen uit te wisselen met behulp van buffer D1 en D2 (buffer B met 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0,1% (m/v) decylmaltose-neopentylglycol (DMNG), zonder β-DDM): eerst wassen met 3 kolomvolumes D1; ten tweede, wassen met 3 kolomvolumes van D1:D2 (3:1, v/v); ten derde, wassen met 3 kolomvolumes D1:D2 (1:1, v/v); vierde stap, wassen met 3 kolomvolumes van D1:D2 (1:3, v/v), gevolgd door 6-10 kolomvolumes van D2.
    8. Elueer het eiwit met behulp van CBP wash Buffer D2 met 300 mM NaCl in fracties van 1 ml uit de CBP-kolom (totaal 10 ml). Concentreer de geëlueerde fracties tot 1-2 ml.
      OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (1eCBP ) is 5-15 mg eiwit per 6 L-cultuur. Maltose neopentylglycol (MNG) reinigingsmiddelen verbeteren de opslag van gezuiverde eiwitten bij 4 °C. Zowel DMNG als Lauryl MNG (LMNG) werden gebruikt, waarbij DMNG betere röntgendiffracterende kristallen opleverde. Gebruik DMNG in een dosis van 10-20x de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,003%. Dit protocol gebruikte 0,1% DMNG. Een fractie van het CBP-eluaat kan verder worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie (stap 4.4.) om de ATPase-activiteit van eiwitten te analyseren of de monodispersiteit te beoordelen door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).

4. Eiwitbereiding-pre-kristallisatiebehandeling

  1. Splits de N-gebonden glycanen en CBP-tags met respectievelijk endoglycosidase H (Endo H, ~0,2 mg per 10-15 mg gezuiverd eiwit) en HRV-3C-protease (~2 mg per 10-15 mg gezuiverd eiwit) (zie Tabel met materialen). Incubeer een nacht bij 4 °C.
  2. Voer tijdens de incubatie van Endo H- en 3C-protease reductieve alkylering uit op de gepoolde eiwitten. Begin met incubatie met 20 mM jodoacetamide (zie materiaaltabel) gedurende een nacht bij 4 °C. Volg dit met een incubatie van 1 uur met nog eens 2 mM jodoacetamide op ijs.
    OPMERKING: Deze stap stabiliseert de eiwitopslag verder gedurende maximaal een maand bij 4 °C.
  3. Gebruik een tweede CBP-kolom (1-2 ml) om de gespleten CBP-tag te scheiden. Gebruik hiervoor Buffer D2.
    OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (2eCBP ) is 5-10 mg eiwit per 6 L-cultuur.
  4. Zuiver het CBP-tagvrije eiwit met behulp van gelfiltratiechromatografie. De buffer moet 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% (m/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat en 0,01% (w/v) CHS bevatten.
    OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (gelfiltratie) is 2-8 mg eiwit per 6 L-cultuur. Tijdens deze stap duidt de afwezigheid van een DDM-piek (~65 kD) tijdens gelfiltratie op een succesvolle uitwisseling van reinigingsmiddel naar DMNG.
  5. Wijzig de gepoolde eiwitfracties door reductieve methylering: voeg 20 mM dimethylamineboor (DMAB, zie Materiaaltabel) en 40 mM formaldehyde toe aan het eiwit. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C op een oscillerende schudder. Voeg 10 mM DMAB toe.
    1. Herhaal stap 4.5, inclusief de toevoeging van 10 mM DMAB, en incubeer 's nachts (12-18 uur) bij 4 °C.
    2. Stop de reactie door 100 mM Tris-Cl, pH 7,5 toe te voegen.
  6. Laad het gemethyleerde eiwit op een Ni-NTA-kolom van 2 ml die vooraf is gebalanceerd met 100 mM Tris-Cl, pH 8.0 en 100 mM NaCl.
    1. Was de kolom met 10 kolomvolumes wasbuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, met 0,5 mg/ml DOPC: DOPE (3:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat, 0,01% (w/v) CHS).
    2. Elute het gerelipideerde eiwit met behulp van elutiebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazool, 0,5 mg/ml DOPC: DOPE (1:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat, 0,01% (w/v) CHS).
      OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (2nd Ni-NTA) is 1-5 mg eiwit per 6 L-cultuur.
    3. Haal het eiwit eluaten door een PD-10 ontziltingskolom die vooraf in evenwicht is gebracht met de buffer die in stap 4.4 is gebruikt.
  7. Incubeer het ontzoute en gerelipideerde eiwit 's nachts met cholesterol (bereid in isopropanol of ethanol) tot een eindconcentratie van ~20 μM.
    1. Verwijder de volgende ochtend het neerslagmiddel door middel van ultracentrifugatie bij 1,50,000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel de supernatant.
    2. Concentreer het eiwit tot een eindconcentratie van 30-50 mg/ml met behulp van een centrifugaalconcentrator met een 100 kDa cutoff-centrifugaalconcentrator.
    3. Verwijder het neerslagmiddel met behulp van een gekoelde tafelcentrifuge op topsnelheid gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    4. Houd het supernatans op ijs bij 4 °C en breng kristallisatiecondities in de bicelles tot stand.
      OPMERKING: De geconcentreerde eiwitten moeten binnen een week worden gebruikt voor kristalgroei. Vries de eiwitten niet in.

5. Eiwitkristallisatie in bicellen

  1. Bereid een 10% bicelle-stockoplossing met DMPC-lipiden en CHAPSO-wasmiddel in een verhouding van 3:1 (w/w) (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik CHAPSO bij 5x de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,5%. Hierdoor blijft de concentratie van het wasmiddel rond de CMC in het eiwit-bicellemengsel behouden (stap 5.2).
    1. Voeg gedeïoniseerd H2O-opgelost wasmiddel (CHAPSO) toe aan voorgedroogde lipiden (mengsel van 5 mol% cholesterol en 95 mol% DMPC).
      OPMERKING: Bereid verschillende lipidesamenstellingen in chloroform en droog ze in een glazen reageerbuis met behulp van een stikstofgasstroom bij RT. Verwijder resterende oplosmiddelen door ze een nacht in een vacuümkamer te plaatsen en een dunne lipidenlaag te vormen.
    2. Resuspendeer lipiden en wasmiddel met behulp van een waterbadsonicator.
    3. Sonificeer het bicellemengsel in ijsgekoeld water met continu vermogen totdat de oplossing transparant wordt.
      NOTITIE: Gebruik gehoorbescherming en zorg voor voldoende ijstoevoer om het mengsel in een vloeibare fase te houden.
    4. Verwijder onopgeloste componenten met een centrifugaalfilter van 0,2 μm (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Bewaar de gealiquoteerde bicelle-oplossing bij -80 °C.
  2. Maak een eiwit/bicelle-mengsel op ijs door voorzichtig 10% bicelles (stap 5.1.4) en eiwitten (stap 4.7.4) te combineren in een verhouding van 1:4 (v/v), waardoor een uiteindelijke eiwitconcentratie tussen 5-10 mg/ml wordt bereikt.
  3. Incubeer het eiwit- en bicellemengsel gedurende 30 minuten op ijs.
  4. Stel kristallisatiecondities in een hangend druppeldampdiffusieformaat in met behulp van platen met 48 putjes.
    1. Meng gelijke volumes (0,5 of 1 μL) eiwit/bicellemengsel en kristallisatiereservoiroplossing met 1,6 M-2,0 M ammoniumsulfaat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 en 1 mM TCEP (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Maak voorafgaand aan elk experiment een matrix van de reservoiroplossing, waarbij ammoniumsulfaat (1,6-2,0 M) en PEG 400 (0%-4%) worden aangepast.
    2. Incubeer voor kristallisatie bij 20 °C.
    3. Controleer de kristallisatietrays de volgende dag om er zeker van te zijn dat het afdekglas goed is afgesloten.
    4. Controleer de kristalgroei minstens één keer per dag. Kristallen van hoge kwaliteit verschijnen meestal binnen 1-2 weken, met afmetingen van 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.
      OPMERKING: Bij lagere eiwitconcentraties kan het langer duren voordat kristallen zich vormen. Rijpe kristallen moeten binnen een maand worden geoogst.
    5. Week eiwitkristallen in 0,2 M natriummalonaat en vries ze snel in vloeibare stikstof in met behulp van cryolussen van 50 of 100 μm.
      OPMERKING: Als er een röntgendiffractometer beschikbaar is, test dan een paar kristallen met een blootstelling van 15-30 minuten aan de röntgenstraal om diffractie tot 5 Å aan het licht te brengen. Diffractie met een hogere resolutie vereist een synchrotronlichtbron. Met behulp van 0,2 M natriummalonaat als cryo-protectant kan een kristal van 100 μm x 50 μm x 2 μm ongeveer 90 diffractiebeeldframes leveren met synchrotron-röntgenstraling.

Resultaten

Recombinante ABC-halftransporters, humaan ABCG5 en ABCG8, worden samen tot expressie gebracht in Pichia pastoris-gist . De gistmembraanfractie wordt vervolgens gefractioneerd door middel van centrifugeren. Zoals beschreven in dit protocol, worden de heterodimere eiwitten geëxtraheerd met behulp van tandemkolomchromatografie. Vervolgens worden chemisch voorbehandelde eiwitten gekristalliseerd door ze te incuberen met fosfolipide/cholesterolbicellen. Schematische overzichten van de zuiverings- en kristallisatieprocessen zijn weergegeven in figuur 1.

Om de monodispersiteit van de gezuiverde eiwitten te beoordelen, worden monsters met 0,01-0,05 mg/ml eiwitten gekleurd met 1%-2% uranylacetaat. Deze monsters worden vervolgens onderzocht met behulp van TEM met negatieve kleuring (figuur 2A). Om de stabiliteit van eiwitten te evalueren zonder vries-dooicycli te ondergaan, wordt analytische gelfiltratiechromatografie gebruikt. Deze analyse omvat het monitoren van de tijdverloopopslag van gezuiverde eiwitten door het gebruik van kleine aliquots van de eiwitten met een gelijk volume (figuur 2B). Na een week incubatie bij 4 °C kan er een licht eiwitverlies optreden bij de piekfracties, mogelijk als gevolg van resterende oplosbare eiwitaggregaten. Desalniettemin blijft de totale eiwitopbrengst voldoende voor kristalgroei. Het gebruik van negatieve kleurings-TEM en analytische gelfiltratiechromatografie is een standaardpraktijk om de geschiktheid van eiwitten voor kristallisatie te beoordelen, met name van verschillende gemanipuleerde constructies.

Voor de beoordeling van de eiwitkwaliteit in elke stap van het kolomchromatografieproces, evenals na de chemische prekristallisatiebehandeling, worden aliquots van fracties die overeenkomen met twee Ni-NTA-kolommen, twee CBP-kolommen, één gelfiltratie en reductieve alkylering op een 10% SDS-PAGE-gel geladen (Figuur 3). Bovendien kan dezelfde reactieomgeving die wordt gebruikt voor alkylering worden toegepast voor kwiketikettering met ethylkwik (EMTS), hoewel dit buiten het bestek van de huidige studie valt.

De groei van kristallen wordt dagelijks gecontroleerd met behulp van een stereomicroscoop op tafel die is uitgerust met een polarisator. Kristallen die rijp zijn en geschikt zijn voor gegevensverzameling, bereiken over het algemeen afmetingen van 50 μm x 100 μm x 2 μm (Figuur 4). Tijdens het kristaloogstproces worden kleinere kristallen of clusters bewust vermeden.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische overzichten voor zuivering (A) en bicellekristallisatie (B) van heterodimeer ABCG5/G8. Constructen van recombinant humaan ABCG5 (hG5) en ABCG8 (hG8) dragen respectievelijk RGS-H 6-G-H6 en 3C-CBP-tags (A, boven). Tandem affiniteitskolomchromatografie, gevolgd door gelfiltratiechromatografie om heterodimeerzuivering te bereiken (A, onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Evaluatie van monodispersiteit (A) en stabiliteit (B) van gezuiverde eiwitten . (A) Elektronenmicrofoto van negatief gekleurde ABCG5/G8 (G5G8) heterodimeren met behulp van TEM. Representatieve deeltjes worden gemarkeerd in effen witte cirkels. Schaalbalk = 100 nm. (B) Gealkyleerde eiwitten opgeslagen bij 4 °C, geanalyseerd door middel van analytische gelfiltratiechromatografie in de loop van een maand, met een licht verlies van eiwitten na een week. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: SDS-PAGE-analyse van eiwiteluaten van kolomchromatografie en reductieve alkylering. Verschillende volumes (1-10 μL) eiwitfracties werden op een 10% Tris/Glycine-gel geladen en gedurende 45 minuten gedraaid op een constante spanning van 200 V. De gel was gekleurd met Coomassie-blauw, bevlekt, aan de lucht gedroogd en gescand door een tafelscanner. 1° & 2° Ni: eerste en tweede Ni-NTA-kolom; 1° & 2° CBP: eerste en tweede CBP-kolom; Piekfracties massieve lijn: gepoolde fracties voor kristallisatie; Piekbreuken stippellijn: schouderfracties; EMTS: ethylkwikthiosalicynaat; IA: iodoacedamide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Beoordeling van de rijping van eiwitkristallen door middel van lichtmicroscopie. Rijpe kristallen van ABCG5/G8 uit een kristallisatiedruppel werden gevisualiseerd onder een tafelblad en een met polarisator uitgeruste stereomicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De uitdagingen die gepaard gaan met het kristalliseren van membraaneiwitten hebben geleid tot de ontwikkeling van lipide-dubbellaag-gedreven kristallisatiemethoden, zoals de bicelle27 - of lipide kubische fase (LCP)14-benaderingen . Het bereiken van succesvolle kristallisatie van membraaneiwitten hangt echter nog steeds af van de kritieke en soms knelpuntstap van eiwitbereiding. Met name ABC-transporters vormen een formidabele hindernis bij het kweken van kristallen die geschikt zijn voor röntgenkristallografie. Dit protocol biedt uitgebreide praktische richtlijnen voor het stroomlijnen van de bereiding van de humane ABCG5/G8-steroltransporter en het bevorderen van kristalgroei door middel van de bicellekristallisatiebenadering.

Een belangrijke overweging bij het opstellen van dit protocol was de noodzaak van een substantiële eiwitopbrengst in de beginfasen van eiwitzuivering, waardoor een zekere mate van eiwitverlies mogelijk is tijdens de pre-kristallisatiebehandeling (Figuur 3). Gemeenschappelijke strategieën om deze uitdaging aan te pakken zijn onder meer uitgebreide eiwitengineering, het gebruik van verschillende expressiegastheren en verkenning van orthologen of homologen . Desalniettemin zijn er met deze ogenschijnlijk ingewikkelde procedure een aantal cruciale stappen geïdentificeerd die het succes van het protocol ondersteunen en ook inzicht geven in mogelijke beperkingen die zich kunnen voordoen bij het bestuderen van andere ABC-transporters of membraaneiwitten in het algemeen.

Ten eerste maakt dit protocol bij elke stap gebruik van grondige centrifugatie om eiwitaggregatie te minimaliseren. Daarnaast is continue monitoring van de thermostabiliteit van de gezuiverde eiwitten cruciaal. Elektronenmicroscopie wordt gebruikt om de monodispersiteit van eiwitten te verifiëren, terwijl analytische gelfiltratie de eiwitstabiliteit in de loop van de tijd volgt (Figuur 2). Alternatieve technieken zoals circulair dichroïsme (CD) of differentiële scanningcalorimetrie (DSC) kunnen ook worden gebruikt. Bovendien is de opname van lipiden in specifieke stadia essentieel om zowel de activiteit als de kristallogenese van het gezuiverde ABCG5/G8 te maximaliseren. Cholaat en CHS zijn bijvoorbeeld nodig om meetbare ATP-hydrolyse aan te tonen; fosfolipiden zijn onmisbaar voor het behoud van de stabiliteit van gemethyleerde eiwitten; en cholesterol is een vereist bestanddeel van de bicelle-oplossing, waardoor kristalgroei wordt bevorderd die geschikt is voor röntgendiffractie met hoge resolutie (figuur 4).

In wezen kan de hele procedure binnen een week worden uitgevoerd. In tegenstelling tot LCP is het ophalen van kristallen uit hangende druppelkristallisatietrays eenvoudig. Vooruitkijkend, met een substantiële eiwitopbrengst (ongeveer 10 mg), is dit protocol gemakkelijk aan te passen voor het ontwikkelen van kristallografisch onderzoek met ABCG5/G8-mutanten of andere transporteiwitten. Dit is met name relevant voor gevallen die momenteel visualisatie door middel van elektronenmicroscopie ontwijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) en een Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) aan JYL. Dit protocol is gebaseerd op de originele rapporten in ABCG5/G8 kristalstructuren die eerder zijn gerapporteerd door Farhat et al.22 en Lee et al.23.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ABCG5National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022436
ABCG8National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system Cytiva (voorheen GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2Wisent600-024-CGAnhydrous
CBPAgilent214303Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin)Sartorius
CHAPSO AnatraceC317Anagrade
CholesterolAnatraceCH200
CHSSteraloidsC6823-000
DMABMilliporeSigma18023897%
DMNGAnatraceNG322
DMPCAnatraceD514
DOPCAvanti850375
DOPCAnatraceD518
DOPEAvanti850725
DTTFisherBP172
Dual Thickness MicroLoopsMiTeGen
EDTABioShopEDT003Disodium salt, dihydrate
EGTAMilliporeSigma324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3)Avestin
Endo HNew England BiolabsP0702
EthanolGreenfieldP016EAANEthyl Alcohol Anhydrous
FormaldehydeMilliporeSigma252549ACS Reagent
GlycerolBioShopGLY004
HEPESBioShopHEP001
HRV-3C proteaseHomemade
ImidazoleBioShopIMD510Reagent grade
IodoacetamideMilliporeSigmaI1149BioUltra
IsopropanolFisherBP2618212
LeupeptinBioShopLEU001
MESMilliporeSigma69892BioUltra
MethanolFisherA412P
MgCl2Wisent800-070-CGHydrated
microfluidizer (LM 20)Microfluidics
NaClBioShopSOD002
NH4OHFisherA669-212ACS Reagent
Ni-NTA superflowQiagen30430Nickel-charged resins
PEG 400MilliporeSigma202398
PepstatinBioShopPEP605
PMSFMilliporeSigmaP7626
pSGP18 and pLIC Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDSBioShopSDS003
Sodium cholateFisher229101
Sodium malonateMilliporeSigma63409
SucroseWisent800-081-WGUltra pure
Superdex 200 30/100 GLCytiva (voorheen GE Healthcare Life Sciences)28990944Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEMFEI, Technai
Tris BaseFisherBP152
β-DDMAnatraceD310SSol Grade
β-mercaptoethanolMilliporeSigma
ε-aminocaproic acidFisherAAA1471936

Referenties

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054(2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478(2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795(2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ABCG5 G8 transporterlipidische bicelkristallisatiemembraaneiwitstructuurATP bindend cassetteeiwitzuiveringdetergent solubilisatiehanging drop dampdiffusiecholesterolbindinggelfiltratiechromatografie

Gerelateerde artikelen