Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bilateraal renale ischemie-reperfusiemodel voor acuut nierletsel bij muizen

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65838

⸱

2 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het ischemie-reperfusieletsel (IRI)-model kan worden gebruikt in verschillende stadia van de ontwikkeling van acuut nierletsel (AKI), vooral tijdens de progressie van AKI naar chronische nierziekte (CKD). Hier beschrijven we de procedure voor de ontwikkeling van IRI-modellen bij muizen via een trans-abdominale benadering, waarbij niersteeltjes via een vasculaire clip worden afgeklemd om ischemisch letsel te induceren.

Samenvatting

Acuut nierletsel (AKI) wordt gedefinieerd als een snelle achteruitgang van de nierfunctie, waarbij aanhoudende nierdisfunctie geleidelijk overgaat in chronische nierziekte (CKD) als gevolg van het onomkeerbare verlies van nefronen en hun onaangepaste herstel. In de afgelopen jaren is de incidentie van AKI toegenomen met betrekking tot diverse etiologieën, waaronder volumedepletie, sepsis, nefrotoxiciteit, spierletsel en ernstig trauma, waarbij ischemie-reperfusieschade (IRI) verantwoordelijk is voor de meeste episodes. De ontwikkeling van het IRI-model bij muizen wordt geïnduceerd door chirurgische klemming van de niersteeltjes, wat krachtige en controleerbare hulpmiddelen biedt voor preklinische modellen van AKI. Belangrijk is dat het IRI-model in verschillende stadia van de AKI-ontwikkeling wordt ingezet, vooral in de processen van AKI naar CKD. Ondanks dat het IRI-model in veel laboratoria op grote schaal wordt toegepast, is er nog steeds een reeks variabelen die de resultaten van dit model beïnvloeden. Hier beschrijven we de procedure van IRI-modelontwikkeling om onderzoekers een herhaalbare en betrouwbare methode te bieden om de onderliggende pathogenese in de ontwikkeling van AKI en de progressie van AKI naar CKD te onderzoeken.

Inleiding

Acuut nierletsel (AKI) is een ernstig klinisch syndroom met significante morbiditeit en mortaliteit, gedefinieerd als een verhoging van het serumcreatinine van ≥ 0,3 mg/dL (26,5 μM/L) binnen 48 uur of een verhoging van het serumcreatinine tot ≥ 1,5 keer de uitgangswaarde binnen 7 dagen, of een urinevolume < 0,5 ml/kg/uur gedurende 6 uur1, 2,3. Ondanks tientallen jaren van onderzoek ontbreekt het aan effectieve therapie voor AKI om nierbeschadiging te verlichten of het nierherstel te versnellen, en een aanzienlijk deel van de AKI-patiënten ontwikkelt zich tot chronische nierziekte (CKD)4,5,6. Complexe moleculen en routes zijn gedeeltelijk betrokken bij AKI en de progressie ervan, dus preklinische modellen bieden krachtige hulpmiddelen om deze complexiteiten te ontrafelen voor de ontwikkeling van efficiënte therapeutische modaliteiten.

Klinisch gezien is ischemie-reperfusieschade (IRI) -letsel de belangrijkste oorzaak van AKI bij verschillende aandoeningen, waaronder hart- en leveroperaties, circulatoire shock, volumedepletie, sepsis, renale vasculaire occlusie of obstructie, niertransplantatie, enzovoort7. Het IRI-AKI-muismodel is in gebruik sinds de jaren 1960; Dit model is ontwikkeld door chirurgische klemming van de niersteeltjes met niet-traumatische klemmen bij muizen, wat leidt tot ischemie en gevolgd door reperfusie van de nierbloedstroom door het verwijderen van de klemmen. Het IRI-AKI-model wordt doorgaans gekenmerkt door dood van renale tubulaire cellen en progressieve beschadiging van nierweefsel. De IRI is om verschillende redenen een van de meest voorkomende modellen die worden gebruikt voor de pathogenese en therapeutische interventie bij AKI: (1) De eenvoud en veiligheid van de chirurgische ingreep verbeteren het overlevingspercentage en het slagingspercentage van het IRI-AKI-model8; (2) Aangezien ischemie een belangrijke etiologie is bij menselijke AKI, kan het IRI-AKI-model beter worden gebruikt voor het beoordelen van klinische AKI-gebeurtenis9; (3) Het IRI-model zou nierbeschadiging en histopathologische veranderingen in verschillende stadia van AKI kunnen presenteren, wat ook van toepassing is op het bestuderen van de progressie van AKI naar CKD10. Afhankelijk van het experimentele ontwerp omvatten IRI-geïnduceerde AKI-modellen bilaterale IRI, unilaterale IRI met intacte contralaterale nier en unilaterale IRI met gelijktijdige contralaterale nefrectomie. Met name het bilaterale IRI-model wordt als relevanter beschouwd voor menselijke pathologische aandoeningen van AKI, omdat beide nieren zijn aangetast door de bloedtoevoer11. Het IRI-model is toepasbaar om de effecten te simuleren van een verminderde nierbloedstroom na niertransplantatie, cardiale bypass, niervasculaire of nefronsparende chirurgie, evenals bij hypotensie9. Hier beschrijven we de procedure voor een bilateraal IRI-model om onderzoekers een consistente en betrouwbare methode te bieden om de onderliggende pathogenese in door ischemie geïnduceerde AKI te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Mannelijke C57BL/6J-muizen op een leeftijd van 8 weken en met een gewicht van 25 g werden gebruikt om het AKI-model vast te stellen door middel van bilaterale ischemie-reperfusie. Volgens eerdere studies houden we de lichaamstemperatuur rond de 36.5 °C-37 °C en is de duur van de nierischemie 30 minuten bij de IRI-operatie12,13. Er waren in totaal 6 muizen nodig voor elke groep, en schijnmuizen dienden als controles. De dierproeven in deze studie zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Zhejiang om het welzijn van dieren te beschermen. Alle dieronderzoeksprocedures werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen en principes van de Universiteit van Zhejiang.

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten onder hoge druk.
  2. Bereid de verdovingsoplossing voor door 2 ml ketamine en 0,4 ml xylazine toe te voegen aan 7,6 ml steriele zoutoplossing. Verdoof de muis met een mengsel van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (16 mg/kg) door middel van intraperitoneale injectie. Beoordeel de diepte van de verdoving met behulp van de teenknijpreflex.
  3. Plaats de verdoofde muis op de homeotherme deken om ervoor te zorgen dat de luchtweg vrij blijft. Houd de lichaamstemperatuur in het bereik van 36,5-37 °C.
  4. Bedek de ogen van de muis met 1% tetracyclinehydrochloride oogzalf om uitdroging onder narcose te voorkomen.
  5. Scheer het haar van de buik met een tondeuse en reinig de huid van het operatiegebied met een povidon-jodiumoplossing gedurende 3x.

2. Operatie

  1. Maak met een chirurgische schaar een middenincisie in de buik van ongeveer 1-1,5 cm via de huid- en spierlaag en open de buikholte met een spreider.
  2. Stel de nier bloot door het retroperitoneale vet te verplaatsen en de darmen en andere organen met een wattenstaafje buitenspel te duwen. De nier bevindt zich in de retroperitoneale ruimte, ongeveer 0,5 cm lateraal van de wervelkolom en onder de 13erib.
  3. Ontleed de niersteel met een fijne puntige tang om de fascia en het vetweefsel te scheiden en te verwijderen en de linker niersteeltjes bloot te leggen.
  4. Klem de niersteeltjes vast met een vaatklem met behulp van een klem met behulp van een tang en zorg ervoor dat de vaatbeschadiging zo klein mogelijk is. Vermijd het afklemmen van overtollig niersinusvet, wat kan leiden tot onvolledige nierischemie.
  5. Stel de duur van de nierischemie in, te beginnen met 30 minuten klemmen. Het kenmerk van succesvolle ischemie is dat de nier binnen enkele minuten geleidelijk verandert van rood naar dieppaars.
  6. Verplaats de nier naar de retroperitoneale ruimte. Herhaal de procedure aan de contralaterale zijde om de rechter niersteeltjes bloot te leggen en vast te klemmen.
  7. Noteer de ischemietijd aan elke kant afzonderlijk om ervoor te zorgen dat beide nieren de exacte duur van ischemie krijgen. Open de incisie opnieuw en laat de vaatclip los aan het einde van de ischemieduur.
  8. Plaats de nier terug in de retroperitoneale ruimte en hecht vervolgens de spier en huid laag voor laag met de Vicryl 4-0 hechtdraad.
    OPMERKING: De chirurgische ingrepen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Reinig de operatietafel en instrumenten indien nodig tijdens het gebruik met 75% ethanol.

3. Postoperatieve zorg

  1. Dien 0,5-1 ml warme en steriele zoutoplossing toe via intraperitoneale injectie om het vochtverlies te compenseren.
  2. Houd de sternale lighouding met aandacht aan totdat de muis weer voldoende bij bewustzijn is. Leg de muis op de homeotherme deken totdat hij volledig bij bewustzijn is en keer dan terug naar zijn kooi. Breng de muis niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat hij volledig hersteld is.
  3. Geef buprenorfine 0,05-0,10 mg/kg elke 12 uur gedurende de eerste 3 dagen om postoperatieve pijn te verlichten. Houd de chirurgische muizen elke dag in de gaten.

4. Evaluatie van het model

  1. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring
    1. Euthanaseer dieren met pentobarbital-natrium door middel van intraperitoneale injectie op dag 1, 3, 7 of 14 na IRI.
    2. Fixeer vers nierweefsel 's nachts met 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar het in 75% ethanol bij 4 °C.
    3. Snijd na dehydratatie en inbedding de verkregen monsters in een dikte van 8 μm om te kleuren.
    4. Ontvet de weefselsecties in xyleen en rehydrateer vervolgens met afnemende concentraties ethanol.
    5. Kleur de weefselsecties met hematoxyline en eosine.
    6. Dehydrateer de weefselsecties door de concentraties ethanol en xyleen te verhogen.
  2. Bepaling van de nierfunctie
    1. Verzamel bloedmonsters met behulp van de oogbolbloedafnamemethode na anesthesie.
    2. Centrifugeer bloedmonsters bij 12000 x g gedurende 10 minuten om het serum te scheiden.
    3. Bepaal serumcreatinine en bloedureumstikstof (BUN) met behulp van de automatische droge-chemieanalysator om de nierfunctie te controleren.
  3. Realtime PCR (RT-PCR)
    1. Extraheer totaal RNA uit nierweefsel met behulp van een snelle RNA-extractiekit en synthetiseer vervolgens cDNA met een reverse transcriptase-mixkit. Voer RT-PCR uit met de SYBR Green Premix Kit en voer het uit op het RT-PCR-instrument. De hier gebruikte primersequenties werden gerapporteerd vóór14: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; achterzijde 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3"; NGAL vooruit, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; achterzijde 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTAGTCC-3"; GAPDH vooruit, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; omgekeerde 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Staat van de nier tijdens de operatie

Het kenmerk van succesvolle ischemie is dat de nier binnen 1-2 minuten geleidelijk verandert van rood naar dieppaars, en succesvolle reperfusie wordt gekenmerkt door de nier die binnen 1-2 minuten geleidelijk verandert van dieppaars naar rood.

Histologie van de nier na een operatie

HE en Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring zijn de dir...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel hebben we een gedetailleerde procedure gegeven voor het renale IRI-model, waarbij we vervolgens hebben benadrukt dat het een robuust model is voor de progressie van AKI en AKI naar CKD. Daarnaast tonen we de impact aan van de twee belangrijkste criteria van nierbeschadiging, waaronder de histologie en functie van de nier.

Verschillende belangrijke punten bij chirurgische ingrepen moeten worden benadrukt voor een herhaalbaar en betrouwbaar model....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We spreken onze waardering uit voor alle deelnemers voor hun medewerking aan het huidige onderzoek. Deze studie werd ondersteund door de financiering van de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LZ22H050001) en het provinciale programma van Zhejiang voor de teelt van innovatieve gezondheidstalenten op hoog niveau voor Weiqiang Lin.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DierenhaarkniptangFEIYUBIO19-7002
1-ml spuitenLongreenSR60061
EthanolMacklinE885996
GaasFEIYUBIO19-5022
Homeothermische bewakingssysteemWarmmate40 x 50
NadelhouderDKBTCZQ-00160
SpreiderRWDR22029-03
Steriele zoutoplossingBiosharpBL158A
WeefselserpDKBTDC-YKJ1002
WeefselpincetDKBTDK079904
Vasculaire clipFine Science Tools18055-02
Vicryl-naaldShanghai Jinhuan4 -0 
```

Referenties

  1. Al-Jaghbeer, M., Dealmeida, D., Bilderback, A., Ambrosino, R., Kellum, J. A. Clinical decision support for in-hospital AKI. J Am Soc Nephrol. 29 (2), 654-660 (2018).
  2. Kellum, J. A., Lameire, N. KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1). Crit Care. 17 (1), 204(2013).
  3. Zhang, C., et al. The Hippo pathway and its correlation with acute kidney injury. Zool Res. 43 (5), 897-910 (2022).
  4. He, L., et al. AKI on CKD: heightened injury, suppressed repair, and the underlying mechanisms. Kidney Int. 92 (5), 1071-1083 (2017).
  5. Sato, Y., Takahashi, M., Yanagita, M. Pathophysiology of AKI to CKD progression. Semin Nephrol. 40 (2), 206-215 (2020).
  6. Wang, Z., Zhang, C. From AKI to CKD: Maladaptive repair and the underlying mechanisms. Int J Mol Sci. 23 (18), 10880(2022).
  7. Hoste, E. A. J., et al. Global epidemiology and outcomes of acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 14 (10), 607-625 (2018).
  8. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  9. Skrypnyk, N. I., Siskind, L. J., Faubel, S., de Caestecker, M. P. Bridging translation for acute kidney injury with better preclinical modeling of human disease. Am J Physiol Renal Physiol. 310 (10), F972-F984 (2016).
  10. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  11. Zhang, J., et al. A two-stage bilateral ischemia-reperfusion injury-induced AKI to CKD transition model in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 319 (2), F304-F311 (2020).
  12. Hukriede, N. A., et al. Experimental models of acute kidney injury for translational research. Nat Rev Nephrol. 18 (5), 277-293 (2022).
  13. Bao, Y., Yuan, Y., Chen, J., Lin, W. Kidney disease models: tools to identify mechanisms and potential therapeutic targets. Zool Res. 39 (2), 72-86 (2018).
  14. Bao, Y., et al. DNA demethylase Tet2 suppresses cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Discov. 7, 167(2021).
  15. Rossiter, A., La, A., Koyner, J. L., Forni, L. G. New biomarkers in acute kidney injury. Crit Rev Clin Lab Sci. 5, 1-22 (2023).
  16. Hesketh, E. E., et al. Renal ischemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. J Vis Exp. (88), e51816(2014).
  17. Zager, R. A., Altschuld, R. Body temperature: an important determinant of severity of ischemic renal injury. Am J Physiol. 251, F87-F93 (1986).
  18. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  19. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).
  20. Tannenbaum, C., Ellis, R. P., Eyssel, F., Zou, J., Schiebinger, L. Sex and gender analysis improves science and engineering. Nature. 575, 137-146 (2019).
  21. Lee, H. T., Ota-Setlik, A., Fu, Y., Nasr, S. H., Emala, C. W. Differential protective effects of volatile anesthetics against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. Anesthesiology. 101 (6), 1313-1324 (2004).
  22. Heyman, S. N., Rosen, S., Rosenberger, C. Animal models of renal dysfunction: acute kidney injury. Expert Opin Drug Discov. 4 (6), 629-641 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Nierziektemuismodelnierfunctiechronische nierziekteafklemmen van de nierpedikelnefronverliespreklinische modellen

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.