Dit protocol demonstreert microscopiegeleide isolatie en immunofluorescentiekleuring van longaders van muizen. We bereiden weefselmonsters voor die het linker atrium, de longaders en de bijbehorende longen bevatten en kleuren ze voor cardiale troponine T en Connexin 43.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microdissectie en immunofluorescentiekleuring van myocardiale hulzen in longaders van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longaderen (PV's) zijn de belangrijkste bron van ectopische slagen bij atriale aritmieën en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en progressie van atriale fibrillatie (AF). PV's bevatten myocardiale hulzen (MS) die zijn samengesteld uit cardiomyocyten. MS zijn betrokken bij het initiëren en onderhouden van AF, omdat ze overeenkomsten behouden met het cardiale werkende myocardium, inclusief het vermogen om ectopische elektrische impulsen te genereren. Knaagdieren worden veel gebruikt en kunnen uitstekende diermodellen zijn om het myocardium van de longader te bestuderen, aangezien cardiomyocyten overal in de vaatwand aanwezig zijn. Nauwkeurige microdissectie en bereiding van muizen PV's is echter een uitdaging vanwege de kleine orgaangrootte en ingewikkelde anatomie.
We demonstreren een microscopie-geleid microdissectieprotocol voor het isoleren van het linker atrium (LA) van de muizen samen met de PV's. Immunofluorescentiekleuring met behulp van cardiale troponine-T (cTNT) en connexine 43 (Cx43) antilichamen wordt uitgevoerd om de LA en PV's in volledige lengte te visualiseren. Beeldvorming met een vergroting van 10x en 40x biedt een uitgebreid beeld van de PV-structuur en gedetailleerde inzichten in de myocardiale architectuur, waarbij met name de aanwezigheid van connexine 43 in de MS wordt benadrukt.
Inleiding
Boezemfibrilleren (AF) is de meest voorkomende aanhoudende aritmie1. De prevalentie van AF neemt nog verder toe met een verwacht aantal van ~17,9 miljoen patiënten in Europa in 20601. AF is klinisch zeer belangrijk omdat het een essentiële risicofactor is voor de ontwikkeling van een hartinfarct, hartfalen of beroerte, wat resulteert in een enorme individuele, sociale en sociaaleconomischelast. Hoewel AF al tientallen jaren bekend is, wordt de pathofysiologie van AF nog steeds niet volledig begrepen.
Al in de late jaren 1990 toonden studies de gr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De verzorging van de dieren en alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Care and Ethics Committee van de Ludwig-Maximilians-Universiteit van München, en alle procedures met muizen werden goedgekeurd door de Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-muizen werden commercieel verkregen.
1. Voorbereiding
- Bereid een 3% agarosegel door 3 mg agarose en 100 ml 1x Tris-gebufferde zoutoplossing te mengen in een erlenmeyer van 500 ml. Verwar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We voerden de microdissectie, kleuring en beeldvorming van de PV's uit bij 10 muizen van 12-16 weken oud. Volgens het protocol hebben we met succes PV's samen met de LA in alle experimentele muizen gemicrodisseceerd en secties verkregen met een uitgebreid beeld van de PV's in acht muizen. Overzichtsbeelden werden gemaakt met een vergroting van 10x om het PV-opening (PVO)-gebied bij de LA-PV-junctie, de extrapulmonale PV's (PVex) (PV's tussen het longhilum en de LA-PV-junctie) en de intrapulmonale PV's (PV.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met dit protocol delen we een methode om de PV's van het muizenhart te onderscheiden en te isoleren en er immunofluorescentiekleuring op uit te voeren. Na de orgaanoogst werden het hart en de longen uitgedroogd in een gesteriliseerde sucrose-oplossing, gevolgd door het scheiden van de ventrikels van het atrium en de longkwabben onder microscopische begeleiding. Daarna werd de hartbasis voorbereid om de PV's te visualiseren, gevolgd door ze uit de longen te snijden bij het hilum. De daaropvolgende immunofluorescentiekleur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X3600221 aan H.V., 81X2600255 aan S.C.), de China Scholarship Council (CSC201808130158 aan R.X.), de Duitse Onderzoeksstichting (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 tot PT), en de Corona Foundation (S199/10079/2019 tot SC).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Referenties
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Hea....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
