Het doel van het huidige protocol is om de stappen te schetsen die nodig zijn om een sociale voorkeurstest voor volwassen zebravissen op te zetten en te gebruiken en aan te tonen dat deze kan worden gebruikt om door ethanol geïnduceerde sociale defecten te karakteriseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modellering van foetale alcoholspectrumstoornissen bij zebravissen om de impact van een ongunstige embryonale omgeving op het sociale gedrag van volwassenen te karakteriseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) beschrijven alle door alcohol veroorzaakte geboorteafwijkingen. Geboorteafwijkingen zoals groeistoornissen, craniofaciale, gedrags- en cognitieve afwijkingen zijn geassocieerd met FASD. Sociale problemen zijn veel voorkomende gedragsafwijkingen die verband houden met FASD en leiden vaak tot ernstige gezondheidsproblemen. Diermodellen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor door ethanol geïnduceerde sociale defecten. Zebravissen zijn sociale gewervelde dieren die uitwendig bevruchte transparante eieren produceren; deze kenmerken bieden onderzoekers een nauwkeurige maar eenvoudige procedure voor het creëren van het FASD-fenotype en een aangeboren gedrag dat kan worden gebruikt om de sociale tekorten die verband houden met FASD te modelleren. Zebravissen zijn dus ideaal om de sociale tekorten van FASD te karakteriseren. Het doel van het huidige protocol is om de gebruiker een eenvoudige gedragstest te bieden die kan worden gebruikt om de gevolgen van een negatieve omgeving vroeg in de ontwikkeling te karakteriseren en de effecten die dit kan hebben op sociaal gedrag op volwassen leeftijd. Het protocol kan worden gebruikt om het effect van mutaties of teratogenen op het sociale gedrag van volwassenen te karakteriseren. Het hier beschreven protocol laat zien hoe het sociale gedrag van individuele vissen kan worden gekarakteriseerd tijdens een sociale test van 20 minuten. Bovendien leveren de gegevens die met behulp van het huidige protocol zijn verkregen, bewijs dat het protocol kan worden gebruikt om de effecten van embryonaal ethanol-geïnduceerde sociale defecten bij volwassen zebravissen te karakteriseren.
Inleiding
Prenatale blootstelling aan alcohol kan leiden tot een verscheidenheid aan geboorteafwijkingen die gezamenlijk bekend staan als foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD)1. Verminderd gedrag, zoals sociale problemen, zijn veel voorkomende geboorteafwijkingen die verband houden met FASD 2,3. Helaas leiden sociale problemen vaak tot ernstige psychische problemen4, die de kwaliteit van leven van mensen met FASD nadelig kunnen beïnvloeden. Het is dus van het grootste belang om de mechanismen te begrijpen die verantwoordelijk zijn voor door ethanol veroorzaakte sociale defecten.
Zebravissen hebben biologische en gedragskenmerken waardoor ze zeer geschikt zijn om ons begrip van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor door ethanol veroorzaakte sociale defecten te vergroten. Zebravissen produceren bijvoorbeeld grote hoeveelheden doorzichtige, uitwendig bevruchte eieren; deze biologische kenmerken stellen onderzoekers in staat om gemakkelijk nauwkeurige en reproduceerbare FASD-fenotypes te creëren5. Om embryo's 24 uur na de bevruchting (hpf) aan ethanol bloot te stellen, hoeft men alleen maar een ontleedmicroscoop te gebruiken om het transparante ei te onderzoeken en het embryo te faseren op basis van eerder gepubliceerd werk zoals Kimmel et al.6, en vervolgens het ei gedurende de gewenste duur in de gewenste ethanolconcentratie te plaatsen. Omdat het chorion een zwakke barrière is voor alcohol7, baadt de ethanol het embryo gemakkelijk. Om de blootstelling te stoppen, hoeft men alleen maar de eieren uit de ethanoloplossing te verwijderen. Naast het bieden van een eenvoudige maar nauwkeurige methode aan onderzoekers voor het creëren van FASD-fenotypes, stellen zebravissen onderzoekers ook in staat om genetische vergelijkingen met mensen te maken, omdat 70% van de menselijke genen een zebravisortholoog hebben, dus ze zijn een waardevol hulpmiddel voor het begrijpen van aan ziekten gerelateerde genen bij de mens8. Bovendien vormen zebravissen, in tegenstelling tot andere diermodellen, sociale groepen9 genaamd scholen10. Ondiep gedrag kan worden gebruikt om de effecten van blootstelling aan embryonale ethanol op sociaal gedrag te karakteriseren11. Verder kan bij zebravissen een sociale respons worden opgewekt door gebruik te maken van computergestuurde sociale stimuli12 of een live sociale stimulus13.
Eerdere werken hebben de sociale respons van volwassen zebravissen in groepen14 gekarakteriseerd, maar een beperking van deze benadering is het onvermogen om het gedrag van een individuele vis te correleren met een specifieke maatstaf, zoals veranderingen in neurotransmitterniveaus11. Het volgende protocol geeft gebruikers de mogelijkheid om het sociale gedrag van een individuele volwassen zebravis te karakteriseren. Omdat sociaal gedrag wordt verworven voor individuele vissen, kunnen gebruikers van het protocol nu het verworven gedragsprofiel van elke vis correleren met een afhankelijke uitkomst. Eerder werk heeft bijvoorbeeld aangetoond dat blootstelling aan embryonale ethanol de dopaminerge respons op een sociale stimulus schaadt11. Hoewel de hier getoonde gegevens blootstelling aan embryonale ethanol als onafhankelijke variabele hebben gebruikt, kunnen protocolgebruikers de effecten karakteriseren die andere farmacologische behandelingen of genetische mutaties hebben op sociaal gedrag. Bovendien zijn protocolgebruikers niet beperkt tot het onderzoeken hoe embryonale behandelingen het gedrag veranderen, maar kunnen ze ook bepalen hoe acute farmacologische behandelingen bij volwassen zebravissen het sociale gedrag beïnvloeden15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of South Dakota.
1. Huisvesting, verzorging en blootstelling aan embryonale ethanol in zebravissen
- Kweek en kweek zebravissen zoals beschreven16.
- Blootstelling aan ethanol
- Kies het juiste ontwikkelingsstadium om de blootstelling aan ethanol uit te voeren. In dit protocol werden embryo's blootgesteld aan ethanol met 24 hpf.
- Plaats de eieren in 1,0% ethanol volume/volume gedurende 2 uur15. Een verhouding van 1 ei per ml EM is een goede gewoonte. Specifiek, plaats embryo's in 50 ml embryomedium (EM; zie Westerfield16 voor het EM-recept) verwijder vervolgens 500 μL EM en vervang ze door 500 μL ethanol.
- Kweek na blootstelling aan ethanol embryo's op zoals beschreven17. Test sociaal gedrag wanneer vissen 16 weken oud zijn.
2. Randomisatie en tankopstelling
- Gebruik een online generator voor willekeurige sequenties om alle onderzoeken a priori te randomiseren naar het uitvoeren van de gedragstesten. Zorg ervoor dat de stimuluszijde en de behandelingsgroepen willekeurig variëren.
- Om verstorende factoren zoals het tijdstip van de dag of de dag van testen te voorkomen, moet u de gedragstest elke dag op hetzelfde tijdstip starten en beëindigen en de gedragstest op opeenvolgende dagen uitvoeren totdat alle experimentele vissen zijn getest.
- Gebruik voor deze test (Figuur 1) een tank van 37 l (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x B x H) met tanks van 1,4 l die buiten over de breedte van de tank zijn geplaatst, zoals eerder beschreven17.
- Bekleed de achterkant en de bodem van het aquarium van 37 liter met wit golfkarton om het contrast tussen de experimentele vissen en de achtergrond te vergroten en zo de videotracking te verbeteren.
- Plaats het golfplastic op de buitenwand van de 1,4 L tanks om het contrast van de sociale prikkel voor de experimentele vissen te vergroten. Plaats ten slotte wit golfplastic tussen de tanks van 1.4 L en 37 L; Deze ondoorzichtige barrière wordt gebruikt om te voorkomen dat de experimentele vissen de sociale prikkel tijdens de gewenning kunnen zien.
- Plaats de camera op een afstand die ver genoeg is om de hele lengte van het aquarium van 37 liter plus de helft van de tanks van 1,4 liter vast te leggen en de volwassen experimentele vissen nauwkeurig te volgen.
OPMERKING: Zien welke kant de stimulus vasthoudt, zorgt ervoor dat onderzoekers de volgzones correct hebben gelabeld en biedt redundantie als back-up. - Als er geen infraroodtracking wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de tank van 37 liter wordt verlicht. Gebruik in de handel verkrijgbare aquariumkaplampen met een 15 W T8 full-spectrum lamp.
OPMERKING: Als er meerdere arena's worden opgesteld, gebruik dan identieke aquariumkappen met identieke lampen.
3. Uitvoeren van de sociale test
- Begin met het vullen van de tank van 37 liter die wordt gebruikt voor de gedragstest met water dat identiek is aan het water dat in het behuizingsrek wordt gebruikt. Zorg ervoor dat de watertemperatuur binnen 2 °C van het behuizingsrek ligt.
- Aan het einde van de dag leeg je de tank van 37 L. Begin elke testdag met vers water. Zorg ervoor dat het waterpeil in de tank van 37 l en het waterpeil in de tanks van 1.4 l identiek zijn. Als de temperatuur van de kamer het water in de tank van 37 L niet op 28,5 °C 2 °C houdt, vervang dan het water door warm water van 28,5 °C.
- Stel vervolgens de interessezones in. Raadpleeg de handmatige trackingsoftware van de gebruiker naar keuze om zones te maken. In dit protocol werd over de lengte van de tank van 37 L aan de boven- en onderkant een meetlint gebruikt om stappen van 5 cm te markeren. Aangezien de testtank 50 cm is, leiden stappen van 5 cm tot 10 zones van elk 5 cm.
- Gebruik de markeringen op de tank van 37 L als referentie en gebruik de software om de zones te construeren door het punt van 5 cm aan de bovenkant te verbinden met het overeenkomstige punt van 5 cm aan de onderkant. Creëer bovendien een zone langs de bodem en langs de stimulus. Pas interessezones aan.
- Gebruik de trackingsoftware in dit protocol om de afstand tot een zone en de duur die in de zone wordt doorgebracht te meten. In dit protocol zijn 12 zones gebruikt.
- Kwantificeer de tijd doorgebracht in zones 1 tot 10 en de afstand tot de stimulus en de bodem als Zone 1, als de zone die zich het dichtst bij de stimulus bevindt, terwijl Zone 10 het verst van de stimulus verwijderd is.
- Selecteer vervolgens de twee mannetjes en twee vrouwtjes die gebruikt gaan worden voor de sociale prikkel. Het beste zou zijn om mannetjes en vrouwtjes uit hetzelfde cohort te gebruiken als de experimentele vissen. Als dat niet mogelijk is, probeer dan vissen te vinden die passen bij de soort, leeftijd en grootte van de experimentele vissen.
- Breng de experimentele vissen over van de behuizingstank naar de testarena (tank van 37 L). Gebruik een net om de vissen in het aquarium van de behuizing te vangen. Plaats het net met de vissen erin in een bak met viswater.
OPMERKING: Het gebruik van deze aanpak vermindert de stress op experimentele vissen tijdens het verplaatsen tussen aquaria. - Plaats de experimentele vissen in het midden van de testarena.
- Zodra de detectie-instellingen bevredigend zijn op basis van de software van de gebruiker naar keuze (zie gebruikershandleiding), begint u met de proefperiode van 20 minuten. Laat gedurende de eerste 10 minuten de ondoorzichtige barrière tussen de tanks van 37 l en 1,4 l op zijn plaats. Dit voorkomt dat de experimentele vissen de sociale stimulus, bestaande uit twee mannelijke en twee vrouwelijke zebravissen, zien en laat de vissen acclimatiseren aan de testarena13,17.
- Verwijder na 10 minuten voorzichtig de ondoorzichtige barrières door ze van achter de tank te trekken; Hierdoor kunnen de experimentele vissen de sociale prikkel zien.
- Gebruik volgsoftware om het gedrag van de experimentele vissen 11, 12, 17 te volgen en te kwantificeren op basis van de voorkeuren van de gebruiker en de softwarehandleiding. Kwantificeer in het huidige protocol de afstand tot de sociale stimulus en de bodem van de tank, evenals de tijd die in alle zones wordt doorgebracht.
- Analyseer gegevens met behulp van traditionele tools voor gegevensanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 is aangepast ten opzichte van Fernandes et al.17 en laat zien dat blootstelling aan embryonale ethanol de ondiepterespons afzwakt door de afstand tot de stimulus te onderzoeken. De gegevens in figuur 2 geven de afstand tot de sociale stimulus weer tijdens de 20 minuten durende proef. De Y-as toont de afstand in centimeters, terwijl de X-as de proef van 20 minuten weergeeft, opgesplitst in interva...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zebravissen hebben een aantal biologische en gedragskenmerken, waardoor ze een zeer aantrekkelijk organisme zijn voor onderzoek naar genen, de omgeving en gedrag 5,19. Dit protocol geeft de eindgebruiker een relatief eenvoudige gids voor het testen van sociaal gedrag, meerdere manieren om het sociale gedrag te kwantificeren, en heeft het potentieel om de gedragsreacties van individuele vissen te koppelen aan behandelingen zoals b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Financiering ter ondersteuning van dit onderzoek werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH)/National Institute on Alcohol Abuse (NIAAA) [R00AA027567] aan Y.F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.4-l ZT140 Aquaneering tanks | Aquaneering | ZT140 | Tanks voor sociale stimulatie |
| Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | Licht voor de 37-I tank | |
| Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | 37-l tank voor de sociale test | |
| Ethanol | Fisher Scienticfic | BP28184 | |
| Ethovision XT tracking system | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| R-Capable Color Basler GigE Camera | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| White corrugated plastic | https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385 | Kunststof om de achterkant en de bodem van de 37-I tank en de achterkant van de tanks te bekleden die voor de sociale stimulatie worden gebruikt |
Referenties
- Institue Med. Fetal alcohol syndrome: diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academies Press. Washington, D.C. (1996).
- Abel, E. L. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. , Springer. (1984).
- Stevens, S. A., Clairman, H., Nash, K., Rovet, J. Social perception in children with fetal alcohol spectrum disorder. Child Neuropsychol. 23 (8), 980-993 (2017).
- Streissguth, A. P., et al. Risk factors for adverse life outcomes in fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. J Dev Behav Pediatr. 25 (4), 228-238 (2004).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
- Pitcher, T. J. Heuristic definitions of fish shoaling behaviour. Animal Behav. 31 (2), 611-613 (1983).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Embryonic alcohol exposure impairs the dopaminergic system and social behavioral responses in adult zebrafish. Int J Neuropsychopharmacol. 18 (6), pyu089(2015).
- Fernandes, Y., Gerlai, R. Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish. Alcohol Clin Exp Res. 33 (4), 601-609 (2009).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Jones, E. M., Eberhart, J. K. Social deficits following embryonic ethanol exposure arise in post-larval zebrafish. Addict Biol. 24 (5), 898-907 (2019).
- Buske, C., Gerlai, R. Early embryonic ethanol exposure impairs shoaling and the dopaminergic and serotoninergic systems in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 33 (6), 698-707 (2011).
- Pannia, E., Tran, S., Rampersad, M., Gerlai, R. Acute ethanol exposure induces behavioural differences in two zebrafish (Danio rerio) strains: A time course analysis. Behav Brain Res. 259, 174-185 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)/Monte Westerfield. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2007).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Eberhart, J. K. Social behavioral phenotyping of the zebrafish casper mutant following embryonic alcohol exposure. Behav Brain Res. 356, 46-50 (2019).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Impairment of social behaviour persists two years after embryonic alcohol exposure in zebrafish: A model of fetal alcohol spectrum disorders. Behav Brain Res. 292, 102-108 (2015).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochem Cell Biol. 96 (2), 88-97 (2018).
- Park, J. S., et al. Innate color preference of zebrafish and its use in behavioral analyses. Mol Cells. 39 (10), 750-755 (2016).
- Gerlai, R., et al. Forward genetic screening using behavioral tests in zebrafish: a proof of concept analysis of mutants. Behav Genet. 47 (1), 125-139 (2017).
- Scerbina, T., Chatterjee, D., Gerlai, R. Dopamine receptor antagonism disrupts social preference in zebrafish: a strain comparison study. Amino Acids. 43 (5), 2059-2072 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
