Twee-fotonenmicroscopie voor de studie van pezen

Samenvatting

Dit artikel schetst het proces van het voorbereiden, instellen en afbeelden van pezen met behulp van multifotonmicroscopie. Daarnaast behandelt het de toepassing van SHG voor het analyseren van de uitlijning van collageenfibrillen en het maken van een 3D-weergave van pezen. Deze methodologie blijkt zeer waardevol bij het karakteriseren van peescellen en hun ECM tijdens letsel en ontwikkeling.

Samenvatting

Twee-fotonmicroscopie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van diepe weefselcellen en het karakteriseren van de uitlijning van de extracellulaire matrix (ECM) in verschillende biologische systemen. Deze techniek is gebaseerd op niet-lineaire licht-materie-interacties om twee verschillende signalen te detecteren: het tweede harmonisch gegenereerde (SHG) diffusiesignaal, dat de visualisatie van collageenvezels en hun oriëntatie vergemakkelijkt, en het nabij-infrarood excitatiesignaal voor het afbeelden van ultraviolette geëxciteerde autofluorescentie.

SHG-beeldvorming blijkt vooral effectief bij het visualiseren van collageenvezels vanwege de niet-centrosymmetrische kristallijne structuur van fibrillair collageen I. Aangezien pezen matrixrijke weefsels zijn met een beperkt aantal cellen, maakt hun hoge collageengehalte ze ideale kandidaten voor analyse met behulp van twee-fotonmicroscopie. Bijgevolg biedt twee-fotonmicroscopie een waardevol middel om collageenafwijkingen in pezen te analyseren en te karakteriseren. De toepassing ervan strekt zich uit tot het bestuderen van peesontwikkeling, verwondingen, genezing en veroudering, waardoor de uitgebreide karakterisering van peescellen en hun interacties met de ECM onder verschillende omstandigheden mogelijk is met behulp van twee-fotonmicroscopie-instrumenten. Dit protocol schetst het gebruik van twee-fotonmicroscopie in de peesbiologie en presenteert een aangepaste methodologie om effectieve beeldvorming en karakterisering van peescellen tijdens de ontwikkeling en na letsel te bereiken. De methode maakt het mogelijk om dunne microscopisch kleine secties te gebruiken om een uitgebreid beeld te creëren van de ECM in pezen en de cellen die met deze matrix interageren. Het meest opvallende is dat het artikel een techniek toont om 3D-beelden te genereren met behulp van twee-fotonmicroscopie in diermodellen.

Inleiding

Om goed te functioneren en kracht over te brengen van spier naar bot¹, vertrouwen pezen op de intermoleculaire en intramoleculaire bindingen tussen collageenvezels. De ingewikkelde zelfassemblage, verknoping en uitlijning van de collageenvezels resulteren in de oprichting van een goed georganiseerde matrix die bijdraagt aan de biomechanische sterkte en flexibiliteit van peesweefsel ^2,3,4. Hoewel andere ECM-eiwitten ook bijdragen aan de stabiliteit van het fibrillaire netwerk in pezen⁵, is de droge massa van de pees ongeveer 86% collageen⁶, waarbij collageen I tot 96% van het totale collageengehalte uitmaakt ^7,8. Dit maakt de collageenstructuur uiteindelijk een belangrijke output van de normale gezondheid en functie van de pees.

Sommige klinische beeldvormingsmodaliteiten die voor pezen worden gebruikt, zijn MRI en/of echografie. Hoewel ultrasone technologie beelden levert van de fasciculaire structuur van de pees en een deel van de fibrillaire structuur in het weefsel^{onthult 9}, is de resolutie niet ideaal voor kwantificering. MRI heeft een betere ruimtelijke resolutie dan echografie, maar is nog steeds beperkt. Deze methoden zijn echter ook beperkt in hun potentiële beelddiepte door een weefsel. Op een meer microschaal kunnen kleine en brede lichtverstrooiing en confocale microscopie worden gebruikt om de structuur van collageenfibrillen en eventuele afwijkingen te beoordelen.

Daarentegen verschilt microscopie van de tweede harmonische generatie (SHG) van andere beeldvormingsmethoden omdat het de buitenste schil van de collageenfibrillen kan vastleggen. Collageen I-fibrillen in pezen zijn op een uniaxiale parallelle manier georganiseerd door de pees-ECM en zijn niet-centrosymmetrisch van aard ^4,10. Deze eigenschappen kunnen worden gebruikt voor beeldvorming met behulp van een multifotonmicroscoop, die heldere beelden kan produceren die tot 2-3 keer dieper zijn dan confocale beeldvorming¹¹. Dit stelt ons ook in staat om optische secties van de pees van betere kwaliteit te genereren. Wanneer licht in het monster van interesse wordt geprojecteerd, wordt een SHG-signaal geproduceerd en kan deze verstrooiing van licht worden opgevangen. In pezen levert dit een beeld op van de collageenstructuur en -uitlijning, waardoor we de mogelijke morfologische en pathologische gevolgen van tendinopathieën, verwondingen, enz. kunnen evalueren.

Aangezien collageen het grootste deel van de droge massa van de pees uitmaakt en bijdraagt aan de peesfunctie ^6,12, kan verstoring van de collageenstructuur de biomechanische eigenschappen van pezen beïnvloeden. Het analyseren van de structuur kan ons dus helpen de impact en ernst van verwondingen beter te begrijpen en een maatstaf te creëren voor de doeltreffendheid van genezing. Dit artikel bespreekt een methode die gebruik maakt van multifoton- en SHG-microscopie om te analyseren hoe ontwikkeling en verwondingen de structuur en uitlijning van collageen I-fibrillen beïnvloeden en om 3D-beelden van pees-ECM in diermodellen te genereren. Daarom kan onze methode om pezen in beeld te brengen onderzoekers helpen peescellen en ECM te karakteriseren tijdens de ontwikkeling of na een blessure.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocol #2013N0000062) en AAALAC-richtlijnen in het Massachusetts General Hospital. BHLHE40 null knockout of heterozygote vrouwelijke muizen met een Scx-GFP-achtergrond, leeftijd 30 dagen, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Tabel met materialen).

1. Weefselpreparatie en fixatie

1. Om het weefsel voor te bereiden, euthanaseren muizen in een CO₂ -kamer (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Om de hoeveelheid vacht die aan het weefselmonster kan blijven kleven te verminderen, besproeit u de muis met 70% EtOH totdat de vacht verzadigd is. Huid de achterpoten en verwijder vervolgens met een schaar de twee achterpoten door bij het heupgewricht te knippen.
3. Plaats de twee achterpoten in een scintillatieflacon van 20 ml en dompel ze onder in 4% PFA zodat de injectieflacon gevuld is. Plaats de injectieflacons een nacht op 4 °C en schud ze onder invloed.
4. Was de achterpoten in 1x PBS op kamertemperatuur (RT) met agitatie gedurende 10 minuten en herhaal in totaal 3 keer. Dompel de achterpoten onder in 0,5 M EDTA (pH 8,0) bij 4 °C met agitatie gedurende maximaal 2 weken, vervang door verse EDTA om de 2-3 dagen.
5. Was de achterpoten in 1x PBS bij RT met agitatie gedurende 10 minuten, herhaal de wasbeurten in totaal 3 keer.
6. Dompel de ledematen onder in verse 1x PBS en bewaar ze bij 4 °C totdat ze worden gebruikt voor beeldvorming.

2. Dissectie van de pees en het voorbereiden van weefsel voor beeldvorming

1. Terwijl u de voet met een tang vasthoudt, schuift u het ene uiteinde van het mes van de veerschaar (zie materiaaltabel) onder de achillespees en zorgt u ervoor dat u zo dicht mogelijk bij de myotendineuze overgang snijdt.
2. Houd het afgehakte myotendineuze uiteinde van de pees vast met een tang en gebruik de veerschaar om de pees zo dicht mogelijk bij het bot af te knippen.
   OPMERKING: Gebruik indien nodig een tang om de achillespees tijdens de eerste snede weg te houden van de rest van de achterpoot. Zorg ervoor dat u het weefsel niet verplettert of beschadigt, omdat dit de uitlijning van het collageen tijdens de beeldvorming zal beïnvloeden.
3. Om te permeabiliseren en een nucleaire tegenvlek te hebben, dompelt u de ontlede pees onder in PBT (1% Triton-X in PBS) met 0,1% Draq5 (voorraadconcentratie, 5 mM, zie materiaaltabel). Plaats de pees in een microcentrifugebuis van 2 ml en voeg 1 uL Draq5 toe aan 1 ml PBT. Incubeer 's nachts bij RT op een rocker. Aangezien Draq5 lichtgevoelig is, moet u de microcentrifugebuisjes afdekken met aluminiumfolie en de monsters beschermen tegen licht.
4. Verwijder vóór de beeldvorming de Draq5-oplossing en vervang deze door dPBS. Zorg ervoor dat u het monster blijft beschermen tegen licht.
   LET OP: Draq5 heeft toxiciteit van categorie drie en wordt door de OSHA Hazard Communication Standard als gevaarlijk beschouwd. Vermijd contact en gooi het weg in een geëtiketteerde afvalcontainer.
5. Snijd met een biopsieponstool met een binnendiameter van 6 mm een stuk gelschuim uit (zie materiaaltabel) en plaats het in een klein petrischaaltje van 60 x 15 mm. Voeg ddH₂O toe aan de schaal om het gelschuim te laten uitzetten.
6. Plaats de ontlede achillespees op gelschuim. Gebruik een dekglaasje dat op een ring is gelijmd en plaats de ring voorzichtig over de pees totdat het dekglaasje contact maakt met het weefsel. Om problemen bij het beeldvorming te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat er geen luchtbellen tussen het monster en het dekglaasje zitten. Voeg indien nodig meer ddH₂O toe aan de schaal om het monster en de ring met het dekglaasje af te dekken.

3. Beeldvorming met een multifotonmicroscoop

1. Met behulp van een FVMPE-RS multifoton lasermicroscoop, 25x objectief dat kan worden ondergedompeld in water, HPDS-O IR gepulseerde laser en IR gepulseerde laser (zie Materiaaltabel), lokaliseer het monster en het interessegebied dat zal worden afgebeeld met behulp van het EPI-lichtpad. Zodra het monster is gevonden, plaatst u de camera op het myotendineuze of enthetale uiteinde van de achillespees.
2. Schakel het lichtpad over naar LSH, stel de IR-laserinstelling van Laser 2 in op 840 nm en lijn actief uit. Pas de HV-sterkte aan om het weefsel en het SHG-signaal te kunnen zien, zonder de 20% te overschrijden. Pas de versterking niet aan en houd de offset gelijk aan 0.
3. Configureer vervolgens de z-stack-parameters om de voorbeeldafbeeldingen te verkrijgen. Gebruik een scanformaat van 1024 x 1024 en stel de stapgrootte in op 0,4 micron. Z-stacks zijn gemiddeld ongeveer 150 plakjes, en ze beginnen vanaf de buitenmantel en bewegen naar het midden van de pees totdat het SHG-signaal niet langer helder is, waardoor sagittale optische secties¹³ ontstaan.
4. Pas het laservermogen aan op de Bright Z-modus om standaardisatie van signaaldetectie mogelijk te maken. Zodra de start/stop-parameters van de Z-stack zijn vastgesteld, stelt u de laserintensiteit in op 4 aan het begin van de beeldvorming en 6 aan het einde van de beeldvorming. Dit helpt de consistentie in de SHG-signalering te behouden terwijl de scoop dieper in het weefsel beeldt.
5. Zodra de z-stacks zijn gegenereerd, verwerk je ze verder in ImageJ/FIJI om een film te maken van optische doorsneden in de dwarsrichting. Open hiervoor de ImageJ/FIJI-software¹⁴ en klik op Afbeelding > Stapels > Plak. Dit zal ons in staat stellen om een transversaal beeld van de achillespees te hebben, waardoor de stellaatmorfologie van tenocyten en hun oriëntatie in de collageenmatrix wordt onthuld.

Resultaten

Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van peescellen en hun extracellulaire matrix (ECM) na letsel, tijdens de ontwikkeling of in een mutante toestand. Met zorgvuldige dissectie en voorbereiding van het monster kunnen z-stack-video's door het weefsel worden gegenereerd in een sagittale oriëntatie (Video 1 en Video 2). Door de beelden te verwerken en opnieuw te snijden met ImageJ/FIJI ontstaat een dwarsaanzicht van de achillespees (Video's 3 en Video 4). Dit onthult de stellaatmorfologie van tenocyten en stelt ons in staat om hun unieke architectuur binnen de dichte collageenmatrix te observeren.

Door gebruik te maken van multifotonmicroscopie en gebruik te maken van de niet-centrosymmetrische kristallijne eigenschappen van fibrillair collageen I, werden optische doorsnedebeelden met hoge resolutie gegenereerd die zowel de peescellen als hun matrix vastleggen. Deze optische secties zijn geïsoleerd van de z-stacks voor zowel de BHLHE40 +/-; Scx-GFP en BHLHE40 -/-; Scx-GFP-muizen (respectievelijk Figuur 1A,B). De secties zijn afkomstig van de originele sagittale z-stack die is gemaakt door 2-P-beeldvorming en van de opnieuw gesneden z-stack die is gegenereerd met behulp van ImageJ/FIJI. Daarnaast kunnen we deze beeldvormingsmethode ook gebruiken om mogelijke verschillen in collageenorganisatie, cellulaire morfologie, enz. tussen de twee muizen te analyseren.

Figuur 1: Optisch gedeelte van BHLHE40 +/-; Scx-GFP en BHLHE40 -/-; Scx-GFP pees van de muis. Z-stack werd vastgelegd met behulp van een multifotonmicroscoop. (A) De optische secties die uit de Z-stack zijn verkregen, tonen het SHG-signaal en de GFP+/Draq5+-cellen in een BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, vrouwelijk, 14,68 g) en (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, vrouwelijk, 12,16 g). Sagittale secties hebben een SHG-signaal, terwijl transversale secties dat niet hebben. Monsters werden gekleurd met Draq5. SHG vangt de collageenmatrix in het weefsel op. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Z-stack video's van de sagittale weergave van BHLHE40 +/-; Scx-GFP pees van de muis. Z-stack werd vastgelegd met behulp van een microscoop met twee fotonen. De video toont de sagittale weergave van de achillespees. Monsters werden gekleurd met Draq5. SHG vangt de collageenmatrix in het weefsel op. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Z-stack video's van de sagittale weergave van BHLHE40 -/-; Scx-GFP muis achillespees. Z-stack werd vastgelegd met behulp van een microscoop met twee fotonen. De video toont de sagittale weergave van de achillespees bij een BHLHE40 null KO-muis. Monsters werden gekleurd met Draq5. SHG vangt de collageenmatrix in het weefsel op. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Z-stack video's van de dwarsaanzicht van BHLHE40 +/-; Scx-GFP pees van de muis. Z-stack werd vastgelegd met behulp van een microscoop met twee fotonen. De video toont het dwarsaanzicht van de achillespees. Monsters werden gekleurd met Draq5. SHG vangt de collageenmatrix in het weefsel op. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Z-stack video's van de dwarsaanzicht van BHLHE40 -/-; Scx-GFP muis achillespees. Z-stack werd vastgelegd met behulp van een microscoop met twee fotonen. De video toont het dwarsaanzicht van de achillespees bij een BHLHE40 null KO-muis. Monsters werden gekleurd met Draq5. SHG vangt de collageenmatrix in het weefsel op. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Dit artikel presenteert een methode om de achillespees van de muis voor te bereiden, te ontleden en in beeld te brengen, gebruikmakend van de niet-centrosymmetrische kristallijne eigenschappen van de pees-ECM. Belangrijke stappen bij de weefselvoorbereiding zijn permeabilisatie op tegenvlekken en het zorgen voor de juiste plaatsing van het weefsel in een petrischaaltje tijdens de beeldvorming. In plaats van Draq5 kan Hoechst 33258 worden gebruikt in een verdunning van 1:100.000¹³, maar Draq5 heeft de voorkeur vanwege de hoge permeabiliteit, fotostabiliteit en minimale fotobleking. Een goede plaatsing van het weefsel is cruciaal om luchtbellen tussen het dekglaasje en de pees te voorkomen, omdat een verkeerde oriëntatie de resulterende beelden kan beïnvloeden.

In vergelijking met andere microscopiemethoden maakt microscopie van de tweede harmonische generatie (SHG) het mogelijk om collageenfibrillen en peescellen in de matrix¹⁰ vast te leggen. In combinatie met tegenvlekken maken deze gegevens het mogelijk om te analyseren hoe ontwikkeling, blessures of mutaties de peesstructuur beïnvloeden. Het genereren van 3D-beelden van de ECM van de pees maakt het mogelijk om optische secties te observeren terwijl ze door de pees gaan. Hoewel multifotontechnologie zorgt voor superieure weefselpenetratie, heeft het nog steeds beperkingen bij beeldvorming door de gehele achillespees, waardoor aanvullende technieken zoals doorsnede nodig zijn. Deze methode maakt echter de productie mogelijk van ongeveer 150 optische secties van 0,4 micron met helderheid, waardoor weefselverstoring door secties wordt vermeden.

Samenvattend biedt deze methode waardevolle inzichten in het karakteriseren van peesontwikkeling, blessures, genezing en veroudering, door peescellen en ECM in beeld te brengen met behulp van multifotonmicroscopie. Het gebruik van multifotonbeeldvorming voor optische secties en z-stack-video's door het hele weefsel zorgt voor een beter begrip van veranderingen in de peesmorfologie onder experimentele omstandigheden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9262
2 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1620-2700
20 mL scintillation vial	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Gebruik PFA-ampoel om een 4% PFA-oplossing te maken
6 mm Biopsy Punch Tool	Ted Pella Inc.	15111-60
60 x 15 mm petrischaal
BHLHE40 null knockout of heterozygote muizen in een Scx-GFP achtergrond	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Dekvlakken	Fisher	12-544-F	Kan elk dekglas gebruiken dat het gebied van de M20-onderlegger overspant
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Fijne schaar 21 mm snijrand	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS multifoton laserscanmicroscoop	Olympus
Gelfoam steriele spons Maat 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR gepulseerde laser	Olympus
MaiTai HPDS-O IR gepulseerde laser	Olympus
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x)	Invitrogen	AM9625	Verdun 10x PBS in milli-Q water om een 1x oplossing te krijgen
Roestvrijstalen M20 platte onderlegger	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Verdun Triton X-100 in dPBS om een 1% oplossing te krijgen
Vannas veerschaar 4 mm snijrand	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens