Methodenartikel

Kwantificering van callose in plantweefsels door enzymgebonden immunosorbent-assay/immunofluorescentiespectrofotometrie

112 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65833

⸱

22 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol kwantificeert callose in plantweefsel met behulp van de callose-specifieke methode, immunofluorescentiespectrofotometrie/ELISA, die gebaseerd is op de binding van callose in de plantmonsters aan callose-specifieke antilichamen, gevolgd door kwantificering van gebonden callose via enzymgelabelde detectieantilichamen door het meten van de resulterende enzymatische activiteit.

Samenvatting

De bestaande methoden voor calosekwantificering uit plantweefsel omvatten epifluorescentiemicroscopie, fluorescentiespectrofotometrie, immunofluorescentiemicroscopie en indirecte beoordeling van zowel callosesynthase- als β-(1,3)-glucanase-activiteiten. Sommige van deze methoden hebben echter aanzienlijke beperkingen, waaronder tijdrovend, niet-specifiek voor eelt, arbeidsintensief, subjectief, hoge autofluorescentie, lage gevoeligheid, meer kwalitatief dan kwantitatief, en het vereisen van het verwerven van softwarebronnen en technische vaardigheden. Daarom is er een dringende behoefte om alternatieve methoden voor calose-kwantificatie in plantweefsel te onderzoeken. Er werd verondersteld dat immunofluorescentiespectrofotometrie of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die callose-specifieke antilichamen gebruikt, enkele beperkingen van de huidige callose-kwantificatiemethoden zou kunnen overwinnen. Biotische stress werd toegediend door het inoculeren van bananenplantletten afkomstig van weefselkweek met Xanthomonas vasicola pv. musacearum (Xvm) bacteriën die de productie van callose induceerden. Bananencormweefselmonsters werden 14 dagen na de inoculatie (dpi) verzameld voor callose-kwantificatie met behulp van de nieuwe immunofluorescentiespectrofotometriemethode. De productie van callose in de corms van Xvm-geïnoideerde en controlegroepen varieerde significant in beide bananengenotypen (onafhankelijke steekproef t-test, p < 0,05). De hier beschreven immunofluorescentiespectrofotometriemethode kan worden toegepast voor de kwantificering van callose in verschillende plantweefsels met hoge specificiteit voor eelt, gevoeligheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid. Daarnaast maakt het gebruik van een 96-well-plaat deze methode geschikt voor high-throughput callose-kwantificatiestudies met minimale steekproef- en analysebiases.

Inleiding

Callose is een polysaccharide van β-1,3-glucan, een natuurlijk voorkomende verbinding die voorkomt in de celwanden van verschillende hogere planten. Callose wordt gesynthetiseerd door callosesyntasen (CalS) en afgebroken door β-(1,3)-glucanasen 1,2,3. Het is betrokken bij verschillende biologische processen, waaronder groei en ontwikkeling en de reactie op abiotische en biotische stress 4,5,6. Tijdens infectie door een ziekteverwekker helpt de toename van callose-afzetting in de papillen verdere microbiële kolonisatie te voorkomen, en fungeert als een permeabiliteitsbarrière tussen de naburige plantcellen 2,4,7,8,9,10,11,12 . Door de invasie van ziekteverwekkers in het aangevallen weefsel te vertragen, geeft callose-afzetting tijd voor het inzetten van extra verdedigingsreacties13. Nauwkeurige ruimtelijk-temporele kwantificering van callose in het plantenweefsel is essentieel om de rol ervan in de verschillende fysiologische processen te begrijpen. De huidige methoden van callose-kwantificering uit plantweefsel, waaronder epifluorescentiemicroscopie, immunofluorescentiemicroscopie en fluorescentiespectrofotometrie, hebben echter aanzienlijke beperkingen en kwantificeringsuitdagingen. Daarom is er dringend behoefte om alternatieve methoden voor callose-kwantificatie te onderzoeken om deze nadelen te overwinnen. Er werd verondersteld dat immunofluorescentiespectrofotometrie of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) een efficiëntere methode voor calosekwantificering in plantmonsters zou kunnen bieden, die hoge specificiteit, gevoeligheid, betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en een hoge-doorvoermethode biedt.

De gouden standaardmethode voor calosekwantificatie omvat beeldvorming van anilineblauw gekleurde callosedeeltjes met epifluorescentiemicroscopie 14,15,16,17. De anilineblauw gekleurde callose verschijnt bij blootstelling aan blauwe of UV-lichtexcitatie als gele fluorescerende deeltjes, die handmatig geteld kunnen worden voor het aantal fluorescerende calosedeeltjes14,15 of geteld kunnen worden door geautomatiseerde calose-telsoftware. Handmatige telling van callose-deeltjes is arbeidsintensief, tijdrovend en subjectief voor deonderzoeker, terwijl geautomatiseerd tellen het verwerven van software-middelen en aanzienlijke technische vaardigheden vereist. Enkele van de software die wordt gebruikt voor geautomatiseerd calose-tellen zijn onder andere ImageJ 19,20,21,22, photoshop 23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 en Ilastik26. De anilineblauw gekleurde callose kan ook worden gekwantificeerd met behulp van fluorescentiespectrofotometrie 17,19,27,28,29. De hoge achtergrond/autofluorescentie die geassocieerd wordt met epifluorescentiemicroscopie en fluorescentiespectrofotometrie maakt deze methoden echter moeilijk en onbetrouwbaar vanwege de lage signaal-ruisverhouding26. Bovendien kan anilineblauw naast callose30 ook andere β-1,3-glucanen kleuren, waardoor zowel epifluorescentiemicroscopie als fluorescentiespectrofotometriemethoden voor calose-detectie en kwantificatie gedeeltelijk niet-specifiek en onbetrouwbaar zijn. Een methode van immunofluorescentiemicroscopie voor callose-kwantificatie, gebaseerd op callose-specifieke antilichamen, is ook gebruikt in verschillende studies 31,32,33. Hoewel deze methode enkele nadelen deelt met epifluorescentiemicroscopie van anilineblauw gekleurde eelt, heeft ze het voordeel dat ze callose-specifiek is vanwege de hier gebruikte antilichamen. Calose-kwantificatie is ook uitgevoerd met behulp van enzymactiviteitsgebaseerde methoden. Enzymactiviteitsgebaseerde methoden voor calose-kwantificatie omvatten de beoordeling van calosesynthase (CalS)20,33 en β-(1,3)-glucanase-activiteiten34,35. De op enzymactiviteit gebaseerde methoden hebben verschillende nadelen ten opzichte van epifluorescentiemicroscopie, immunofluorescentiemicroscopie en fluorescentiespectrofotometrie. Deze omvatten indirecte schatting van eelt, de moeilijkheid van enzymextractie en enzymactiviteitstests, en het ontbreken van een gelijkmatige verdeling van callose in het plantweefsel.

Vanwege de nadelen van de huidige methoden voor calose-kwantificatie, waaronder epifluorescentiemicroscopie, immunofluorescentiemicroscopie, fluorescentiespectrofotometrie, CalS en β-(1,3)-glucanase-assays, was er behoefte aan een nieuwe methode voor callose-kwantificering die een aantal voordelen zou bieden, waaronder 1) hoge specificiteit, gevoeligheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid, en 2) eenvoudigere calose-kwantificatie met hoge doorvoercapaciteit. Het gebruik van immunofluorescentiespectrofotometrie voor callose-kwantificatie is niet onderzocht. Hier wordt een nieuwe methode voor calose-kwantificatie gebaseerd op immunofluorescentiespectrofotometrie gerapporteerd, meer specifiek de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). De methode kan worden geoptimaliseerd voor de kwantificering van callose in verschillende planten of hun weefsels met een goede mate van specificiteit qua eelt, precisie, reproduceerbaarheid en een hoge-doorzettingsexperimentele capaciteit. Deze methode kan ook worden aangepast om elke plantaardige analyte te kwantificeren als het antilichaam tegen dat analyt beschikbaar is. Om een nauwkeurige, efficiënte en betrouwbare ruimtelijke verdeling van callose in plantweefsels te waarborgen, wordt aanbevolen dat verschillende methoden van calosekwantificatie gelijktijdig worden gebruikt, waaronder microscopie, spectrofotometrie en enzymactiviteitsmethoden. Hierdoor wordt het nauwkeurig en efficiënt mogelijk om de rol van callose in verschillende fysiologische en stressreacties te begrijpen.

Protocol

1. Inoculatie van experimentele planten

  1. Isoleer, bereid het Xvm-inoculum voor en bevestig het volgens standaardprocedures36,37. Selecteer willekeurig 10 2 maanden oude Musa balbisiana- en Mbwazirume-planten uit weefselcultuur en inoculeer de dorsale zijde van de jongste, volledig open bladsteel met 200 μL (1 x 108 cellen) van het PCR-bevestigde Xvm-inoculum (Figuur 1)38.
  2. Selecteer op vergelijkbare wijze willekeurig 10 Musa balbisiana en Mbwazirume bananenplantletten en inoculeer deze met 200 μL steriel gedestilleerd water (SDW).
  3. Onderhoud de met Xvm geïnënt en controleer bananenplanten onder vergelijkbare omstandigheden in het horrehuis met een 12 uur licht/12 uur donker fotoperiode bij 25 °C, waarbij je ze elke 3 dagen water geeft.
    OPMERKING: Zie de Materiaaltabel en Tabel 1 voor respectievelijk de lijst van materialen en apparatuur en het recept voor buffers.

2. Bemonstering van knolweefsels en monstervoorbereiding

  1. Voer destructieve bemonstering uit om cormmonsters van de experimentele planten te verkrijgen (Figuur 1).
  2. Verwijder snel ongeveer 2 g van de kormmonsters met steriele chirurgische messen 14 dagen na de inoculatie (dpi) en plaats ze afzonderlijk in gelabelde 50 mL buizen. Doe dit voor alle 10 monsters die elk van de Xvm-geïnënformeerde planten en de controleplanten zijn verzameld.
  3. Dompel onmiddellijk de 50 mL buizen met de monsters onder in vloeibare stikstof.
  4. Transporteer de monsters naar het laboratorium en bewaar ze bij -80 °C totdat ze klaar zijn om verder te gaan. Bewaar monsters tot 1 jaar of langer bij −80 °C met minimale vries-dooicycli.
  5. De monsters 72 uur gevriesdroogd met een vriesdroger (Figuur 1).
  6. Doe precies 30 mg van de gevriesdroogde monsters in 2 mL buizen met 2 stalen fietskralen en maal deze tot fijn poeder, met de snelheid ingesteld op 5 voor 1 minuut (Figuur 1).
  7. Bewaar de verpulverde monsters in een koele, droge omgeving bij kamertemperatuur, goed afgesloten totdat ze klaar zijn om verder te gaan. Bewaar de verpulverde monsters tot 4 maanden bij kamertemperatuur of tot 1 jaar bij −80 °C met minimale vries-dooicycli39,40.

3. Extractie van callose en bereiding van laminarinestandaarden en blank

  1. Om callose uit de 30 mg van het verpulverde kormmonster te extraheren, voeg je 800 μL van 1 M NaOH toe en incubeer je 30 minuten bij 80 °C in een waterbad, met af en toe vortexvorming na elke 10 minuten(Figuur 1, Stap 6).
  2. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur (ongeveer 5 minuten) en centrifugeer dan op 15.294 x g gedurende 5 minuten.
  3. Breng het supernatant (callose-extract) over in een steriele buis van 2 mL en verdun met de blokkeringsbuffer (Tabel 1) in een verhouding van 1:2.
    OPMERKING: Kies de verdunningsfactor op basis van voorlopige experimenten en optimalisatie. Verdunning van het calose-extract kan wel of niet nodig zijn. Indien nodig moet verdunning worden uitgevoerd in de blokkeringsbuffer en moet de verdunningsverhouding geoptimaliseerd worden voor verschillende monstertypen om binnen het bereik van de standaardcurve te vallen.
  4. Bewaar de callose-extracten bij -20 °C totdat je klaar bent om verder te gaan. Bewaar het callose-extract tot 6 maanden met minimale vries-ontdooicycli.
  5. Bereid een geconcentreerde voorraad laminarine voor bij standaard 100 mg/mL in 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    OPMERKING: Laminarine is een 1-3-β-glucanpolymeer en kan als standaard worden gebruikt voor callose-equivalenten in immunofluorescentiespectrofotometrie.
  6. Incubeer de resulterende suspensie van de standaard bij 80 °C in een waterbad, waarbij je het voorzichtig schudt op intervallen, totdat alle laminarine volledig is opgelost (ongeveer 20-40 minuten).
  7. Koel het opgeloste stof standaard tot kamertemperatuur (ongeveer 10 min).
  8. Bereid laminarinestandaarden voor bij concentraties van 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL en 0,01 mg/mL met behulp van de blokkeringsbuffer, beginnend bij de geconcentreerde voorraad van 100 mg/mL.
  9. Bereid de blanks voor door 1 M NaOH en de blocking buffer te mengen in een verhouding van 1:2. Als verdunning nodig is, gebruik dan dezelfde verdunningsverhouding als voor het bereiden van het calose-extract.
  10. Bewaar de laminarinestandaarden en de blanco's bij −20 °C. Bewaar standaarden en blanco's tot 6 maanden met minimale vries-ontdooicycli.

4. Callose-kwantificering door de immunofluorescentiespectrofotometrie

  1. Voeg 100 μL van het primaire antilichaam (1-3-β-glucaangerichte muis IgG) dat is voorbereid met de coatingbuffer (Tabel 1) toe aan elk van de 96 putten van de polystyreen ELISA-platen (Figuur 2).
  2. Sluit het bord stevig af met paraffinefolie en laat het een nacht incuberen bij 4 °C in een koelkast.
  3. De volgende dag zet je het bord op het aanrecht en laat je het op kamertemperatuur staan (ongeveer 10 minuten).
  4. Was het bord met de standaard dep- en wasprocedures46. Kort gezegd: voeg 200 μL van de wasbuffer (Tabel 1) toe aan de putten, laat deze 30 seconden vortexen bij 500 rpm met een digitale shaker en dep op vloeipapier. Herhaal dit wasproces twee keer (Figuur 2). Zorg ervoor dat de putten niet volledig uitdrogen en gebruik een steriele micropipettip om eventuele belletjes in de putten te verwijderen zonder de basis en wanden van de putten te raken.
  5. Voeg 200 μL van de blokkeringsbuffer toe aan elk van de putten (Figuur 2) en sluit de plaat stevig af met paraffinefolie. Breng het 4 uur uit op 37 °C. Was het bord zoals hierboven vermeld (Figuur 2).
  6. Voeg 100 μL van het callose-extract van de 10 Xvm-geïnoideerde en 10 controleplanten toe aan de aangewezen putten. Voeg 100 μL van de laminarine-standaarden toe aan andere putten. Voeg 100 μL van de blank toe aan andere putten (Figuur 2).
  7. Sluit het bord stevig af met paraffinefilm en laat het een nacht incuberen op 4 °C in de koelkast. Was het bord opnieuw zoals hierboven vermeld (Figuur 2).
  8. Voeg 100 μL van het primaire antilichaam (1-3-β-glucaangerichte muis IgG) dat is voorbereid met de blokkeringsbuffer toe aan elk van de putten (Figuur 2).
  9. Sluit de plaat stevig af met paraffinefilm en bevrucht 4 uur bij 37 °C, en was de plaat daarna zoals hierboven aangegeven (Figuur 2).
  10. Voeg 100 μL anti-muis IgG-Alkaline fosfatase secundaire antistof toe aan elke put46,47 (Figuur 2).
  11. Sluit de plaat goed af met paraffinefilm en laat hem een nacht incuberen bij 4 °C in een koelkast. Was vervolgens het bord zoals hierboven aangegeven (Figuur 2).
  12. Voeg 100 μL vers bereide para-nitrofenylfosfaat (pNPP) oplossing met een concentratie van 1 mg/mL toe (Tabel 1) aan de putten (Figuur 2)
  13. Incubeer de plaat op de bank bij kamertemperatuur gedurende 30 minutenen 48 minuten.
    OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de plantenmonsters en de gebruikte standaard. In deze studie had laminarine de beste waarde met 30 minuten.
  14. Beëindig de reactie door 100 μL vers voorbereide stopoplossing (0,5 M NaOH) toe te voegen aan elk van deputten 48 (Figuur 2).
  15. Breng de plaat over naar een microplaatlezer (in evenwicht tot 37 °C), schud deze 1 minuut op middelmatige snelheid en lees de absorptiewaarden af bij 405 nm48 (Figuur 1, Figuur 2).

5. Data-analyse

  1. Voer een eenvoudige lineaire regressie uit van laminarineabsorptie bij 405 nm tegenover laminarineconcentratie (μg/mL) om de standaardcurve te verkrijgen. De vergelijking van de standaardkromme is
    Y = β1X + β0
    waarbij Y laminarineabsorptie bij 405 nm vertegenwoordigt, β1 de helling van de regressielijn is (Pearson-correlatiecoëfficiënt), X Log10 is (laminarineconcentratie in μg/mL) en β0 de y-interceptie.
  2. Bereken de calloseconcentraties in de kormmonsters door de absorptie van de blank af te trekken van de absorptie van de monsters. Gebruik vervolgens de standaardcurve om de caloseconcentratie in μg/mL als laminarine-equivalent (LE) te schatten.
  3. Onderzoek alle gegevens op normaliteit van de verdeling met behulp van de Shapiro-Wilk-test en controleer op homoscedasticiteit van varianties met de Levene-test (α > 0,05).
  4. Gebruik de onafhankelijke t-test om de calloseproductie tussen de Xvm-geïnoideerde en controlegroepen te vergelijken (p≤ 0,05).

Resultaten

De bekende concentraties van de laminarinestandaarden werden geanalyseerd met spectrofotometrie en hun bijbehorende absorptiewaarden werden geregistreerd. Met deze gegevens werd een Beer-Lambert-plot geconstrueerd door de concentraties van de laminarinestandaarden op de x-as en de absorptie op de y-as te plotten. De vergelijking van de regressielijn was y = 0,5079x − 0,04534 (Figuur 3)49. De Beer-Lambert-grafiek gaf een hoge correlatiecoëfficiënt (r) van 0,9988 en een determinatiecoëfficiënt (r2) van 0,9975, wat een sterke lineaire relatie tussen concentratie en absorptie aangeeft, en tot 0,9975 van de variantie in de afhankelijke variabele (absorptie) werd verklaard door de onafhankelijke variabele (concentratie; Figuur 3; p<0.0001). Daarom was dit model een goede match, nauwkeurig en betrouwbaar voor het voorspellen van de concentratie laminarine en eelt. De concentratie callose in de bananenkorrelmonsters werd bepaald door de absorptie van de korrelmonsters te meten via spectrofotometrie en het gebruik van de absorptiewaarden om de calloseconcentraties te berekenen met behulp van de vergelijking.

De immunofluorescentiespectrofotometrie-assay toonde een significante toename van geïnduceerde callose in Xvm-geïnënënfiseerde planten vergeleken met de controlegroep in beide bananengenotypen (onafhankelijke steekproef t-test, p < 0,05; Figuur 4). De calloseproductie in de controle-installaties bij 14 dpi was respectievelijk 1474,34 mg/mL en 1037,11 mg/mL voor Mbwazirume en M. balbisiana (Figuur 4). De inoculatie van de planten met Xvm resulteerde in 4190,78 mg/mL en 1996,07 mg/mL callose in de knolen van Xvm-geïnënteerde Mbwazirume en M. balbisiana-plantletten bij respectievelijk 14 dpi (Figuur 4). Xvm-inoculatie veroorzaakte een 1,9- tot 2,8-voudig hogere calloseproductie vergeleken met de controleplanten (onafhankelijke steekproef t-test, p < 0,001; Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Schematische illustratie van de belangrijkste stappen bij de kwantificatie van calose met de nieuwe immunofluorescentiespectrofotometriemethode. Deze figuur toont de belangrijkste stappen bij de kwantificering van callose uit bananenweefsels, waaronder het opkweken van de uit weefselkweek afgeleide plantjes, inoculatie met Xvm, destructieve bemonstering van het kormweefsel, vriesdrogen van de monsters, extractie van callose en kwantificering van callose met de nieuwe immunofluorescentiespectrofotometriemethode. Dit cijfer is50 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Gedetailleerde schematische illustratie van de immunofluorescentiespectrofotometriemethode voor callose-kwantificatie. Deze figuur geeft een gedetailleerde demonstratie van de immunofluorescentiespectrofotometriemethode voor callose-kwantificatie, waarbij wordt getoond hoe de ELISA-plaat belast is met de verschillende componenten en hoe callose uiteindelijk wordt gekwantificeerd door spectrofotometrie. Dit cijfer is50 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Eiwitkwantificatie. De Beer-Lambert-grafiek is gebaseerd op laminarine-standaarden met bekende concentraties en absorptiewaarden (bij 405 nm) die worden gebruikt voor de berekening van calloseconcentraties (als laminarine-equivalenten, LE) uit absorptiemetingen van de kormmonsters. Dit cijfer is herdruktin 49. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vergelijking van calloseconcentratie. Vergelijking van de gemiddelde calloseconcentraties (gemiddelde ± SEM, n = 9) in de knollen van M. balbisiana en Mbwazirume bananenplantletjes, geïnoculeerd met Xvm , zoals bepaald door de nieuwe immunofluorescentiespectrofotometriemethode (onafhankelijke steekproef t-test, α ≤ 0,05) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BufferSamenstellingOpslag
Blokkeringsbuffer10 g rundereserumalbumine (BSA; 1% w/v), opgelost in 1 L PBS.-20 °C tot 6 maanden
Coatingbuffer1,59 g natriumcarbonaat (Na2CO3), 2,93 g natriumbicarbonaat (NaHCO3), 0,2 g natriumazide (NaN3), opgelost in 1 L gedeïoniseerd H2O, pH 9,6.-20 °C tot 12 maanden
Conjugaatbuffer2 g PVP (2% w/v), opgelost in 1 L blokkingsbuffer.-20 °C tot 6 maanden
Para-nitrofenylfosfaat (pNPP) oplossingLos para-nitrofenylfosfaat (pNPP) op in een substraatbuffer tot een werkconcentratie van 1 mg/mL-20 °C tot 12 maanden
Fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS)8,0 g natriumchloride (NaCl), 0,2 g monobase kaliumfosfaat (KH2PO4), 1,15 g dibasisch natriumfosfaat (Na2HPO4), 0,2 g kaliumchloride (KCl), 0,2 g natriumazide (NaN3), opgelost in 1 L gedeïoniseerd H2O, pH 7,4.-20 °C tot 12 maanden
Primaire antistof in blokkerende bufferReconstrueren het gelyofilieerde primaire antilichaam volgens de instructies van de fabrikant om de geconcentreerde voorraad te verkrijgen. Verdunn de verkregen gereconstitueerde primaire antistofvoorraad in de blokkeringsbuffer tot een werkconcentratie van 2 μg/mL.-20 °C tot 6 maanden
Primaire antistof in coatingbufferReconstrueren het gelyofilieerde primaire antilichaam volgens de instructies van de fabrikant om de geconcentreerde voorraad te verkrijgen. Verdun de verkregen gereconstitueerde primaire antistofvoorraad in de coatingbuffer tot een werkconcentratie van 2 μg/mL.-20 °C tot 6 maanden
Secundair antilichaam1:1000 secundair antilichaamconcentraat: geconjugeerde buffer-20 °C tot 6 maanden
Substraatbuffer97 mL diethanolamine, 0,2 g natriumazide (NaN3), opgelost in 1 L gedeïoniseerd H2O, pH 9,8-20 °C tot 12 maanden
Wasbuffer0,5 mL Tween 20 (0,05% v/v), opgelost in 1 L PBS, pH 7,5-20 °C tot 12 maanden

Tabel 1: Recept voor buffers.

Discussie

De immunofluorescentiespectrofotometriemethode werd voor het eerst toegepast bij de kwantificering van callose in bananenkrokken. Het is gebaseerd op enzymimmunoassay (EIA), gebruikt om callose te kwantificeren in het ruwe 1 M NaOH-extract van banaan met behulp van eelt-specifieke antilichamen 47,51,52. Kort samengevat bestond deze nieuwe immunofluorescentiespectrofotometrie-gebaseerde, callose-specifieke kwantificatietest uit het coaten van de microplaat met een callose-specifiek antilichaam, dat vervolgens bindt aan callose in het plantextract, gevolgd door een secundair antilichaam dat ook specifiek is voor etel. De detectie van een antilichaam dat gekoppeld is aan een enzym (alkalische fosfatase) wordt vervolgens toegevoegd en vormt een complex met het secundaire antilichaam. Vervolgens wordt een substraat, para-nitrofenylfosfaat (pNPP), toegevoegd. De kwantificatie van callose in het monster is afhankelijk van het vermogen van alkalische fosfatase om de fosfaatgroepen uit pNPP-moleculen te splitsen, wat resulteert in de vorming van een geelgekleurde verbinding (p-nitrofenol). De detectie van de intensiteit van de gele kleur werd gedaan met een spectrofotometer op 405 nm en de absorptie werd vervolgens gecorreleerd met alkalische fosfataseactiviteit, die recht evenredig was met de calloseconcentratie in het monster. De reactie werd gestopt door de pH te verhogen door toevoeging van 0,5 M NaOH, wat verdere alkalische fosfataseactiviteit voorkwam.

Daarentegen is de standaard-goudmethode voor calose-lokalisatie en kwantificatie de epifluorescentiemicroscopiemethode, een goed gevestigde methode gebaseerd op het kleuren van callose met anilineblauw fluorochroom53. Kort gezegd is deze methode gebaseerd op de specifieke binding van anilineblauwe kleurstof aan beta-1,3-glucanen (eelt) die een complex vormen. Het anilineblauw in dit complex wordt vervolgens geëxciteerd met behulp van ultraviolet licht (golflengte van 365-375 nm). Wanneer de anilineblauwe kleurstof wordt aangeslagen, zendt deze blauwe fluorescentie uit die wordt vastgelegd om specifieke visualisatie van callose in plantweefsel53 mogelijk te maken. Kwantificering van anilineblauw gekleurde callose volgt een reeks beeldvormingstechnieken die de hoeveelheid fluorescentie van de plantweefsels kwantificeren. De fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid callose die beschikbaar is in het plantweefsel. Epifluorescentiemicroscopie is gebruikt bij visualisatie en kwantificatie van callose bij biotische stress54.

In een aparte studie werd callose-afzetting bepaald met zowel epifluorescentiemicroscopie als immunofluorescentiespectrofotometrie49. Hoewel er enkele verschillen in de gegevens werden waargenomen, toonde statistische analyse grotendeels congruentie aan tussen epifluorescentiemicroscopie en immunofluorescentiespectrofotometriegegevens, wat wijst op consistentie in de twee methoden van callosedetectie49. Hoewel de resultaten van de twee methoden grotendeels overeenkwamen, is het raadzaam dat zowel epifluorescentiemicroscopie als immunofluorescentiespectrofotometrie elkaar aanvullen voor een betrouwbaardere beoordeling. Hoewel de op ELISA gebaseerde methode callose-specifiek, gevoelig en betrouwbaar is, kost het aanvankelijk veel tijd tijdens de optimalisatie van het protocol en het verkrijgen van een bestpassende standaardcurve die aan alle concentraties en absorpties voldoet.

Sommige methoden voor calose-kwantificatie zijn arbeidsintensief17,32,55, tijdrovend26,56, niet callose-specifiek omdat anilineblauw andere β-1,3-glucanen kan kleuren naast callose30, en dure en geavanceerde callose-telsoftwarevereist 23,24,26 , vereisen een aanzienlijke hoeveelheid technische vaardigheden en de hoge achtergrond/autofluorescentie die samenhangt met fluorescentiespectrofotometrie maakt de kwantificatie van calose moeilijk en onbetrouwbaar26. Callose kwantificatiemethoden gebaseerd op geautomatiseerde beeldanalyseworkflows zoals ImageJ-software vereisen passende training van de beeldanalyse-plug-in zoals de Trainable Weka Segmentation (TWS) voor ImageJ, en dit is erg omslachtig57.

Immunofluorescentiespectrofotometrie-gebaseerde assays worden sterk geprefereerd vanwege hun specificiteit, gevoeligheid, gebruiksgemak en reproduceerbaarheid. Het is echter belangrijk op te merken dat het detectiesysteem en de gevoeligheid ervan kunnen variëren afhankelijk van het specifieke assayprotocol en de gebruikte apparatuur.

Hier wordt een nieuwe methode voor calose-kwantificatie beschreven op basis van immunofluorescentiespectrofotometrie. De hier beschreven methode kan worden toegepast voor de kwantificatie van callose in verschillende plantweefsels en soorten met een bevredigend niveau van specificiteit aan eelte, hoge precisie en reproduceerbaarheid. Deze methode is een aanvulling op de verschillende calose-kwantificatiemethoden en kan worden gebruikt om veranderingen in caloseniveaus tijdens groei en ontwikkeling in planten te monitoren en als reactie op diverse prikkels of behandelingen. Bovendien vermindert het gebruik van 96-well plate subjectieve bemonstering en analyse, waardoor de methode geschikt is voor high-throughput callose-kwantificatie. Het is opmerkelijk dat hoewel callose gemakkelijk kan worden gewonnen uit vers geoogste plantenweefsels 17,27,55, de monstervoorbereidingsstap waarbij vriesdroog wordt opgenomen volgens dit nieuwe protocol een voordeel biedt om de monsters zeer lang (tot 1 jaar) te bewaren en het mogelijk maakt om bederfelijke biologische monsters tussen verre laboratoria bij omgevingstemperatuur te bewaren en te verzenden. Dit maakt het mogelijk om herhaalde callose-extracties te doen zonder dat het hele experiment herhaaldelijk wordt opgezet voor verse monsterverzameling.

Immunofluorescentiespectrofotometrie wordt aanbevolen voor hoogdoorvoer callose-kwantificatie-experimenten, terwijl epifluorescentiemicroscopie en immunofluorescentiemicrocopy kunnen worden gebruikt voor zowel kwantificatie van callose als histolokalisatie van callose in plantweefsels. Om een nauwkeurige, efficiënte en betrouwbare ruimtelijke verdeling van callose in plantweefsels te waarborgen, wordt aanbevolen dat verschillende methoden van calosekwantificatie gelijktijdig worden gebruikt, waaronder microscopie, spectrofotometrie en enzymactiviteitsmethoden. Hierdoor wordt het nauwkeurig en efficiënt mogelijk om de rol van callose in verschillende fysiologische en stressreacties te begrijpen. Toekomstig onderzoek zou verschillende methoden voor callose-kwantificatie volledig en gelijktijdig kunnen beoordelen, waaronder epifluorescentiemicroscopie, immunofluorescentiemicroscopie, fluorescentiespectrofotometrie, immunofluorescentiespectrofotometrie en enzymatische activiteitsgebaseerde methoden.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflict aan.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door The Bill & Melinda Gates Foundation, subsidienummer INV 009894/OPP1134098. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of bij de beslissing om de resultaten te publiceren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminiumfolie Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Analytische weegschaal Mettler-Toledo AG, Greifensee, ZwitserlandML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, USA1001EUR
Blottingpapier Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Bovine Serum Albumine (BSA) Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VSB14
Centrifuge, 5425REppendorf, Hamburg, Duitsland5406000240
Gecombineerde koel-vriezer (4 °C en −20 °C) Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Qingda, ChinaHYCD-282
Diethanolamine PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje191287
Digitale shaker, MixMateEppendorf, Hamburg, Duitsland5353000529
Di-natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141679
ELISA-platen, 96-well, platte bodem, transparant, polystyreen, hoge bindingSarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Duitsland82.1581.200
Filter voor de iMark microplaatlezer, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Kaapstad, Zuid-AfrikaBRD1681011
Vriesdroger, VirTis—BenchTop “K” serie; Model: 4KBTXLLabWrench, Canada, VS448053
Zoutzuur (HCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141020
Isotherme dwangconvectie-incubator, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, Singapore2100002
Laminarin Alfa Aesar, Massachusetts, VSJ66193
Microcentrifugebuisjes 1,5 mL Eppendorf, Hamburg, Duitsland022363204
Microcentrifugebuisjes 2 mL Genesee Scientific Corp., Californië, VS24–283
Micropipet (30–300 μL), 12-kanaals, 2100-serie Eppendorf, Hamburg, DuitslandEP-12-300R
Micropipettips epT.I.P.S.  SinglesEppendorf, Hamburg, Duitsland022363204
Micropipetten (0,5–1000 μL), Research  plusEppendorf, Hamburg, Duitsland3123000900
Microplaatabsorptiemeter, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Californië, VS1681135EDU
Microplate Manager 6 versie 6 software Bio-Rad Laboratories, Inc., Californië, VS1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Duitsland740751
Para-nitrofenylfosfaat (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland20-106
pH-meter, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, VS02310048991
Polyvinylpyrrolidon (PVP) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, SpanjeA2260
Kaliumchloride (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, SpanjeA2939
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141509
Precisie waterbad, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, VSTSGP10
Primaire antilichaam (1-3-β-glucaan-gericht muis IgG) Bio supplies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australië400-2
Reagensreservoirs Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, VS15075
Secundair antilichaam geconjugeerd aan alkalische fosfatase (anti-muis IgG-alkalinefosfatase) Sigma Life Sciences, New Jersey, VSA5153
Natriumaziet (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, SpanjeA1430
Natriumcarbonaat (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141648
Natriumchloride (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, SpanjeA2942
Natriumwaterstoffosfaat (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141638
Natriumhydroxide (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, Barcelona, Spanje141687.1210
Tween-20Biomatik Corporation, Ontario, CanadaA4031
Ultrapuur gedistilleerd waterThermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS10-977-015

Referenties

  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Callosekwantificeringcallose specifieke antilichamenfluorescentiespectrofotometrieepifluorescentiemicroscopiebananenknolweefselbiotische stresshigh throughput kwantificering
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.