Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide iTenocyten via gecombineerde scleraxis-overexpressie en 2D uniaxiale spanning

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65837

⸱

1 maart 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een procedure om iTenocyten te produceren door iPSC-afgeleide mesenchymale stromale cellen te genereren met gecombineerde overexpressie van Scleraxis met behulp van een lentivirale vector en uniaxiale rek via een 2D-bioreactor.

Samenvatting

De huidige uitdagingen op het gebied van pees- en ligamentherstel vereisen de identificatie van een geschikte en effectieve kandidaat voor celgebaseerde therapie om peesregeneratie te bevorderen. Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn onderzocht als een mogelijke weefselmanipulatiestrategie voor peesherstel. Hoewel ze multipotent zijn en in vivo regeneratief potentieel hebben, zijn ze beperkt in hun zelfvernieuwingsvermogen en vertonen ze fenotypische heterogeniteit. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen deze beperkingen omzeilen vanwege hun hoge zelfvernieuwingscapaciteit en ongeëvenaarde ontwikkelingsplasticiteit. Bij de ontwikkeling van tenocyten is Scleraxis (Scx) een cruciale directe moleculaire regulator van peesdifferentiatie. Bovendien is aangetoond dat mechanoregulatie een centraal element is dat de ontwikkeling en genezing van embryonale pezen begeleidt. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld om het synergetische effect van biologische en mechanische stimulatie in te kapselen dat essentieel kan zijn voor het genereren van tenocyten. iPSC's werden geïnduceerd om mesenchymale stromale cellen (iMSC's) te worden en werden gekarakteriseerd met klassieke mesenchymale stromale celmarkers via flowcytometrie. Vervolgens werden de iMSC's met behulp van een lentivirale vector getransduceerd om SCX stabiel tot overexpressie te brengen (iMSCSCX+). Deze iMSCSCX+- cellen kunnen verder worden gerijpt tot iTenocyten via uniaxiale trekbelasting met behulp van een 2D-bioreactor. De resulterende cellen werden gekenmerkt door het observeren van de opregulatie van vroege en late peesmarkers, evenals collageenafzetting. Deze methode voor het genereren van iTenocyten kan worden gebruikt om onderzoekers te helpen bij het ontwikkelen van een potentieel onbeperkte kant-en-klare allogene celbron voor peesceltherapietoepassingen.

Inleiding

Om de hedendaagse problemen bij pees- en ligamentherstel aan te pakken, is er behoefte aan een relevante celkandidaat die geschikt is voor celgebaseerde therapieën. Een onderzoeksrichting in weefselmanipulatie voor peesherstel omvat de verkenning van beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (BM-MSC's) en vetweefsel-afgeleide stromale cellen (ASC's) als mogelijke strategieën. Deze cellen hebben een multipotent vermogen, een grote overvloed en een regeneratief potentieel in vivo. Bovendien hebben ze een verbeterd genezingsvermogen en verbeterde functionele resultaten aangetoond indiermodellen1. Desalniettemin vertonen deze cellen een beperkt zelfvernieuwingsvermogen, fenotypische diversiteit en met name een beperkt vermogen tot peesvorming. Geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) biedt een oplossing voor deze beperkingen vanwege het opmerkelijke zelfvernieuwende vermogen en het ongeëvenaarde aanpassingsvermogen in de ontwikkeling. Ons onderzoeksteam en anderen hebben een succesvolle differentiatie van iPSC's in mesenchymale stromale celachtige entiteiten (iMSC's) bereikt2,3. Als zodanig hebben iMSC's het potentieel om een allogene bron te zijn voor peesceltherapietoepassingen.

Scleraxis (SCX) is een transcriptiefactor die essentieel is voor de ontwikkeling van pezen en wordt beschouwd als de vroegst detecteerbare marker voor gedifferentieerde tenocyten. Bovendien activeert SCX stroomafwaartse peesdifferentiatiemarkers, waaronder type 1a1-keten collageen 1 (COL1a1), hanenkam (MKX) en tenomoduline (TNMD), onder andere 4,5,6. Andere genen die tijdens peesrijping tot expressie komen, zijn onder meer tubulinepolymerisatiebevorderend eiwitfamilielid 3 (TPPP3) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor-alfa (PDGFRa)7. Hoewel deze genen essentieel zijn voor de ontwikkeling en rijping van pezen, zijn ze helaas niet uniek voor peesweefsel en komen ze tot expressie in andere musculoskeletale weefsels zoals bot ofkraakbeen5,7.

Naast de expressie van markers tijdens de peesontwikkeling, is mechanostimulatie een essentieel element voor de ontwikkeling en genezing van embryonale pezen 4,5,6. Pezen zijn mechanoresponsief en hun groeipatronen veranderen als reactie op hun omgeving. Op moleculair niveau beïnvloeden biomechanische signalen de ontwikkeling, rijping, onderhoud en genezingsreacties van tenocyten8. Er zijn verschillende bioreactorsystemen gebruikt om fysiologische belastingen en biomechanische signalen te modelleren. Sommige van deze modelsystemen omvatten ex vivo weefselbelasting, 2D-cellaadsystemen die biaxiale of uniaxiale spanning toepassen, en 3D-systemen die steigers en hydrogels gebruiken 9,10. 2D-systemen zijn voordelig bij het bestuderen van de effecten van de mechanische stimulatie op peesspecifieke genen of de morfologie van de cellen in de context van het lot van de cel, terwijl 3D-systemen de interacties tussen cel en ECM nauwkeuriger kunnen repliceren 9,10.

In 2D-laadsystemen is de spanning tussen de cellen en het kweeksubstraat homogeen, wat betekent dat de uitgeoefende belasting op het cytoskelet van de cellen volledig kan worden gecontroleerd. In vergelijking met bi-axiale belasting is uniaxiale belasting fysiologisch relevanter, aangezien tenocyten in vivovoornamelijk worden blootgesteld aan uniaxiale belasting door collageenbundels 9. Het blijkt dat pezen tijdens dagelijkse activiteiten worden blootgesteld aan uniaxiale trekbelasting tot 6% belasting11. In het bijzonder hebben eerdere studies aangetoond dat belasting binnen het fysiologische bereik van 4%-5% tenogene differentiatie bevordert door peesgerelateerde markerexpressie zoals SCX en TNMD te behouden, evenals een verhoogde collageenproductie 9,10. Verrekkingen van meer dan 10% kunnen traumatisch relevant zijn, maar fysiologisch niet relevant12,13.

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat rekening houdt met het synergetische effect van mechanische en biologische stimulatie die essentieel kan zijn voor de aanmaak van tenocyten. We beschrijven eerst een reproduceerbare methode om iPSC's in iMSC's te induceren via kortdurende blootstelling van embryoïde lichamen aan groeifactoren, bevestigd door MSC-oppervlaktemarkers met behulp van flowcytometrie. Vervolgens beschrijven we een lentivirale transductiemethode om iMSC's te manipuleren om een stabiele overexpressie van SCX (iMSCSCX+) te hebben. Voor verdere celrijping worden de iMSCSCX+ gezaaid in met fibronectine gecoate siliconenplaten en ondergaan ze een geoptimaliseerd uniaxiaal spanningsprotocol met behulp van de CellScale MCFX-bioreactor. Het tenogene potentieel werd bevestigd door het observeren van de opregulatie van vroege en late peesmarkers, evenals collageenafzetting14. Deze methode voor het genereren van iTenocyten is een proof-of-concept dat een onbeperkte kant-en-klare, allogene bron kan bieden voor peesceltherapietoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol voor de productie van iTenocyten kan in drie grote stappen worden uitgevoerd: iPSC's naar iMSC's (10 dagen), iMSC naar iMSCSCX+ (2 weken), iMSCSCX+ naar iTenocyten (minimaal 4 dagen). Elke belangrijke stap in het protocol kan worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart, afhankelijk van de experimentele tijdlijn. Voor methoden die betrokken zijn bij het kweken van cellen moeten steriele technieken worden gebruikt. Alle cellen in dit protocol moeten worden gekweekt bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.

1. Humane iPSC-inductie in geïnduceerde mesenchymale stromale cellen (iMSC's)

  1. Voorbereiding van het experiment
    1. Bereid Iscove's Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) media voor.
      1. Vul 50 ml IMDM-basale media aan met 8,5 ml knock-out serumvervanging, 500 μl niet-essentiële aminozuren van Minimal Essential Medium (MEM), 0,385 μl (110 mM voorraad) bèta-mercaptoethanol en 500 μl antibioticum-antimycotische oplossing (AAS) (eindconcentraties: respectievelijk 17%, 1%, 110 μM, 1%) (zie materiaaltabel).
    2. Bereid mesenchymale stromale celmedia (MSC) voor.
      1. Vul 440 ml lage glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan met 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml antibioticum-antimycotische oplossing (AAS) en 5 ml L-glutamine (eindconcentraties: respectievelijk 10%, 1%, 2 mM).
    3. Bereid poly(2-hydroxyethylmethacrylaat) (poly-HEMA) gecoate platen voor.
      1. Voeg 10 g van de poly-HEMA (zie Materiaaltabel) toe aan een steriele fles.
      2. Voeg een magnetische roerder toe aan de fles en voeg al roerend langzaam 500 ml 95% EtOH toe.
      3. Zodra alle EtOH is toegevoegd, zet u de roermodus aan op 1200 tpm met extra laag vuur gedurende ten minste 6 uur. De poly-HEMA oplossing kan maximaal een jaar bij kamertemperatuur worden bewaard.
      4. Voeg onder steriele omstandigheden 2,5 μg/cm2 in 9 ml toe aan een T75-kolf. Pas het volume aan de grootte van het kweekvat aan.
      5. Laat de vaten met behoud van steriliteit aan de lucht drogen zodat de EtOH volledig kan verdampen voor gebruik. Dit duurt meestal 24-72 uur.
    4. Bereid met gelatine beklede kolven.
      1. Was een glazen fles met NaOH en wijd deze aan de gelatinebereiding. Gebruik geen wasmiddel.
      2. Bereid 1% gelatine-oplossing (5 g gelatine en 500 ml endotoxinevrij water). Autoclaaf de glazen fles met de gelatine-oplossing gedurende 30 minuten.
      3. Laat de gelatine-oplossing afkoelen en kan bij kamertemperatuur worden bewaard.
      4. Bestrijk een T75-kolf met 5 ml gelatineoplossing per kolf en incubeer gedurende ten minste 1 uur voordat de cellen worden gezaaid. Met gelatine omhulde kolven kunnen 1 dag van tevoren worden bereid.
    5. Bereid de buffer voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor.
      1. Meng PBS met 2% runderserumalbumine en 0,1% natriumazide. Bewaren bij 4 °C.
  2. Generatie van embryoïde lichamen (EB's)
    OPMERKING: iPSC's moeten worden gekweekt in een plaat met 6 putjes en moeten vóór gebruik 70%-80% samenvloeiing bereiken.
    1. Breng op dag 0 een PCR-plaat met heldere bodem 384 in de weefselkweekkap en UV gedurende 15 minuten zonder deksel.
    2. Verwijder het groeimedium uit de iPSC's (zie Materiaaltabel) en was de putjes met PBS.
    3. Voeg 0,5 ml voorverwarmd zacht celdissociatiereagens (zie materiaaltabel) toe aan elk putje en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Observeer de cellen elke 5 minuten totdat de iPSC's enkelvoudige cellen of kleine aggregaten zijn geworden die in suspensie zijn opgetild.
    4. Resuspendeer de celsuspensie met een pipet van 1 ml om een enkelcellige suspensie te garanderen.
    5. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het supernatant, resuspendeer in IMDM-EB-media (stap 1.1.1) en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller.
    7. Bereken het juiste volume celsuspensie dat nodig is om 5.000-25.000 cellen per putje van de plaat met 384 putjes te bereiken met 25 μL celsuspensie per putje.
      OPMERKING: Over het algemeen kunnen 2-3 confluente (70%-80%) putjes van een plaat met 6 putjes EB's maken in één plaat met 384 putjes. De grootte van cellen per EB zal empirisch worden bepaald. Voor een volledige plaat met 384 putjes moet 9,6 ml celsuspensie worden gebruikt, 25 μl per putje.
    8. Centrifugeer de cellen opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid IMDM-EB-media en 10 μM Y-27632-dihydrochloride (materiaal: 10 mM, 1000x, zie materiaaltabel) in een voorgekoelde conische buis van 15 ml.
    10. Voeg koud opgeloste basaalmembraanmatrix (1 mg per plaat met 384 putjes EB's) toe aan de conische (zie Materiaaltabel).
    11. Verdeel 25 μL van de celsuspensie over elk putje. Plaats een steriel deksel op het bord en draai gedurende 7 minuten op 450 x g bij 4 °C. Incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur.
    12. Breng de cellen op dag 2 over naar een plaat van 100 mm met 3 ml voorverwarmde IMDM-EB-media.
    13. Breng de EB's over naar de speciale T75-kolven met poly-HEMA-coating met 10 ml IMDM-EB. Pas het volume aan de grootte van het kweekvat aan. Laat de EB's 3 dagen groeien.
    14. Breng de EB's op dag 5 over in de voorbereide met gelatine beklede T75-kolven met 10 ml IMDM-EB-media. Pas het volume aan de grootte van het kweekvat aan. Laat de EB's nog 3 dagen in suspensie groeien.
    15. Zorg ervoor dat op dag 8 twee soorten EB's worden waargenomen: EB's die aan de kolf zijn bevestigd en niet-gekoppelde EB's. Spoel de niet-aangehechte EB's uit de kolf met PBS.
    16. Voeg aan de bijgevoegde EB's IMDM-EB-media toe aangevuld met TGFβ-1 (10 ng/ml) (zie materiaaltabel) en laat ze gedurende 2 dagen groeien.
    17. Verander op dag 10 het medium in MSC-medium. Cellen moeten twee keer per week worden gevoerd. Zodra 70% samenvloeit, gaat u verder met het "Standaard hefcellenprotocol" om de cellen opnieuw te plateren. Leg de cellen opnieuw op met gelatine beklede platen.
  3. Standaard protocol voor hefcellen
    1. Zodra de aanhangende cellen 70% samenvloeiing hebben bereikt, zuigt u het groeimedium van de platen op en wast u het met PBS.
    2. Til de cellen op door 5 ml voorverwarmd 0,25% trypsine toe te voegen aan elke plaat van 150 mm en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Pas het trypsinevolume aan de grootte van het kweekvat aan.
    3. Controleer onder een microscoop of de meeste cellen van elke plaat zijn getild. Als er nog cellen aan vastzitten, tikt u zachtjes op de zijkanten van de platen om de cellen los te maken.
    4. Verzamel de cellen in een conische buis door het dubbele volume van het voorverwarmde groeimedium toe te voegen.
    5. Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder het supernatans en ga verder met de volgende stappen.
  4. Beoordeling van flowcytometrie voor expressie van MSC-markers
    OPMERKING: Menselijke MSC's, zoals MSC's in het beenmerg, moeten worden gebruikt als positieve controle.
    1. Voer het "Standaard hefcellenprotocol" uit (stap 1.3).
    2. Resuspendeer het supernatans met 3 ml FACS-buffer en breng het hele volume over naar FACS-buisjes.
    3. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 300 x g. Herhaal de wasstap met FACS-buffer nog twee keer.
    4. Voeg aan de gekleurde buisjes 2 μL antihumaan CD90-FITC voor muizen, antihumaan CD44-APC voor muizen en antihumaan CD105-PE toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 45 minuten bij 4 °C.
    5. Voeg aan de isotype-regelbuisjes 20 μL muis IgG2a-FITC, muis IgG1-PB en muis IgG1-PE toe (zie Materiaaltabel).
    6. Incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 15 min. Was alle tubes door 3 ml FACS-buffer toe te voegen en 5 minuten te centrifugeren op 300 x g (bij kamertemperatuur). Resuspendeer de cellen in 250 μL FACS-buffer voor elke buis.
    7. Analyseer de expressie van de oppervlaktemarkers van de MSC's met behulp van flowcytometrie14. Excitatie- en emissiegolflengten moeten zijn: CD90-FITC, excitatiepiek bij 495 nm en emissiepiek bij 519 nm; CD44-APC, excitatiepiek bij 640 en emissiepiek bij 660 nm; CD105-PE, excitatiepiek bij 561 nm en emissiepiek bij 574 nm.

2. iMSC-passaging en -uitbreiding

  1. Reagentia voorbereiden
    1. Bereid MSC-vriesmedia voor.
      1. Combineer 30 ml lage glucose DMEM, 5 ml DMSO en 15 ml FBS (eindconcentraties: respectievelijk 60%, 10%, 30%).
      2. Filtreer de oplossing met een steriel filter van 0,45 μm. Bewaren bij 4 °C.
  2. Passeren
    OPMERKING: Na inductie moeten iMSC's nog eens 2 passages worden gekweekt op met gelatine beklede platen voordat ze worden gespeend om te groeien op plastic weefselkweekplaten. Bovendien moeten cellen worden gepasseerd met een splitsingsverhouding van 1:3 wanneer 70% samenvloeit.
    1. Voer het "Standaard hefcellenprotocol" uit (stap 1.3).
    2. Resuspendeer de cellen in MSC-media en verdeel de cellen gelijkmatig over drie nieuwe platen van 150 mm T175-kolven met 20 ml media per kolf. Breng de cellen terug naar 37 °C.
    3. Voed de cellen twee keer per week door het groeimedium te vervangen door voorverwarmde MSC-media.
  3. Bevriezing
    1. Voer het "Standaard hefcellenprotocol" uit.
    2. Resuspendeer de cellen in 1 ml MSC-vriesmedia. Voeg de 1 ml celsuspensie toe aan een cryovial en bewaar gedurende 24 uur bij -80 °C in een vriescontainer voordat u het overbrengt naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  4. Ontdooien
    1. Bereid 10 ml voorverwarmde MSC-media in een conische buis van 15 ml.
    2. Haal de cryovial eruit, dompel hem in een waterbad van 37 °C en draai tot er een ijsbal ter grootte van een erwt overblijft (ongeveer 1-2 min).
    3. Voeg in de kap van de celkweek langzaam 1 ml van het voorverwarmde medium toe aan de cryovial en pipette op en neer om te mengen.
    4. Breng de celsuspensie over van de cryovial naar de voorbereide conische buis van 15 ml met voorverwarmde media en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g (bij kamertemperatuur).
    5. Verwijder het supernatans en resuspendeer met verse media. Voeg de celsuspensie toe aan een plaat van 150 mm met een totaal volume van 20 ml. Pas het volume aan de grootte van de kweekkolf aan.
    6. Incubeer de cellen bij 37 °C tot ze klaar zijn om te splijten.

3. Genetische manipulatie van iMSC's om SCX tot overexpressie te brengen met behulp van lentivirale transductie

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol duurt twee weken om te voltooien.

  1. Bereiding van media en reagentia
    1. Bereid HEK293T/17 celmedia voor.
      1. Vul 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) aan met 50 ml FBS en 5 ml AAS (eindconcentraties: respectievelijk 10%, 1%).
    2. Bereid MSC lenti-verpakkingsmedia voor.
      1. Bereid het door warmte geïnactiveerde serum door 50 ml FBS op kamertemperatuur gedurende 30 minuten te verwarmen in een waterbad van 60 °C.
      2. Combineer 445 ml lage glucose DMEM met de door warmte geïnactiveerde FBS en 5 ml L-glutamine (eindconcentraties: respectievelijk 10%, 2 mM).
    3. Bereid het transfectiecomplex voor.
      1. Laat transfectiecomplexe componenten (zie Materiaaltabel) ontdooien op ijs: verpakkingsplasmiden VSV-G en Delta, SCX-plasmide en BioT15,16.
      2. Draai de plasmiden zachtjes naar beneden en draai ze naar beneden. Meet de DNA-concentraties.
      3. Bereken op basis van de DNA-concentraties en het aantal kolven dat bedoeld is voor transfectie het volume van elke benodigde component: voor één T75-kolf zal het transfectiecomplex bestaan uit 750 μL serumvrij medium (zoals serumvrij DMEM of PBS), 7,5 μg SCX-plasmide, 0,75 μg VSV-G-plasmide, 6,75 μg Delta-plasmide en 22,5 μL BioT. Houd rekening met extra pipetteerfouten.
      4. Meng door zachtjes op en neer te pipetteren. Draai kort in een centrifuge. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gebruik onmiddellijk.
  2. Transfectie en lentivirale productie
    LET OP: Vanaf dag 3 houdt het protocol in dat er met lentivirus wordt gewerkt, en daarom moet het werk worden uitgevoerd met behulp van operationele procedures van inperkingsniveau 2+. Werknemers moeten persoonlijke beschermingsmiddelen dragen, waaronder twee lagen handschoenen, polsbedekking, veiligheidsbril, een masker en een lange broek en gesloten schoenen. Al het afval en materialen, inclusief pipetpunten, kolven en vloeibaar medium, moeten gedurende ten minste 20 minuten worden ontsmet met bleekmiddel (laatste 1% natriumhypochloriet). Gebruik de stofzuiger niet.
    1. Zaad HEK293T/17 cellen.
      1. Ongeveer 18-24 uur voorafgaand aan de transfectie (dag 0) de 293T-cellen optillen en in T75-kolven plaatsen. De volgende delen gaan uit van T75 als het kweekvat. Pas het volume aan volgens het gebruikte celkweekvat.
      2. Verwijder het kweekmedium uit de kolven en was met 5 ml PBS.
        OPMERKING: De cellen komen heel gemakkelijk van het oppervlak van de kolf af. Voeg PBS toe aan de zijkant van de kolf en vermijd directe toevoeging van oplossing aan de cellen.
      3. Voeg 3 ml voorverwarmd 0,25% trypsine toe aan elke kolf en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Verzamel de cellen in een conische buis en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g.
      4. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 293T-media en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller.
      5. Plaat de cellen bij 5,3 x 104 cellen/cm2 en incubeer ze gedurende een nacht bij 37 °C.
      6. Bereid de volgende dag (dag 1) het transfectiecomplex voor. Vervang het groeimedium uit de cellen door 5 ml voorverwarmd MSC lenti-verpakkingsmedium (stap 3.1.2).
      7. Voeg het transfectiecomplex druppelsgewijs toe aan de cellen. Kantel de schaal voorzichtig om een gelijkmatige blootstelling van het transfectiecomplex aan de cellen te garanderen. Breng de cellen 48 uur terug naar de incubator.
        OPMERKING: Toxiciteit moet na 24 uur (dag 2) worden waargenomen.
      8. Vang na 48 uur (dag 3) het virusbevattende medium voorzichtig op in een apart conisch buisje met behulp van een pipet en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g (bij kamertemperatuur).
      9. Voeg 5 ml voorverwarmd MSC-lenti-verpakkingsmedium toe aan de T75-kolf met 293T-cellen en breng een nacht terug naar de incubator.
      10. Filtreer het supernatans na het centrifugeren met een steriel filter van 0,45 μm door het supernatans rechtstreeks door het filter te pipetteren. Bewaar het virusbevattende medium een nacht bij 4 °C.
      11. Na nog eens 24 uur (dag 4) het virusbevattende medium opnieuw voorzichtig met een pipet in een apart conisch buisje verzamelen en gedurende 5 minuten centrifugeren op 300 x g (bij kamertemperatuur).
      12. Combineer het virus met het virus van de vorige verzameldag en meng om een homogene oplossing te krijgen. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart, afhankelijk van de experimentele tijdlijn. Het lentivirus kan worden gealiquoteerd en ingevroren bij -80 °C, of het lentivirus kan op ijs worden bewaard terwijl het doorgaat met "Transductie van iMSC's met SCX" (stap 3.3).
        NOTITIE: Zodra de lentivirusaliquots zijn ingevroren en ontdooid, mogen ze niet opnieuw worden ingevroren.
  3. Transductie van iMSC's met SCX
    1. Voer titerplaattransductie uit.
      1. Voer op dag 0 het "Standaard protocol voor hefcellen" uit.
      2. Resuspendeer de cellen in MSC-media en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller.
      3. Voeg in een plaat met 6 putjes 4 x 103 cellen/cm2 toe. Verplaats de rest in een extra plaat van 150 mm met 20 ml MSC-media (dit wordt de controleplaat). Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C.
      4. De volgende dag (dag 1) moeten de cellen ~40% samenvloeiend zijn. Verwarm het groeimedium van de lentiverpakking voor en ontdooi het polybreen en ongeveer 3 ml lentivirus op ijs (of als het op dezelfde dag wordt gedaan als het virus wordt verzameld, bewaar het dan op ijs tot gebruik).
      5. Voeg lenti-verpakking groeimedium en lentivirus toe aan de putjes op basis van de gewenste titers (d.w.z. 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Voeg 0,5 μl polybreen toe om een eindconcentratie van 5 μg/ml te bereiken (materiaalconcentratie: 10 mg/ml, zie materiaaltabel).
      6. Draai de plaat rond om een gelijkmatige blootstelling aan alle cellen te garanderen. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C gedurende 48 uur.
    2. Beoordeel de efficiëntie van de SCX-lentivirustiter met flowcytometrie.
      1. Voer na 48 uur het "Standaard hefcellenprotocol" uit.
      2. Resuspendeer de cellen in PBS en tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of celteller. Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 300 x g.
      3. Verwijder het supernatans en resuspendeer het in 3 ml FACS-buffer om te wassen. Breng de celsuspensie over in flowcytometriebuisjes en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
      4. Herhaal de FACS-bufferwasbeurt nog twee keer en resuspendeer de laatste celpellets in 300 μL FACS-buffer. Beoordeel de expressie van GFP voor elke titer met behulp van een flowcytometriemachine.
      5. Bepaal op basis van de titers en het aantal cellen de juiste lentivirustiter om door te gaan met de transductie. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart, afhankelijk van de experimentele tijdlijn.
    3. Voer grootschalige SCX-transductie uit.
      OPMERKING: De vermelde volumes zijn per 1x 150 mm plaat of 1x T175 kolf. Dit kan dienovereenkomstig worden aangepast, afhankelijk van de gewenste grootte van het vat en de schaal van de transductie.
      1. Voer op dag 0 het "Standaard protocol voor hefcellen" uit.
      2. Resuspendeer de cellen in MSC-media en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller. Zaai de cellen bij 4 x 103 cellen/cm2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C.
      3. De volgende dag (dag 1) moeten de cellen ~40% samenvloeiend zijn. Verwarm het lenti-verpakkende groeimedium voor en ontdooi het polybreen en de vooraf berekende hoeveelheid lentivirus op ijs.
      4. Voeg op basis van de gekozen titer de gewenste hoeveelheid lenti-verpakking groeimedium en lentivirus toe aan de putjes. Voeg 5 μg/ml polybreen toe (voorraadconcentratie: 10 mg/ml).
      5. Observeer op dag 3 de cellen onder een fluorescerende microscoop. De nieuw geproduceerde iMSCSCX+ zou GFP moeten fluoresceren. Vervang het virushoudende medium door voorverwarmde MSC-media. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart, afhankelijk van de experimentele tijdlijn.

4. iMSCSCX+ passaging en uitbreiding

  1. Voer het passeren, uitbreiden, invriezen en ontdooien van iMSCSCX+ uit volgens hetzelfde als voor iMSC's, zoals beschreven in stap 2 van het protocol.

5. Mechanische belasting

OPMERKING: Dit gedeelte duurt minimaal 4 dagen, maar kan langer zijn, afhankelijk van of celcontractie wordt waargenomen.

  1. Voorbereiding van het experiment
    1. Bereid de siliconen platen voor.
      1. Autoclaaf 2 siliconen platen (zie Tabel met materialen). Haal daarna onder steriele omstandigheden de siliconenplaten uit de autoclaafzak en plaats ze in platen van 150 mm.
      2. Combineer 130 μL fibronectine (100x, zie Materiaaltabel) met 13 ml steriele PBS in een conische buis van 15 ml. Keer de buis meerdere keren om om te mengen.
      3. Voeg 400 μL fibronectine-oplossing toe aan elk putje van de siliconenplaten. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende minimaal 2 uur of een nacht.
      4. Zuig voor gebruik de fibronectine-oplossing op en laat de platen minimaal 30 minuten aan de lucht drogen in de celkweekkap om de fibronectine-oplossing volledig te laten verdampen.
        OPMERKING: De fibronectine-oplossing kan van tevoren uit de putjes worden verwijderd en de nu gecoate platen kunnen tot een paar weken tot gebruik op 37 °C blijven staan.
    2. Bereid de MSC-stretchmedia voor.
      1. Bereid MSC-rekmedia voor door 140 μL ascorbinezuur (voorraad: 100x, eindconcentratie: 50 μg/ml) toe te voegen aan 14 ml voorverwarmde MSC-media in een conische buis van 15 ml.
        OPMERKING: Het ascorbinezuur moet voor elke mediawissel vers aan de MSC-media worden toegevoegd.
  2. Zaaien van iMSCSCX+ in de siliconen platen
    1. Voer het "Standaard hefcellenprotocol" uit (stap 1.3).
    2. Resuspendeer de cellen in MSC-media en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller.
    3. Bereken het volume van de celsuspensie dat nodig is om 1,25 x 104 cellen/cm2 te verkrijgen.
    4. Verwijder deze hoeveelheid MSC-rekmedia uit de conische buis van 15 ml. Voeg de doelcellen toe. Keer de nieuwe celsuspensie om naar homogeen.
    5. Voeg 400 μL van de nieuwe celsuspensie toe aan elk putje van beide siliconenplaten.
    6. Plaats het deksel terug op de platen van 150 mm en plaats ze terug in de broedmachine bij 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Uniaxiale spanning
    1. Spoel de volgende dag het rekapparaat (zie Materiaaltabel) met ddH2O gevolgd door 70% ethanol. Veeg het apparaat schoon, plaats het in de celkweekkap en UV gedurende 15 minuten.
    2. Haal de gezaaide platen op en controleer de putjes op goede celbevestiging.
    3. Laat één plaat in de incubator (statische controle) en plaats de siliconenplaat met tweede zaad in het rekapparaat door de schroeven uit te lijnen met de gaten in de siliconenplaat. Plaats het deksel terug op het apparaat om de steriliteit te garanderen.
    4. Bevestig het apparaat met de gezaaide siliconenplaat aan de elektronische bron (zie Materiaaltabel) en plaats het in de incubator bij 37 °C.
    5. Stel in het programma het cyclische rekprotocol in op 4% sinusvormige belasting, 0,5 Hz, 2 uur per dag. Begin het rekken door eenmaal op de startknop te drukken. Het rekken moet onmiddellijk beginnen.
    6. Rek de cellen minimaal 3 dagen uit. Controleer de cellen dagelijks en stop het rekprotocol als celcontractie kan worden waargenomen. Vervang de media om de dag naar verse MSC-stretchmedia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Differentiatie van menselijke iPSC's naar iMSC's
Zoals eerder beschreven, omvat het huidige protocol voor het differentiëren van iPSC's in iMSC's de vorming van embryoïde lichamen2. Dit proces duurt ongeveer tien dagen om iMSC's uit iPSC's te induceren (Figuur 1A). Het wordt echter ten zeerste aanbevolen om de nieuw gegenereerde iMSC's minstens twee keer te passeren. Dit helpt niet alleen om de behoefte aan gelatine-gecoate platen te elimineren, ma...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol worden iTenocyten gegenereerd door middel van drie hoofdstappen: (1) inductie van iPSC's tot iMSC's, (2) overexpressie van SCX met behulp van een lentivirale vector en (3) rijping van cellen door 2D uniaxiale spanning.

Het gepresenteerde protocol voor het differentiëren van iPSC's in iMSC's is eerder beschreven door onze groep2. Sinds die publicatie zijn er tal van protocollen ontwikkeld, waaronder een vastgesteld protocol voor het gebruik van iMSC's in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH/NIAMS K01AR071512 en CIRM DISC0-14350 aan Dmitriy Sheyn. De twee plasmiden die lentivirusverpakkingen verpakken, waren een geschenk van het Simon Knott-laboratorium (Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solutionThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC mouse anti-human CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K isotype controlBD Biosciences555745
BenchMark fetal bovine serumGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Bovine serum albuminMillipore SigmaA3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol redThermofisher11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectin bovine plasmaSigma AldrichF1141
FITC mouse anti-human CD90BD Biosciences555595
Gelatin from porcine skinSigma AldrichG1890
Goat anti Mouse IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, no phenol redThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut serum replacementThermofisher10828010
L-ascorbic acidSigma AldrichA4544
L-GlutamineThermofisher2503081
MatrigelCorning354230basement membrane matrix
MechanoCulture FXCellScaleN/Astretching apparatus
MEM non-essential amino acids solutionThermofisher11140050
Mohawk human Taqman primerThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primerThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene infection/transfection reagentsMillipore SigmaTR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis human Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF cloneOriGeneRC224305L4
Silicone platesCellScaleN/A
Sodium azideMillipore SigmaS2002
Tenascin C human Taqman primerThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primerThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primerThermofisherHs00170261_m1
Transfection reagent, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermofisher25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dihydrochlorideBiogems1293823

Referenties

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905(2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977(2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Geïnduceerde pluripotente stamcellengeneratie van iTenocytenmesenchymale stromale cellenpeesregeneratiecelgebaseerde therapiebioreactor-stretchingcollageendepositiegenexpressieanalyse
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide iTenocyten via gecombineerde scleraxis-overexpressie en 2D uniaxiale spanning
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.