Hier presenteren we een ratmodel met gesloten hoofd en de validatie ervan die een opmerkelijke gelijkenis vertoont met menselijke mTBI met betrekking tot gedragsmanifestaties tijdens de acute en subacute stadia.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Rattenmodel van licht traumatisch letsel met gesloten hoofd en de validatie ervan
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diermodellen zijn cruciaal voor het vergroten van ons begrip van licht traumatisch hersenletsel (mTBI) en het begeleiden van klinisch onderzoek. Om tot zinvolle inzichten te komen, is het ontwikkelen van een stabiel en reproduceerbaar diermodel essentieel. In deze studie rapporteren we een gedetailleerde beschrijving van een mTBI-model met gesloten kop en een representatieve validatiemethode met behulp van Sprague-Dawley-ratten om het modelleringseffect te verifiëren. Het model houdt in dat een gewicht van 550 g vanaf een hoogte van 100 cm rechtstreeks op het hoofd van een rat op een vernietigbaar oppervlak valt, gevolgd door een draai van 180 graden. Om de verwonding te beoordelen, ondergingen ratten 10 minuten na de verwonding een reeks neurologische gedragsbeoordelingen, waaronder de tijd van bewustzijnsverlies, de tijd van het eerste zoekgedrag, het ontsnappingsvermogen en de straalbalansvaardigheidstest. Tijdens de acute en subacute stadia na het letsel werden gedragstests uitgevoerd om het motorische coördinatievermogen (Beam-taak), angst (Open Field-test) en leer- en geheugenvermogen (Morris Water Maze-test) te beoordelen. Het mTBI-model met gesloten kop produceerde een consistente letselrespons met minimale mortaliteit en repliceerde situaties uit het echte leven. De validatiemethode verifieerde effectief de modelontwikkeling en zorgde voor de stabiliteit en consistentie van het model.
Inleiding
Licht traumatisch hersenletsel (mTBI), of hersenschudding, is de meest voorkomende vorm van letsel en kan leiden tot verschillende kortdurende en chronischesymptomen1. Deze symptomen kunnen onder andere duizeligheid, hoofdpijn, depressie en anhedonie zijn, wat leidt tot aanzienlijk lijden voor personen die getroffen zijn door mTBI2. Aangezien de meeste mTBI's worden veroorzaakt door stomp trauma3, wordt het noodzakelijk om diermodellen te ontwikkelen die dergelijke verwondingen nauwkeurig nabootsen. Deze modellen zijn essentieel voor het verkrijgen van een beter begrip van het letsel en de onderliggende mechanismen ervan, en bieden een gecontroleerde omgeving met verminderde variabiliteit en heterogeniteit in vergelijking met studies bij mensen.
Er zijn tal van gevestigde knaagdiermodellen ontwikkeld voor traumatisch hersenletsel (TBI), waaronder fluid percussion injury (FPI)4, controlled cortical impact (CCI)5, weight-drop injury6, blast traumatisch hersenletsel7 en andere. Deze modellen richten zich echter voornamelijk op het repliceren van matige tot ernstige TBI-scenario's. Daarentegen hebben de experimentele modellen die specifiek zijn ontworpen om mTBI te simuleren relatief minder aandacht gekregen en blijven ze onderbelicht8. Daarom is het van cruciaal belang om een stabiel en reproduceerbaar diermodel op te zetten dat mTBI nauwkeurig weergeeft. Een dergelijk model zou ons begrip van de neurobiologische en gedragsmatige gevolgen van mTBI aanzienlijk vergroten.
Men kan de functionele tekorten bij mTBI-ratten niet onderscheiden in vergelijking met normale ratten via toevallige observatie nadat de effecten van anesthesie zijn uitgewerkt. Daarom is het noodzakelijk om specifieke tests uit te voeren. Bij mensen wordt een breed scala aan klinische beoordelingen gebruikt om patiënten te evalueren 9,10,11. Evenzo vereist het opzetten van een succesvol model in het rattenmodel ook het gebruik van snelle beoordelingsinstrumenten om de geldigheid ervan te bepalen.
In deze studie presenteren we een mTBI-rattenmodel met gesloten hoofd, waardoor mTBI kan worden onderzocht op een manier die sterk lijkt op de menselijke conditie. De gedetailleerde beschrijving van het model en de validatieprocedure biedt een uitgebreid begrip van de experimentele benadering die wordt gebruikt bij het bestuderen van mTBI.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door de Central South University Animal Care and Use Committee. Alle onderzoeken zijn uitgevoerd in overeenstemming met de welzijns- en ethische principes van proefdieren.
1. Procedure voor het voeren en verdoven van dieren
- Groepeer 280-320 g Sprague-Dawley mannelijke ratten en houd ze op een 12 uur/12 uur licht/donker cyclus met toegang tot voedsel en water ad libitum. Voer het onderzoek uit nadat de ratten 6 dagen hebben geacclimatiseerd.
- Verdoof de rat met 3% isofluraan bij een luchtstroom van 0,6 l/min in een inductiebox totdat hij niet meer reageert op het beknellen van de poot of staart. Houd het debiet 30 s aan.
OPMERKING: Pijnstillers werden niet gebruikt omdat ze de reactie van de rat in de neurologische gedragsbeoordelingen zouden verstoren.
2. Preoperatieve installatie
- Plaats een spons met een hardheidswaarde van 35D (gewicht van 35 kg/m3 spons), met dezelfde lengte en breedte maar een dikte van 12 cm, in een acryldoos (15 cm x 22 cm x 43 cm) zonder bovendeksel.
- Knip een aluminiumfolie (een dikte van 20 μm) af en plak deze met plakband op de acryldoos om een vernietigbaar oppervlak te vormen dat het gewicht van een rat kan dragen. Markeer bovendien een snijlijn van ongeveer 10 cm als de aangewezen locatie voor het positioneren van de kop van de rat.
- Zet de PVC-buis stevig vast met behulp van een ijzeren standaard. Bereid een geperforeerd gewicht voor, met een gewicht van 550 gram met een diameter van 18 millimeter. Bevestig het gewicht aan een vislijn op een hoogte van 1 meter in een polyvinylchloride of PVC-buis. en pas de positie van de geleidebuis 3 centimeter boven de aluminiumfolie aan.
- Leg een helm en een kussen klaar. Maak een helm met een roestvrijstalen schijf met een diameter van 10 mm en een dikte van 3 mm. Maak een wigvormig sponskussen klaar om onder de kop van de rat te plaatsen, zorg ervoor dat het loodrecht op de zwaartekracht staat.
OPMERKING: Een schematisch diagram van het slagapparaat wordt weergegeven in figuur 1. De helm dient om de impactlocatie te identificeren en de verdeling van externe kracht te verbeteren. Het kussen wordt gebruikt om uniforme en stabiele schade te garanderen.
3. mTBI-inductie
- Leg de verdoofde rat snel op zijn borst op de aluminiumfolie.
OPMERKING: Er zijn twee operators nodig voor mTBI-inductie: één voor de voorbereiding en de andere voor verificatie. - Voorbereiding: Leg het kussen onder de rat en zorg ervoor dat de kop evenwijdig is aan het foliepapier. Lijn de helm uit met de oren van de rat en zet hem op zijn plaats.
- Verificatie: Controleer of de PVC-buis zich direct boven de helm bevindt. Zodra beide operators de juiste instelling hebben bevestigd, gaat u verder met de volgende stap.
- Inductie van de rotatie van het hoofd: Laat het gewicht los, zodat het kan vallen en de kop van de rat kan raken, waardoor een val op de spons en een rotatie van 180° wordt veroorzaakt.
- Leg de rat op zijn rug in een schone kooi.
4. Schijninductie
- Behandel de rat op dezelfde manier als de vorige mTBI-inductiebeschrijving, maar stel hem niet bloot aan de impact op het hoofd.
5. Validatieprocedure: Acute neurologische gedragsbeoordelingen
OPMERKING: De volgende beoordelingen zijn aangepast op basis van de Neurological Severity Scores9 en het protocol van Flierl et al.10. Al deze beoordelingen werden uitgevoerd 10 minuten nadat de rat de oprichtreflex had hersteld.
- Tijdstip van bewustzijnsverlies: Noteer de duur vanaf het moment dat de rat wordt verdoofd tot het moment waarop hij de oprichtreflex herstelt.
OPMERKING: De oprichtende reflex is het proces waarbij de rat zich omdraait wanneer hij op zijn rug wordt gelegd. Verlies van de oprichtreflex moet worden beschouwd als een humaan eindpunt en het dier moet worden geëuthanaseerd volgens de institutionele richtlijnen. - Tijd voor het eerste zoekgedrag: Noteer de duur vanaf het moment dat de rat wordt verdoofd tot het moment dat hij het zoekgedrag voor de eerste keer vertoont.
OPMERKING: Zoekend gedrag is een teken van interesse in de omgeving, een fysiologische reactie. - Mogelijkheid om te ontsnappen
- Plaats de rat in het midden van een cirkelvormig apparaat (0,5 m diameter en 0,3 m hoogte) met een uitgang (12,5 cm lang en 9 cm breed).
- Noteer de tijd die de rat nodig heeft om de cirkel te verlaten.
OPMERKING: Als de rat de cirkel niet binnen 180 s verlaat, noteer dan de tijd als 180 s.
- Straalbalans vermogen test
- Plaats de rat dienovereenkomstig gedurende 1 minuut op een straal van 3 cm, 2 cm en 1.5 cm breed.
- Als de rat een evenwicht bewaart met een stabiele houding op de balk, scoor deze dan als 0.
- Als de rat de zijkant van de balk vastpakt, geef dan een score van 1. Als de rat de balk omhelst en een ledemaat eraf valt, scoor het dan als 2.
- Als de rat de balk omhelst en de twee ledematen eraf vallen of erop draaien (>60 s), scoor hem dan als 3.
- Als de rat probeert te balanceren op de balk maar eraf valt (> 40 s), geef hem dan een score van 4.
- Als de rat probeert te balanceren op de balk maar eraf valt (>20 s), scoor deze dan als 5.
- Als de rat niet probeert te balanceren of aan de balk te hangen en er binnen 20 s af valt, scoor hem dan als 6.
OPMERKING: Voor de straalbalanstest is geen voorproef vereist.
6. Validatieprocedure: Neurogedragsbeoordeling
OPMERKING: Voorafgaand aan de gedragsexperimenten werden de ratten gedurende 3 opeenvolgende dagen dagelijks 2 minuten behandeld om stress en verstoring van nieuwigheden tot een minimum te beperken. Alle gedragsexperimenten werden uitgevoerd door de dieren 60 minuten voor aanvang van het experiment in de testomgeving te plaatsen.
- Motorisch coördinatievermogen (straaltaak)
- Experimentele opstelling
- Plaats de ratten aan het ene uiteinde van de evenwichtsbalk (1,5 m lang en 75 cm boven de vloer). Plaats een ontsnappingsdoos (een schuine slaapplaats) aan het andere uiteinde.
- Plaats een schuimrubberen vulling onder de balk om het potentiële risico op letsel bij ratten bij vallen tijdens de test te verminderen.
- Zet de videocamera aan.
- Plan testdagen op specifieke tijdstippen na het letsel of na de schijnbehandeling (bijv. dag 1, dag 3 en dag 7).
- Trainingsfase (2 dagen)
- Train de ratten om de 4 cm brede balk 3 keer achter elkaar over te steken, gevolgd door twee proeven op de 2 cm brede balk.
- Leid de ratten tijdens de training voorzichtig over de straal totdat ze deze gemakkelijk en ongestoord kunnen oversteken.
- Evenwichtsbalk experiment
- Plaats de ratten op de 2 cm brede balk voor 5 opeenvolgende proeven.
- Noteer het begin en het einde van elke proef wanneer de neus van de rat respectievelijk de start- en finishlijn passeert.
- Breng de ratten aan het einde van het experiment terug naar hun kooien.
- Testen bij basislijn
- Voer het evenwichtsbalkexperiment uit vóór het letsel of de behandeling.
- Bereken de gemiddelde waarden van deze 5 opeenvolgende onderzoeken om de basislijn voor elke rat vast te stellen.
- Data-analyse
- Analyseer de tijd om de balk over te steken en het totale aantal slips van de achtervoet met behulp van video-analyse door onderzoekers die blind zijn voor de experimentele omstandigheden.
- Experimentele opstelling
- Angst (Open veldtest)
- Experimentele opstelling
- Bereid de arena op het open veld voor en zorg ervoor dat deze schoon is en vrij van eerdere geursignalen. Verdeel de arena in drie zones: een centrale binnenzone (33 cm x 33 cm), een middelste zone (66 cm x 66 cm) en een buitenzone.
- Testfase
- Plaats een rat in het midden van de open veldarena en start de timer. Laat de rat 5 minuten vrij de arena verkennen. Breng de rat na 5 minuten voorzichtig en voorzichtig terug naar zijn thuiskooi.
- Dataverzameling
- Meet de totale afstand die de rat heeft afgelegd tijdens de verkenningsperiode van 5 minuten. Bepaal de tijd die de rat doorbrengt in de centrale binnenste, middelste en buitenste zones.
- Data-analyse
- Gebruik de totale afgelegde afstand als maatstaf voor het algehele verkennende gedrag en het bewegingsvermogen. Bereken de tijd die in de centrale binnenzone wordt doorgebracht als een indicator van angstachtige reacties.
- Experimentele opstelling
- Leer- en geheugenvaardigheden (Morris waterdoolhoftest)
- Zorg ervoor dat het waterdoolhofapparaat in goede staat verkeert. Verf het water zwart en plaats keuen in de vier windrichtingen. Plaats het platform 2.5 cm onder het wateroppervlak.
- Zet een monitoringsysteem op om het gedrag van de ratten vast te leggen en te observeren.
- Trail dag
- Plaats de rat snel in het waterdoolhof. Als de rat het platform niet binnen 2 minuten bereikt, leid hem dan voorzichtig met de houten stok.
- Laat de rat vertrouwd raken met de doolhofomgeving terwijl hij 20 seconden op het platform staat en verwijder hem dan. Zodra de rat op het platform staat, laat je hem 20 seconden staan en verwijder je hem.
- Dagelijkse herhaling
- Herhaal de procedure van de trainingsdag en plaats de rat vanuit verschillende kwadranten in het water. Herhaal stap 6.3.3. Ga door met de training gedurende 5 opeenvolgende dagen.
- Sondetestdag: Verwijder op de6e dag het platform en plaats de rat gedurende 2 minuten in hetzelfde kwadrant.
- Observatie en registratie: Gebruik het monitoringsysteem om het gedrag van de rat op proef- en sondetestdagen te volgen.
- Reiniging: Nadat je de rat uit het waterdoolhof hebt gehaald, gebruik je een handdoek om hem goed af te drogen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het apparaat dat in dit werk werd gebruikt, was een aangepaste versie van het Kane-model en het pediatrische model11,12 van Richelle Mychasiuk. In deze studie werden SD-ratten toegewezen aan schijn- en mTBI-groepen. Om de reproduceerbaarheid van dit model aan te tonen, hebben we drie onafhankelijke replicaten van dit model uitgevoerd, samen met de acute neurologische gedragsbeoordeling, waarbij elk experiment 8-12 ratten betrof. I...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit model simuleert met succes een mTBI met gesloten hoofd zonder de noodzaak van een incisie in de hoofdhuid of het openen van de schedel, wat een nauwkeurigere weergave geeft van het impactscenario dat in menselijke gevallen wordt waargenomen. Het vermijden van incisie in de hoofdhuid helpt ontstekingsreacties te voorkomen die mogelijk niet overeenkomen met de werkelijke situatie. Vergeleken met het pediatrische model12 van Richelle Mychasiuk, is het model dat in deze studie wordt gebruikt speci...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financieel belang om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen alle fellows van de afdeling Proefdieren van de Central South University bedanken. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81971791); Shanghai Key Lab voor Forensische Geneeskunde, Key Lab voor Forensische Wetenschap, Ministerie van Justitie, China (Academie voor Forensische Wetenschappen) (nr. KF202104).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Roestvrijstalen schijf met een diameter van 10 mm en een dikte van 3 mm |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, hoogte 50 cm, platformdiameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Breedte 100 cm, hoogte 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Gewicht van 550 g en diameter van 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge om onder het hoofd van de rat te plaatsen |
Referenties
- Silverberg, N. D., Duhaime, A. C., Iaccarino, M. A. Mild traumatic brain injury in 2019-2020. JAMA. 323 (2), 177-178 (2020).
- Kim, K., Priefer, R. Evaluation of current post-concussion protocols. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110406(2020).
- Peeters, W., et al. Epidemiology of traumatic brain injury in Europe. Acta Neurochirurgica (Wien). 157 (10), 1683-1696 (2015).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Smith, D. H., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. Journal of Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Research. 211 (1), 67-77 (1981).
- Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76 (Pt B), 396-414 (2017).
- Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neuroscience Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
- Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: A novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).
- Jacotte-Simancas, A., Molina, P., Gilpin, N. W. Repeated mild traumatic brain injury and JZL184 produce sex-specific increases in anxiety-like behavior and alcohol consumption in Wistar rats. Journal of Neurotrauma. , (2023).
- Levin, H. S., et al. Association of sex and age with mild traumatic brain injury-related symptoms: A TRACK-TBI study. JAMA Network Open. 4 (4), e213046(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
