Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65851

⸱

1 december 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Samenvatting

Skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van muizenspieren zijn een bruikbaar model voor fysiologische experimenten. De meeste artikelen gaan echter over de korte vezels van de flexor digitorum brevis (FDB), die de reikwijdte van de resultaten met betrekking tot vezeltypes beperkt, de hoeveelheid beschikbaar biologisch materiaal beperkt en een duidelijk verband belemmert tussen cellulaire fysiologische verschijnselen en eerdere biochemische en dynamische kennis die in andere spieren is verkregen.

Dit artikel beschrijft hoe intacte vezels kunnen worden verkregen uit zes spieren met verschillende vezeltypeprofielen en lengtes. Met behulp van C57BL/6 volwassen muizen tonen we het protocol voor spierdissectie en vezelisolatie en demonstreren we de geschiktheid van de vezels voor Ca2+ transiënte studies en hun morfometrische karakterisering. De vezeltypesamenstelling van de spieren wordt ook gepresenteerd. Wanneer ze gedissocieerd zijn, worden alle spieren intact, levende vezels die langer dan 24 uur stevig samentrekken. FDB gaf korte (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) en peroneus longus (PL) gaven intermediair (1-3 mm), terwijl extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL) en soleus-spieren lange (3-6 mm) vezels vrijgaven.

Bij opname met de snelle kleurstof Mag-Fluo-4 vertoonden Ca2+ transiënten van PDQA-, PL- en EHL-vezels de snelle, smalle kinetiek die doet denken aan de morfologie type II (MT-II), waarvan bekend is dat deze overeenkomt met type IIX- en IIB-vezels. Dit komt overeen met het feit dat deze spieren meer dan 90% van type II-vezels bevatten in vergelijking met FDB (~80%) en soleus (~65%). Als we verder gaan dan FDB, demonstreren we voor het eerst de dissociatie van verschillende spieren, waardoor vezels ontstaan die een bereik van lengtes tussen 1 en 6 mm overspannen. Deze vezels zijn levensvatbaar en geven snelle Ca2+ transiënten, wat aangeeft dat de MT-II kan worden gegeneraliseerd naar IIX en IIB snelle vezels, ongeacht hun spierbron. Deze resultaten vergroten de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies.

Inleiding

De volwassen skeletspier van zoogdieren is een multifunctioneel weefsel. Het reguleert sterk het metabolisme, is de belangrijkste bron van warmteproductie en zijn dynamische eigenschappen geven het een sleutelrol bij de ademhaling, beweging van lichaamssegmenten of verplaatsing van het ene punt naar het andere 1,2,3. Skeletspieren zijn ook relevant voor de pathofysiologie van veel ziekten, waaronder erfelijke en chronische aandoeningen, zoals myopathieën, dystrofieën of sarcopenie, evenals veel niet-spierchronische aandoeningen, zoals cardiometabole ziekten 3,4,5,6,7,8.

De ex vivo studie van de structurele en functionele eigenschappen van rijpe skeletspieren in de context van gezondheid en ziekte is voornamelijk mogelijk geweest door middel van twee experimentele modellen: hele spieren en geïsoleerde vezels. In de 20eeeuw maakten onderzoekers gebruik van de eigenschappen van de hele, intacte extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior en gastrocnemius-spieren van verschillende kleine soorten als cruciale modellen om meer te weten te komen over motoreenheden, vezeltypen en dynamische eigenschappen zoals kracht en kinetiek van samentrekking en ontspanning 9,10,11,12,13,14,15,16. De komst van meer verfijnde celbiologische studies verplaatste het gebied echter in de richting van de studie van enkele spiervezels. Baanbrekend werk maakte vervolgens de isolatie mogelijk van intacte flexor digitorum brevis (FDB) vezels van ratten door enzymatische dissociatie voor latere karakterisering 17,18,19. Hoewel FDB-vezels ook kunnen worden verkregen door handmatige dissectie20, hebben het gemak en de hoge doorvoer van enzymatische dissociatie van muizenspieren, naast hun geschiktheid voor een verscheidenheid aan experimentele benaderingen, ervoor gezorgd dat het laatste model de afgelopen twee decennia op grote schaal is gebruikt.

De korte FDB-vezels zijn geschikt voor elektrofysiologische en andere biofysische studies, biochemische, metabole en farmacologische analyses, elektronen- en fluorescentiemicroscopie-experimenten, transfectie voor celbiologische benaderingen, of als bron van stamcellen in myogenesestudies 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Het gebruik van alleen FDB-vezels in spierexperimenten verkleint echter de reikwijdte van onderzoek naar vezelsoorten en beperkt de hoeveelheid biologisch materiaal die beschikbaar is voor sommige methodologische technieken of voor het verkrijgen van meer informatie van één dier. Deze beperkingen belemmeren een duidelijke correlatie van cellulaire fysiologische verschijnselen met eerdere biochemische en dynamische studies die zijn uitgevoerd in verschillende hele, intacte spieren (bijv. EDL, soleus, peronei).

Door deze beperkingen te overwinnen, slaagden sommige groepen erin om de langere EDL- en soleusspieren 24,33,34,35,36,37,38,39,40 te dissociëren, waardoor de deur werd geopend om de methode verder uit te breiden naar andere relevante spieren. Het gebruik van EDL- en soleusvezels is echter nog steeds schaars, waarschijnlijk vanwege het gebrek aan methodologische details om ze als intacte vezels te krijgen. Hier beschrijven we in detail hoe je vezels van verschillende lengtes en typen kunt isoleren uit zes spieren: drie daarvan zijn al beschreven (FDB, EDL en soleus) en drie daarvan zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL] en peroneus digiti quarti [PDQA]). De resultaten van het huidige werk bevestigen dat het model van enzymatisch gedissocieerde vezels geschikt is voor een breed scala aan studies en toekomstige correlaties met eerder gepubliceerde gegevens, waardoor de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies toeneemt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor Ethiek in Dierproeven van de Universiteit van Antioquia (UdeA) (notulen 104 van 21 juni 2016 en 005 van 15 april 2021), volgens wet 84 van 1989 en resolutie 8430 van 1993 uitgevaardigd door de Colombiaanse regering en werden uitgevoerd en gerapporteerd in overeenstemming met het dieronderzoek: Richtlijnen voor het rapporteren van in-vivo-experimenten (ARRIVE)41. Alle hier gepresenteerde resultaten zijn afkomstig van gezonde, 7-13 weken oude, 20-26 g, C57BL/6 mannelijke muizen. Figuur 1 toont de algemene opzet van deze studie en de volgorde van de procedures. Alle details van reagentia, materialen en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Dieren

  1. Huisvest maximaal zes muizen per acryl, transparante, rechthoekige kooi, met strooisel van hout, onder omstandigheden van gecontroleerde temperatuur (21 ± 2 °C) en licht:donker (12:12 uur) cycli.
  2. Geef de dieren gratis toegang tot voedsel en kraanwater in specifieke pathogeenvrije dierfaciliteiten zonder verrijking van de omgeving.

2. Ontleding

  1. Oplossingen, materialen en reagentia
    1. Bereid en filtreer (0,22 μm) de werkoplossingen met de volgende samenstelling (alle concentraties in mM):
      1. Tyrode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissociatie: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Bereid twee dissectiekamers voor; stereoscoop; het bedienen van een schaar; fijne schaar; fijne pincet; en schone, transparante, niet-conische, 1-1,5 cm brede, glazen injectieflacons met een totaal volume van 3-4 ml met doppen. Zorg voor een systeem voor het elektrisch stimuleren van de spieren in de dissectiekamers.
    3. Bereid vuurgepolijste pasteurglazen pipetten voor met verschillende breedtepunten: 5, 4, 3, 2 en 1 mm.
    4. Stel het waterbad in op 37 °C. Weeg aliquots van 3 mg collagenase type 2 af.
  2. Procedure
    1. Offer de muis op met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Cervicale dislocatie wordt aanbevolen omdat het snel en minder stressvol is en blootstelling aan medicijnen vermijdt, die het spierweefsel kunnen aantasten (zoals CO2 of sommige anesthetica). Begin onmiddellijk met dissectie om betere resultaten te verkrijgen.
    2. Plaats de muis op een schuimrubberen ondergrond en plak of speld de voorpoten vast. Knip beide achterpoten over de knieën af met de operatieschaar, breng ze elk over naar een aparte dissectiekamer en voeg koude (10-20 °C) tyrode toe om het weefsel te bedekken.
      OPMERKING: Elke achterpoot geeft zes verschillende spieren in de volgende volgorde: FDB, soleus, EDL, EHL, PL en PDQA. Gedetailleerde anatomische verwijzingen om de zes intacte spieren van pees tot pees te ontleden worden gegeven in figuur 2 en elders42.
    3. Speld de eerste achterpoot op de dissectiekamer in een positie waarin het achterste vlak van de benen zichtbaar is. Verwijder de huid onder vergroting; stel vervolgens de FDB bloot en verwijder deze (Figuur 2). Bewaar het in een gelabelde glazen injectieflacon met 1 ml Tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Passende vergroting en voorafgaande training zijn vereist om ongewenste sneden in het spierweefsel te voorkomen.
    4. Leg de soleus bloot, verwijder hem en bewaar hem in een aparte injectieflacon met 1 ml tyrode. Gebruik een fijne schaar om eerst de gastrocnemius te scheiden en vervolgens de soleus te verwijderen, zoals aangegeven in figuur 2.
    5. Leg het voorste vlak van het been bloot, verwijder de huid en identificeer de distale pezen van de tibialis anterior en de EDL-spieren in de enkel. Verwijder het scheenbeen en gooi het weg; snijd vervolgens de distale pezen van de EDL door (Figuur 2). Ga door met dissectie totdat de EDL is verwijderd en plaats deze in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    6. Verwijder de EHL-spier, die net posterieur en mediaal van de EDL ligt. Begin met de dissectie door de pees te identificeren en te volgen tot het 1ecijfer, zoals aangegeven in het overeenkomstige paneel van figuur 2. Bewaar de spier in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    7. Identificeer en volg de meest uitwendige pees van de peronei om deze door te snijden en de PL-spier te verwijderen (Figuur 2). Plaats de spier in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    8. Identificeer en volg de pees tot het 4ecijfer; knip het door en verwijder de PDQA-spier (Figuur 2). Doe het in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    9. Herhaal de procedure met de tweede achterpoot.
    10. Verzamel beide spieren van hetzelfde type in een gelabelde glazen injectieflacon of een kleine petrischaal met tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Als het de bedoeling is dat er tijdens een werksessie meer dan twee paar spieren worden ontleed, rekruteer dan twee onderzoekers voor de dissectieprocedure.

3. Het isolatieprotocol van de spiervezel

  1. Vernieuw de Tyrode-oplossing in de dissectiekamers om vuil en muizenvacht te verwijderen. Giet de FDB-spieren in een dissectiekamer, controleer hun integriteit en breng ze over in een nieuwe glazen injectieflacon met 1 ml dissociatieoplossing. Herhaal deze procedure met de EHL-, PL- en PDQA-spieren.
    OPMERKING: Als een spier er hypercontractief, doorgesneden of niet reageert op de elektrische stimulatie, ga dan niet verder met de volgende protocolstap. Optimaliseer in plaats daarvan het dissectieprotocol door de kwaliteit van de oplossingen te verifiëren (pH, contaminatie, osmolariteit) en meer dissectievaardigheden te verwerven (Figuur 1C en aanvullende video S1).
  2. Voer longitudinale of diagonale sneden uit naar de soleus- en EDL-spieren, volgens de oriëntatie van de vezels (Figuur 2). Volg voor de soleus de centrale pees en snijd ~80% van de lengte af. Voor EDL volg je gewoon een of twee pezen en knip je ongeveer dezelfde lengte af als voor soleus. Doe elk paar spieren in glazen injectieflacons met 1 ml dissociatieoplossing.
    OPMERKING: Deze procedure maakt de EDL en soleus kleiner en zorgt ervoor dat het collagenase beter in het weefsel kan komen. Voldoende vergroting (40-50x), evenals een fijne schaar en pincet, zijn verplicht. Controleer altijd de integriteit van het monster door middel van visuele inspectie en elektrische stimulatie voordat u doorgaat naar de volgende stap van het dissociatieprotocol.
  3. Voeg 3 mg collagenase type 2 (met een activiteit van 250-300 E/mg) toe aan elke injectieflacon met 1 ml dissociatieoplossing en een paar spieren. Standaardiseer de exacte hoeveelheid collagenase door rekening te houden met de activiteit van de gebruikte enzymbatch.
  4. Incubeer de spierparen in het waterbad gedurende 65-90 min bij 36,8-37 °C, met zacht schudden.
    NOTITIE: Wees rigoureus met de temperatuurregeling. Standaardiseer de procedure zodat de spieren niet langer dan 100 minuten in collagenase blijven om schade te voorkomen.
  5. Controleer de injectieflacons elke 5 minuten na de 65eminuut van de incubatie onder stereoscoopvergroting. Wanneer de spieren er enigszins gerimpeld, rafelig en los uitzien, schudt u de injectieflacon voorzichtig en controleert u of sommige vezels gemakkelijk beginnen los te laten. Als dit het geval is, was de spieren dan met Tyrode op kamertemperatuur om het collagenase te inactiveren en te verwijderen.
    OPMERKING: Het wassen moet zorgvuldig gebeuren, zonder de spieren met de pipetten aan te raken. Begin met het toevoegen van 0,8 ml tyrode en verwijder vervolgens 0,8 ml van de oplossing. Herhaal deze procedure 4-5x en controleer of de oplossing volledig transparant wordt.
  6. Scheid meer vezels van het grootste deel van de spieren met zeer zachte trituratie in Tyrode met behulp van de set vuurgepolijste pasteurpipetten. Begin met het roeren van de oplossing rond de spier met de breedste pipet (5 mm punt) en trek de spieren vervolgens voorzichtig 3-4x in en uit de pipet. Wanneer de spier vezels begint af te geven en dunner wordt, herhaalt u de procedure met de volgende pipet (punt van 4 mm).
    OPMERKING: Vezels die via deze procedure worden gerenderd, blijven prikkelbaar en trekken langer dan 24 uur stevig samen, zoals geïllustreerd met behulp van PL-, EDL-, EHL- en soleusvezels in Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 en Supplemental Video S5.

4. Experimentele procedures

OPMERKING: Geïsoleerde vezels werden gebruikt voor schattingen van de concentratie van sarcoplasmatische Ca2+ , morfometrische metingen en expressiestudies naar myosine zware keten (MHC).

  1. Meting van de sarcoplasmatische Ca2+ Concentratie tijdens een spiertrekkingen
    1. Monteer een schone, glazen dia op de experimentele badkamer. Smeer het glaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat je ~400 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 10-15 minuten bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Monteer de experimentele kamer op de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust voor epifluorescentie (Figuur 3A).
    3. Roep enkele spiertrekkingen op om de levensvatbaarheid van de vezels te verifiëren door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst. Zelfs bij hechting aan laminine is de samentrekking van de vezels nog steeds vooral aan de uitersten zichtbaar.
    4. Laad de vezels met 3,5-4,5 μM van de snelle Ca2+ kleurstof Mag-Fluo-4, AM gedurende 4-5 minuten in Tyrode-oplossing. Was na deze tijd voorzichtig met Tyrode om de extracellulaire kleurstof te verwijderen. Laat de intracellulaire kleurstof ~15-20 minuten onder donkere omstandigheden ontesteren. Houd de temperatuur altijd onder de 22 °C om compartimentering van de kleurstof te voorkomen.
      OPMERKING: Bereid een voorraad Mag-Fluo-4, AM alleen in dimethylsulfoxide (DMSO), zodat de uiteindelijke concentratie DMSO in de ladende tyrode-oplossing minder dan 0,5% bedraagt.
    5. Verlicht de vezel met een witte lichtgevende diode (LED) en een filterset met de volgende golflengten voor excitatie/dichroïsch/emissie: 450-490/510/515 nm (Figuur 3A).
      OPMERKING: Alternatieve bronnen van excitatie zijn kwik- en xenonfluorescentielampen. Gebruik de laagst mogelijke intensiteit en grootte van de excitatievlek om fotobleken van de kleurstof en schade aan de cel te voorkomen.
    6. Roep de Ca2+- respons van de vezel op (sarcoplasmatische Ca2+ -transiënten) door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst bij 20-22 °C.
    7. Verzamel en bewaar de lichtsignalen met een 40x langeafstandsobjectief met olie-onderdompeling dat geschikt is voor fluorescentie en een fotomultiplicatorbuis (PMT) die is aangesloten op een digitizer (Figuur 3A en aanvullende video S6). Zorg voor een schaal in de acquisitiesoftware van 0-200 willekeurige eenheden (AE) en stel de rustfluorescentie (F-rest) van het experiment in op 10 AU op die schaal door de grootte van de excitatievlek en de versterking van de PMT te moduleren. Zodra de procedure is gestandaardiseerd, houdt u de versterking ongewijzigd van het ene experiment naar het andere en stelt u de schaal alleen in door kleine aanpassingen in de spotgrootte.
      OPMERKING: Als er bewegingsartefacten ontstaan, gebruik dan 20-30 μM N-benzyl-p-tolueensulfonamide (BTS) in de Tyrode-oplossing.
    8. Analyseer en kalibreer de signalen als volgt:
      1. Laagdoorlaatfilter het hele spoor bij 1 kHz.
      2. Bereken de F-rust in 1 s van het spoor, stel de F-rest in op 0 en meet de piek van de sarcoplasmatischeCa 2+ transiënten 'amplitude (F-piek). Geef de amplitude weer zoals in vergelijking (1):
        figure-protocol-1(1)
      3. Bereken de piekconcentratie Ca2+ ([Ca2+], μM) met behulp van vergelijking (2)26 en de volgende parameters: in situ dissociatieconstante (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maximale fluorescentie (Fmax) van 150,9 AE, minimale fluorescentie (Fmin) van 0,14 AE, Mag-Fluo-4 concentratie [D]T van 229,1 μM26. DeF-piek werd al bereikt in stap 4.1.8.2.
        figure-protocol-2(2)
      4. Meet de stijgtijd van 10% tot 90% van de amplitude (RT, ms), de duur op de helft van het maximum (HW, ms) en de vervaltijd van 90% tot 10% van de amplitude (DT, ms). Schat vervolgens de vervalkinetiek volgens een fit met de biexponentiële functie (vergelijking 3):
        figure-protocol-3(3)
      5. Sla de waarden op van de tijdconstanten van verval τ1 en τ2 (ms) en amplitudes A1 en A226.
  2. Morfometrische metingen
    1. Monteer een schone, glazen dia op de experimentele badkamer. Smeer het glaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat je ~400 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 10-15 minuten bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Roep enkele spiertrekkingen op om de levensvatbaarheid van de vezels te verifiëren door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst. Zelfs bij hechting aan laminine is de samentrekking van de vezels nog steeds vooral aan de uitersten zichtbaar.
    3. Verkrijg beelden van de levende vezels met behulp van 10x en 20x objectieven en een camera van ten minste 5 megapixels gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Sla de afbeeldingen op in . TIFF-formaat voor offline analyses.
      OPMERKING: Een set van ~2-6 afbeeldingen kan nodig zijn om een lange vezel volledig vast te leggen.
    4. Stel een microscoopmicrometerkalibratieliniaal voor onder dezelfde vergroting. Sla de afbeeldingen op in . TIFF-formaat voor offline analyses.
    5. Meet de lengtes en diameters van de vezels met behulp van de kalibratietool van gratis software voor beeldanalyses als volgt:
      1. Leg een verband tussen pixels en de bekende afstand (μm) in de afbeeldingen met behulp van de kalibratieliniaal van de microscoopmicrometer met behulp van het gereedschap Analyseren/Schaal instellen, zoals weergegeven in aanvullende afbeelding S1.
      2. Meet eenmaal de lengte van de ene punt naar de andere van de vezel en de diameters op 2-6 verschillende plaatsen langs de vezel (1-2 metingen per afbeelding, afhankelijk van de lengte), zoals in aanvullende figuur S1.
      3. Rapporteer de waarde van de lengte (μm of mm) en het gemiddelde van alle diameters (μm) gemeten per vezel.
  3. Myosine zware keten expressie studies
    OPMERKING: Voor details over de bepaling van MHC door immunofluorescentie43 en natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)33,44,45,46 in hele spieren, zie Aanvullend dossier 1. Het protocol voor vezeltypering door immunofluorescentiebepaling van MHC in de suspensie van FDB-geïsoleerde vezels is als volgt:
    1. Smeer elk van de vijf schone, glazen objectglaasjes in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat u ~300 μL van de vezelsuspensie op elk glaasje giet. Laat de vezels 4 uur bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Zet de bereidingen vast met in de vriezer gekoelde aceton gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
    3. 3x voorzichtig wassen met PBS.
    4. Permeabiliseer de celmembranen met PBS aangevuld met 0,7% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. 3x voorzichtig wassen met PBS aangevuld met 0,2% runderserumalbumine (BSA) en 0,04% Triton X-100, en vervolgens 30 minuten op kamertemperatuur opsmeren met PBS met 2% BSA, 2% geitenserum en 0,4% Triton X-100.
    6. 3x voorzichtig wassen met PBS aangevuld met 0,2% BSA en 0,04% Triton X-100 en als volgt incuberen met de primaire antilichamen:
      1. Verdun elk anti-MHC primair antilichaam in een aparte injectieflacon in PBS met 1% BSA en 0,04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (gebruik volledige geconditioneerde media van het hybridoom) en anti-IIB (1:500).
      2. Incubeer elk objectglaasje met één antilichaam en het resterende objectglaasje met PBS als controle gedurende 12-16 uur bij 4 °C.
        OPMERKING: In dit protocol bleven vezels van het type IIX niet gelabeld in alle monsters.
    7. Was 3x voorzichtig met PBS en incubeer alle objectglaasjes met het secundaire antilichaam (1:800) gekoppeld aan een fluorescerend groen molecuul gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
    8. Kleuring van kernen met 1 μg/ml Hoechst gedurende 15 min.
    9. Was 3x voorzichtig met PBS, voeg voorzichtig 20-40 μL montagemedium toe en plaats een dekglaasje.
      OPMERKING: Zachte oplossingsuitwisselingen en wassen zorgen ervoor dat tientallen vezels aan het glaasje blijven vastzitten, waardoor het experiment statistisch verantwoord is.
    10. Visualiseer elk glaasje met behulp van een 10x objectief dat geschikt is voor fluorescentie en een filterset met de volgende golflengten voor excitatie/dichroïsch/emissie: 450-490/510/515 nm en tel alle positieve en negatieve vezels. U kunt ook fluorescentiebeelden maken met dezelfde technische omstandigheden en een camera van ten minste 5 megapixels gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en deze opslaan in . TIFF-formaat voor offline analyses.
    11. Noteer de positieve en negatieve vezels van elk objectglaasje in een database en bereken de percentages positieve I-, IIA-, IIB- en totale II-vezels op basis van het totale aantal vezels dat aanwezig is in het overeenkomstige objectglaasje. Bereken het percentage IIX-vezels door de som van IIA+IIB af te trekken van het percentage van het totale aantal II-vezels. Schat het percentage hybride I/IIA-vezels door de som van I+II af te trekken van een waarde van 100%. Trek ten slotte het percentage hybride cellen af van het totaal van I en II om de zuivere type I- en II-vezels te hebben.
      OPMERKING: In MHC-samenstellingsstudies worden vezeltypes aangeduid met een hoofdletter, terwijl isovormen worden aangeduid met een kleine letter46.
  4. Hematoxyline- en eosinekleuring
    1. Smeer een schoon, glazen objectglaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat u ~300 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 4 uur bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Fixeer de bereiding met Carnoy's oplossing (60% absolute ethanol, 30% chloroform, 10% azijnzuur) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer met hematoxyline gedurende 90 s.
    4. 3x voorzichtig wassen met kraanwater.
    5. Incubeer met 1% eosine Y bereid in 70% ethanol gedurende 30 s.
    6. 3x voorzichtig wassen met kraanwater.
    7. Dompel 3x onder in absolute ethanol.
    8. Incubeer gedurende 60 s in xylol.
    9. Voeg 20-40 μL montagemedium toe en visualiseer met een conventionele microscoop. Maak foto's met de gewenste vergroting met een kleurencamera van minimaal 5 megapixels.

5. Statistische analyses en grafieken

OPMERKING: De experimentele eenheid is een spiervezel.

  1. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± standaarddeviatie en bereken betrouwbaarheidsintervallen van 95% (BI95%) voor sommige analyses.
  2. Om lengte, diameter en de kinetiek van Ca2+- transiënten tussen groepen te vergelijken, voert u variantieanalyse (ANOVA) en post-hoctests uit met de correctie van Bonferroni.
  3. Beoordeel normaliteit en variantiegelijkheid met behulp van respectievelijk de Shapiro-Wilk- en Levene-tests.
  4. Beschouw de verschillen als significant wanneer p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Sarcoplasmatische Ca2+ concentratie tijdens een spiertrekkingen
Om de haalbaarheid van fysiologische experimenten in de set van gedissocieerde vezels aan te tonen en om onze eerdere bevindingen over excitatie-contractiekoppeling (ECC) en vezeltypes uit te breiden, werden Ca2+ transiënten verworven in vezels van alle spieren. Ten eerste vertoonden FDB (n = 5) en EDL (n = 7) eenCa 2+-kinetiek die bekend staat als morfologietype II (MT-II). Dit zijn snelle, stekelige sign...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Als aanvulling op de modellen die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de biologie van volwassen skeletspieren, demonstreren we hier de succesvolle enzymatische dissociatie van een reeks muisspieren met korte, tussenliggende en lange vezels. Deze vezels maken het mogelijk om de generaliseerbaarheid van de MT-II-kinetiek van de Ca2+ -transiënten in skeletspieren aan te tonen. Verder werden de vezeltypen in de intacte, hele spieren geclassificeerd. Aangezien de FDB de meest gebruikte spier is voor fysiologis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs spreken hun dank uit aan professor Robinson Ramírez van UdeA voor hulp met dieren en enkele foto's en aan Carolina Palacios voor technische ondersteuning. Johan Pineda van Kaika heeft ons geholpen met het instellen van de kleuren- en fluorescentiecamera's. Shyuan Ngo, van de Universiteit van Queensland, was zo vriendelijk het manuscript te proeflezen. Deze studie werd gefinancierd door de CODI-UdeA (2020-34909 vanaf 22 februari 2021 en 2021-40170 vanaf 31 maart 2022, SIU), en Planning Office-UdeA (E01708-K en ES03180101), Medellín, Colombia, aan JCC. Financiers namen niet deel aan het verzamelen en analyseren van gegevens, het schrijven of indienen van manuscripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagenten
Absolute ethanolSigma Aldrich32221
AcetonMerck179124
AcrylamidGibco BRL15512-015
AmmoniumpersulfaatPanreac141138.1610
Anti myosine I antilichaamSigma AldrichM4276Primair antilichaam
Anti myosine II antilichaamSigma AldrichM8421Primair antilichaam
Anti myosine IIA antilichaamAmerican Type Culture CollectionSC-71Primair antilichaam. Afkomstig van HB-277 hybridoma
Anti myosine IIB antilichaamDevelopmental Studies Hybridoma BankBF-F3-c Primair antilichaam
Bis-acrylamidAMRESCO0172
RundserumalbumineThermo ScientificB14
Bradford reagensMerck1.10306.0500
BroomfenolblauwCarlo Erba428658
CalciumcarbonaatMerck102066
Calciumdichloride (CaCl2)Merck2389
ChloroformSigma Aldrich319988
Collagenase type 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Briljantblauw R 250 Merck112553
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dithiothreitol (DTT)AMRESCO0281
Edetanzuur (EDTAAMRESCO0322
Eosine YSigma AldrichE4009
GlycerolPanreac 1423291211
GlycinePanreac151340.1067
GeitenserumSigma AldrichG9023
HematoxylineThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazoolAMRESCOM136
IsopentaanSigma AldrichM32631
LaminineSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Alleen bereid in DMSO. Pluronic zuur is niet vereist en mag niet worden gebruikt om vezeldeterioratie te voorkomen.
MercaptoethanolApplichemA11080100
MethanolProtokimicaMP10043
MuizenMeerdereMeerdereVoor dit manuscript gebruikten we alleen C57BL/6 muizen. Echter, sommige voorlopige resultaten hebben aangetoond dat het protocol goed werkt voor Swiss Webster muizen van dezelfde leeftijd en gewicht.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetramethylethaan-1,2-diamine (TEMED)PromegaV3161
N-benzyl-p-tolueen sulfonamide (BTS)Tocris1870
Optimale snijverbinding (OCT)Thermo Scientific6769006
Secundair antilichaamThermo ScientificA-11001Geit anti-muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed secundair antilichaam, Alexa Fluor 488
NatriumdodecylsulfaatPanreac 1323631209
TRIS 0,5 M, pH 6,8 AMRESCOJ832
Tris(hydroxymethyl)aminomethaanAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materiaal
DissectiekamerOp maat gemaakt
Gelaaide glazenErie Scientific5951PLUS
Experimentele badkamerWarner InstrumentsRC-27NE2Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled op een verwarmd platform PH-6
Fijne pincettenWorld Precision Instruments500338, 500230
Fijne schaarWorld Precision InstrumentsVannas Scissors 501778
Glazen Pasteur pipettenMeerdereMet vuur gepolijste punten
Glazen flesjes met dopMeerdere2-3 mL volume
OperatieschaarWorld Precision Instruments501223-G
Apparatuur
CentrifugeThermo ScientificSL 8R
Confocale microscoopOlympusFV1000
CryostatLeicaCM1850
Digitale cameraZeissErc 5s en Axio 305Axio 305, gekoppeld aan de Stemi 508 stereoscoop, werd gebruikt om foto's te maken tijdens dissectie; terwijl Erc 5s of Axio 208, gekoppeld aan de Axio Observer A1 microscoop, werden gebruikt om afbeeldingen te maken van de geïsoleerde vezels en de immunofluorescentie-assays
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Elektroforese kamerBio RadMini-Protean IV
Omgekeerde microscoop gekoppeld aan fluorescentieZeissAxio Observer A1Gekoppeld aan een geschikte lichtbron, filters en objectieven voor fluorescentie
FotomultiplierHoribaR928 tube, Hamamatsu, in een D104 fotometer, HoribaGekoppeld aan de laterale poort van de fluorescentiemicroscoop
StereoscoopZeissStemi 508
Stimulator Grass Instruments 

Referenties

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260(2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14(2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939(2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898(2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976(2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118(2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199(2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807(2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074(2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961(2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669(2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796(2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654(2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126(2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075(2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van spiervezelscalciumtransiëntenvezeltypesamenstellingmorfometrische karakteriseringexcitatie-contractiekoppelingcollagenaseverteringepifluorescentiemicroscopie
Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.