Methodenartikel

Driedimensionale bioprinting van menselijke iPSC-afgeleide neuron-astrocyt coculturen voor screeningstoepassingen

DOI:

10.3791/65856

⸱

29 september 2023

 ,  ,  , 
1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om 3D-gebioprinte coculturen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten te produceren. Dit cocultuurmodel, gegenereerd in een hydrogelsteiger in formaten met 96 of 384 putjes, toont een hoge levensvatbaarheid na het printen en neurietuitgroei binnen 7 dagen en toont de expressie van rijpheidsmarkers voor beide celtypen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een celmodel levensvatbaar te maken voor het screenen van geneesmiddelen, moet het systeem voldoen aan de vereisten voor doorvoer en homogeniteit en een efficiënte ontwikkelingstijd hebben. Veel gepubliceerde 3D-modellen voldoen echter niet aan deze criteria. Dit beperkt daarom hun bruikbaarheid bij vroege toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen. Driedimensionaal (3D) bioprinten is een nieuwe technologie die kan worden toegepast op de ontwikkeling van 3D-modellen om de ontwikkelingstijd te versnellen, de standaardisatie te verhogen en de doorvoer te verhogen. Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van 3D biogeprinte cocultuurmodellen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide glutamaterge neuronen en astrocyten. Deze coculturen zijn ingebed in een hydrogelmatrix van bioactieve peptiden, extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten over de volledige lengte en met een fysiologische stijfheid van 1,1 kPa. Het model kan snel worden vastgesteld in formaten met 96 wells en 384 wells en produceert een gemiddelde levensvatbaarheid na het printen van 72%. De verhouding tussen astrocyten en neuronen in dit model blijkt 1:1,5 te zijn, wat binnen het fysiologische bereik voor het menselijk brein ligt. Deze 3D-biogeprinte celpopulaties vertonen ook expressie van volwassen neurale celtypemarkers en groei van neuriet- en astrocytenprojecties binnen 7 dagen na kweek. Als gevolg hiervan is dit model geschikt voor analyse met behulp van celkleurstoffen en immunokleuringstechnieken naast neurietuitgroeitesten. De mogelijkheid om deze fysiologisch representatieve modellen op grote schaal te produceren, maakt ze ideaal voor gebruik in screeningstests met gemiddelde tot hoge doorvoer voor neurowetenschappelijke doelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek naar ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) in de geneesmiddelenontdekkingsindustrie breidt zich uit1. Veel voorkomende CZS-ziekten zoals epilepsie, schizofrenie en de ziekte van Alzheimer hebben echter nog steeds geen genezende behandelingen 2,3,4. Het gebrek aan effectieve therapieën voor CZS-ziekten kan, althans gedeeltelijk, worden toegeschreven aan een gebrek aan nauwkeurige in vitro modellen van de hersenen. Dit heeft geresulteerd in een translationele kloof tussen de huidige in-vitromodellen en in-vivogegevens en een daaruit voortvloeiend knelpunt in de onderzoeksinspanningen.

Als gevolg van deze translationele kloof is er de afgelopen jaren een aanzienlijke toename geweest in de ontwikkeling van nieuwe 3D-celmodellen, waaronder neurale organoïden, neurosferoïden en op steigers gebaseerde modellen6. De 3D-structuur van deze modellen helpt bij het recapituleren van de neurale micro-omgeving, inclusief biomechanische spanningen, cel-celcontacten en de extracellulaire matrix (ECM) van de hersenen7. De hersen-ECM is een dynamisch element van de neurofysiologie dat de ruimte inneemt tussen neurale celtypen, waaronder neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en de neurovasculaire eenheid7. Van recapitulatie van de hersen-ECM is aangetoond dat het de neuronale morfologie en het neuronale vuren beïnvloedt, en veel complexe 3D-modellen van de hersenen hebben de afzetting van ECM-eiwitten door neurale celtypen aangetoond 8,9,10,11. Op steigers gebaseerde modellen bestaan uit volwassen neurale coculturen die zijn gesuspendeerd in een poreuze synthetische of biologische hydrogelmatrix die de hersenen ECM12 vertegenwoordigt. In tegenstelling tot organoïde en sferoïde systemen, maken op steigers gebaseerde 3D-modellen het mogelijk om de aanwezige ECM-eiwitten aan te passen en hebben ze het extra voordeel dat ze kunnen worden afgestemd op de hydrogelstijfheid om biomechanische spanningen na te bootsen13,14.

Hoewel een overweldigende meerderheid van de neurale 3D-modellen een verhoogde recapitulatie van de micro-omgeving van de hersenen laat zien, zijn niet alle modellen erg geschikt voor het implementeren van toepassingen voor het ontdekken vangeneesmiddelen15. Om een 3D-model in industriële processen te kunnen implementeren, moet het systeem voldoen aan de doorvoervereisten voor screeningtoepassingen en een relatief korte ontwikkelingstijd hebben16. 3D-bioprinten is een nieuwe technologie die het potentieel biedt om neurale modellen op basis van 3D-steigers te maken met een snelle ontwikkelingstijd, een hogere doorvoer en een hogere mate van precisiecontrole, naast het wegnemen van variabiliteit veroorzaakt door menselijke fouten17. Dit protocol presenteert een 3D-cocultuurmodel van menselijke iPSC-afgeleide glutamaterge neuronen en astrocyten in een hydrogelsteiger. Deze hydrogelsteiger bevat fysiologisch representatieve bioactieve peptiden (RGD, IKVAV, YIGSR) en ECM-eiwitten binnen een mimetische biomechanische stijfheid. Deze ECM-eiwitten van volledige lengte omvatten laminine-211 over de volledige lengte en hyaluronzuur, overvloedig aanwezig in de menselijke cortex, met een stijfheid van 1,1 kPa in overeenstemming met in vivo metingen18. Dit model is praktisch ontworpen voor het ontdekken van geneesmiddelen en is gemaakt met behulp van een 3D-bioprinter in een plaatformaat met 96 of 384 putjes dat geschikt is voor screeningsanalyse met behulp van beeldvormingstechnieken met celkleurstoffen en antilichamen, naast neurietuitgroeitests. Cellen vertonen expressie van markers van neurale celtypen en groei van neuriet- en astrocytaire projecties binnen 7 dagen na kweek. Dit protocol zal dus de methodologie presenteren om een high-throughput 3D neuraal cocultuurmodel te ontwikkelen voor gebruik in toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Illustratief overzicht van de methodologie die wordt gebruikt voor het 3D-bioprinten van coculturen. Menselijke iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten worden gecombineerd met activator- en bioink-oplossingen die bioactieve peptiden bevatten en worden gebioprint op hydrogelsteigers in formaten met 96 of 384 putjes met behulp van drop-on-demand bioprinttechnologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bioprinten van 3D-modellen

  1. Plaatkaart en printbestand genereren
    1. Genereer voorafgaand aan het genereren van het model een plaatkaart, protocol en afdrukbestand met behulp van de plaatkaartsoftware. Open de plaatkaartsoftware en selecteer de optie Kweekcellen in 3D .
    2. Selecteer het modeltype dat moet worden gebioprint uit de beschikbare opties in het vervolgkeuzemenu; dit model is gevalideerd in de formaten Imaging Model en HTP-model . Selecteer Imaging Model voor platen met 96 putjes en HTP voor platen met 384 putjes.
    3. Selecteer in het venster Matrixselectie Hydrogel Px02.53, dat laminine-211- en hyaluronzuureiwitten bevat, met IKVAV-, RGD- en YIGSR-peptiden.
    4. Voer in het pop-upvenster de celtypen in als glutamaterge neuronen en astrocyten en voer de celdichtheid in als 20 miljoen cellen/ml.
    5. Gebruik de software om de gewenste plaatkaart te ontwerpen door putjes op de plaat op het scherm te markeren. Neem minimaal 1 rij 2D-besturing op kunststof op in het ontwerp. 2D-besturing op plastic putten bestaat uit cellen die rechtstreeks in de put worden gedeponeerd zonder hydrogelsteiger; Smeer deze putjes in volgens stap 1.2.
    6. Zorg ervoor dat het plaatmodel dat bovenaan het venster wordt vermeld, is gewijzigd in het beoogde plaatmodel voor gebruik (zie Materiaaltabel).
    7. Download het protocol en print het bestand voor de plaatkaart met behulp van de downloadknoppen en sla ze op de computer op die aan de bioprinter is gekoppeld.
  2. Coating van 2D-besturing op kunststof putten
    1. Smeer de putjes ten minste 24 uur voor het printen in voor de 2D-controlemodellen voor celhechting en groei. 3D-modelputten hebben geen voorcoating nodig. Alle processen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast, tenzij anders vermeld. Platen kunnen tot 7 dagen voor het afdrukken worden gecoat en voorbereid.
    2. Maak 50 ml 1x boraatbuffer door 2,5 ml 20x boraatbouillonoplossing te verdunnen met 47,5 ml steriele dH2O.
    3. Voeg 100 μL 50% (m/v) polyethyleenimine (PEI) toe aan 50 ml 1x boraatbuffer om een 0,1% (w/v) PEI-oplossing en steriel filter te creëren door een filter van 0,22 μm.
    4. Voeg 0,1% (m/v) PEI-oplossing toe aan elke 2D-controleput, zoals aangegeven door de plaatkaart die in stap 1.1 is gegenereerd. Voeg 100 μl/putje toe bij gebruik van een plaat met 96 putjes of 25 μl/putje bij gebruik van een plaat met 384 putjes.
    5. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C voordat u de 0,1% (m/v) PEI-oplossing opzuigt en de putjes 5x spoelt met PBS. Laat de putjes volledig drogen in de bioveiligheidskast.
    6. Verdun 100 μl van 1 mg/ml laminineoplossing in 5 ml neurobasaal medium. Voeg 100 μl toe aan elk 2D-controleputje bij gebruik van een plaat met 96 putjes of 25 μl bij gebruik van een plaat met 384 putjes. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
    7. Als u platen bewaart, laat de laminineoplossing dan na incubatie op zijn plaats en bewaar bij 4 °C.  Verwarm de platen voor gebruik 1 uur voor op 37 °C.
  3. 3D-bioprinten van cocultuurmodellen
    1. Houd altijd een steriele techniek aan bij het gebruik van de bioprinter en veeg handschoenen, cartridges en kweekplaten af met 70% EtOH voordat u ze in de printer plaatst. Tenzij anders vermeld, voert u alle processen buiten de bioprinter uit in een bioveiligheidskast.
    2. Schakel de compressor voor de bioprinter in en initialiseer de printer door de knop Initialiseren op de bioprintersoftware te selecteren. Zodra de luchtstroom in de printer op gang is gekomen, veegt u de oppervlakken in de printer schoon met een 70% EtOH-doekje.
    3. Voer op de dag van het printen het begeleide Start of Day Greenlight-proces uit om de juiste nozzle-status voor de printrun te garanderen (minimale nozzle-status 2A2B).
    4. Neem een bioprinterpatroon uit de steriele verpakking, voeg 20 ml steriele dH2O toe aan compartiment A en voeg 6 ml steriel gefilterde 70% EtOH toe aan compartimenten B1-4. Plaats de cartridge in de linker cartridgehouder in de bioprinter en plaats het plaatdeksel in de daarvoor bestemde dekselhouder.
    5. Selecteer de Greenlight-knop op het startscherm van de software en bevestig in de software dat de cartridge op zijn plaats zit in de bioprinter en dat het deksel is verwijderd. Start het greenlight-proces.
    6. Wanneer de software daarom vraagt, moet u bevestigen dat er geen consistente druppels te zien zijn van de linker- of rechternaald. Controleer vervolgens, wanneer de software daarom vraagt, dat er water aanwezig is in de compartimenten B7 en B8.
    7. Nadat de bioprinter de zelfgeleide greenlight-stap heeft voltooid, plaatst u een niet-gecoate steriele platte bodemplaat met 96 putjes (los van de gecoate plaat voor bioprintcoculturen) en plaatst u deze nieuwe plaat in het rechter plaathoudergedeelte van de bioprinter wanneer daarom wordt gevraagd door de software. Zorg ervoor dat de bordenhouder is ingesteld op High Profile Plate en dat het deksel is verwijderd en in de speciale dekselhouder is geplaatst voordat u met de volgende stap begint.
    8. De bioprinter deponeert waterdruppels in elk putje van de plaat met 96 putjes. Als u klaar bent, plaatst u de plaat van de bioprinter en controleert u of er waterdruppels aanwezig zijn in elk putje van de plaat.
    9. Gooi de plaat met 96 putjes weg die wordt gebruikt voor groen licht en laat de bioprinter het groen licht afmaken. Eenmaal voltooid, geeft de software de nozzle-status van de bioprinter aan en bevestigt deze dat de bioprinter klaar is om modellen af te drukken. Plaats het deksel op de printcartridge en verwijder deze naar de bioveiligheidskast voor de volgende stappen.
    10. Laad met behulp van de bioprintersoftware het afdrukbestand (gegenereerd in stap 1.1) in de software met behulp van de knop Print Run-software en open de pdf van het afdrukprotocol.
    11. Zuig bioinkt en activatorvloeistoffen, zoals aangegeven op de pdf van het printprotocol, op van -20 °C en ontdooi ze gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voor hydrogelmatrix Px02.53 omvat dit: 1x injectieflacon F32, 1xflacon F3, 1x injectieflacon F261, 1x injectieflacon F299. Ontdooi bioinkt en activatorvloeistoffen niet in handen of waterbaden.
    12. Breng 50 ml complete media met doxycycline en ROCK-remmer (complete media +DOX/ROCKi) (zie stap 2.2) naar RT terwijl bioink en activatorvloeistoffen ontdooien.
    13. Zodra de bio-inkten en activatoren zijn ontdooid, bereidt u de printcartridge voor volgens de instructies op de laatste twee pagina's van de gegenereerde pdf van het afdrukprotocol. De greenlight-printercartridge zal worden hergebruikt voor de modelprintfasen.
      1. Zorg ervoor dat er 40 ml dH2O in compartiment A1 en 8 ml 70% EtOH in compartimenten B1 en B2 zit. Voeg 1,2 ml activator F32 toe aan C1, 1,2 ml F3 aan C2 en 200 μl F261 aan C4.
      2. Haal de PEI en de met laminine beklede plaat uit de incubator en plaats deze in de printer in het rechter compartiment van de plaathouder. Verwijder de laminine-media-oplossing op dit punt niet uit de putjes. Zorg ervoor dat het compartiment van de bordenhouder is ingesteld op Low Profile Plate en dat het deksel is verwijderd en in de dekselhouder zit.
    14. Plaats de printcartridge in de bioprinter, zorg ervoor dat het deksel is verwijderd en in de houder is geplaatst, en start de printrun op de software door de Print Inert Base-knop op de bioprintersoftware te selecteren.
    15. Terwijl de inerte basis aan het printen is, haalt u de flesjes met glutamaterge neuronen en astrocyten uit de opslag van vloeibare stikstof, ontdooit u ze en resuspendeert u ze volgens de instructies in sectie 2.
    16. Zodra de cellen zijn ontdooid en aan elk celtype afzonderlijk 8 ml volledig medium +DOX/ROCKi is toegevoegd (volgens sectie 2), centrifugeert u de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    17. Zuig het supernatans op en resuspendeer beide celtypen afzonderlijk in 1 ml volledige media +DOX/ROCKi.
    18. Voeg 20 μL celsuspensie toe aan 20 μL trypanblauw en meng voor het tellen van de cellen om de levensvatbare celconcentratie per ml voor elk celtype te bepalen.
    19. Combineer in totaal 3 miljoen glutamaterge neuronen met 1 miljoen astrocyten in een buis van 15 ml. Voeg media toe om een totaal volume van 8 ml te creëren.
    20. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    21. Zuig zoveel mogelijk van het supernatans op zonder de celpellet te verstoren en resuspendeer de celpellet in 200 μL activatorvloeistof F299.
    22. Merk op dat de activatorvloeistof stroperig is; pipet op en neer om de pellet volledig te resuspenderen. De celtypen zijn delicaat; Minimaliseer afschuiving en luchtbellen door gebruik te maken van een pipetpunt met brede boring en de omgekeerde pipetteertechniek. Pipeteer niet meer dan 3 keer stevig op en neer om celverlies te voorkomen.
    23. Zodra de inerte basisfase klaar is met printen, plaatst u de deksels op de cartridge en de kweekplaat, verwijdert u beide uit de bioprinter en plaatst u ze in de bioveiligheidskast.
    24. Voeg de 200 μl celsuspensie in F299 toe aan putje C3 van de printcartridge, plaats de cartridge terug in de bioprinter, verwijder het deksel en plaats het in de dekselhouder. Plaats het kweekplaatje nog niet terug.
    25. Start de fase Afdrukmodellen van de oplage. Terwijl de bioprinter vloeistoffen aan het vullen is, verwijdert u de laminine-media-oplossing uit de 2D-controleputjes van de plaat en vervangt u deze door 150 μL volledige media +DOX/ROCKi in elke 2D-controleput bij gebruik van een plaat met 96 putjes en 50 μL volledige media +DOX/ROCKi bij gebruik van een plaat met 384 putjes.
    26. Nadat de vloeistoffen zijn geprimed, plaatst u de bioprint-doelplaat in de bioprinter, verwijdert u het deksel en plaatst u deze in de dekselhouder.
    27. Start het targetingproces voor bioprinters.
      1. Wanneer de bioprintsoftware hierom vraagt, verwijdert u de richtplaat van de bioprinter.
      2. Gebruik de gids om te selecteren waar druppels op de plaat kunnen worden waargenomen. Plaats de richtplaat terug in de bioprinter en herhaal het druppelafdruk- en selectieproces.
      3. Verwijder desgevraagd opnieuw de richtplaat en vervang deze vervolgens door de celkweekplaat (met media in de 2D-controleputjes volgens stap 1.3.25). Zorg ervoor dat het deksel van de kweekplaat eraf is en in de houder is geplaatst. De bioprinter voltooit het printen van het model.
    28. Zodra het printen van het model is voltooid, volgt u de celkweekmethoden in sectie 2 (stap 2.8) om media aan de putjes toe te voegen.
    29. Begin met het reinigingsproces van de bioprinter en gooi de cartridges en resterende vloeistoffen weg volgens de laboratoriumprotocollen.

2. Celkweek

  1. Modellen worden gegenereerd met behulp van 1x flacon glutamaterge neuronen (>5 miljoen cellen per flacon) en 1x flacon astrocyten (>1 miljoen cellen per flacon).
  2. Verwarm het waterbad voor op 37 °C.
  3. Transporteer beide injectieflacons met cellen onmiddellijk na verwijdering uit droogijs naar het laboratorium en ondergedompeld in een waterbad. Ontdooi beide injectieflacons tegelijkertijd.
  4. Haal de injectieflacons uit het waterbad als er nog maar een klein ijskristal over is; Dit duurt ongeveer 3 minuten na onderdompeling. Draai of meng de cellen niet in het waterbad.
  5. Spuit de injectieflacons in met 70% EtOH en breng ze over in de bioveiligheidskast.
  6. Voeg 500 μL complete media +DOX/ROCKi druppelsgewijs toe aan elke injectieflacon voordat u elke suspensie overbrengt in afzonderlijke buisjes van 15 ml.
  7. Vul de media in elke tube bij tot 8 ml en ga verder met de bioprintstappen volgens stap 1.3.
  8. Voeg volgens bioprintmodellen (stap 1.3) onmiddellijk complete media +DOX/ROCKi toe aan alle 3D-cocultuurputten en plaats de modellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Als u een plaat met 96 putjes gebruikt, voeg dan 150 μl media per putje toe; als u een plaat met 384 putjes gebruikt, gebruik dan 50 μl media per putje.
  9. De eerste 48 uur van de cultuur zijn er geen mediawisselingen nodig.
  10. Bij het verwisselen van media op 2D-bedieningselementen en -modellen moet ervoor worden gezorgd dat er geen mechanische spanning ontstaat, waardoor 2D-culturen kunnen loskomen of vervorming van de hydrogel kan ontstaan. Voer de media-aspiratie en -toevoeging langzaam uit met behulp van een micropipet die langs de zijkant van de put wijst.
  11. Voer na 48 uur een 90% mediawissel uit op alle putjes en verwijder ROCKi uit de mediasamenstelling (zie stap 2.14).
  12. Voer na 96 uur nog eens 90% mediawissel uit op alle putjes om DOX uit de mediasamenstelling te verwijderen (zie stap 2.14).
  13. Na de twee 90%-mediawisselingen na 48 uur en 96 uur, voert u elke 48 uur 50% mediawisselingen uit, waarbij 50% van de media wordt opgezogen en vervangen door nieuwe volledige media
  14. Samenstelling van de media:
    1. Volledige media: Neurobasale media met 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF.
    2. Complete media plus doxycycline (DOX): Neurobasale media met 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml neurotrofine-3 (NT3), 5 ng/μL brain-derived neurotrophic factor (BDNF) en 1 μg/ml doxycycline.
    3. Complete media plus DOX/ROCK-remmer (ROCKi): Neurobasale media met 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml doxycycline en 10 μM ROCK-remmer.

3. Analyse van de groei van de Neurite

  1. Plaats cellen in een levende celmicroscoop voor helderveldbeeldvorming onmiddellijk na de toevoeging van media na bioprinten.
  2. Gebruik microscoopsoftware om cellen te plannen die gedurende ten minste 7 dagen elke 12 uur in elk putje met een vergroting van 4x worden afgebeeld, inclusief 2D-controles.
  3. Voer elke 48 uur een mediawissel uit, zoals beschreven in rubriek 2, waarbij u de cellen telkens na het wisselen van media weer in de microscoop plaatst.
  4. Exporteer na 7 dagen gegevens de afbeeldingen uit de software in .jpg formaat
  5. Importeer al .jpg afbeeldingen in ImageJ-software en converteer bestanden naar 8-bits indeling. Laad de NeuronJ-plug-in en traceer de groei van neurieten in afbeeldingen, inclusief vertakkingspunten, met behulp van de traceringstool.
  6. Gebruik de neuriettraceringsgegevens die zijn gegenereerd door NeuronJ om de uitgroei van neurieten in de loop van de tijd in kaart te brengen.

4. Analyse van de levensvatbaarheid van cellen

  1. Kleurt op elk tijdstip van 24 uur in de kweek 3 of meer putjes voor analyse van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een levende/dode levensvatbaarheidskit. Herhaal deze stap op tijdstippen van 24 uur of 48 uur voor de duur van het onderzoek.
  2. Bereid levende/dode reagensmedia voor door levend celreagens (1x Calceïne-AM) en dode-celreagens (1x ethidiumhomodimeer-1) en 1x levende celkernkleuring (Hoechst 33342) 30 minuten voor beeldvorming te suspenderen in 10 ml gereduceerd serummedium zonder fenolrood (Opti-MEM). Laat levende/dode reagensmedia naar RT komen. Bewaar levende/dode reagensmedia uit direct licht als gevolg van fluorescentiebleking.
  3. Verwijder media uit 3 putjes met celmodellen/2D-controles, waarbij u zorgvuldig gelverstoring voorkomt. Was de celmodellen eenmalig met RT steriele PBS. Voeg 100 μL levende/dode reagensmedia toe aan elk putje voor een plaat met 96 putjes of 25 μl voor een plaat met 384 putjes.
  4. Incubeer de modellen gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Na incubatie zijn de modellen klaar voor beeldvorming. Voer beeldvorming uit op elke standaardmicroscoop met rode (647 nm, dode cellen), groene (488 nm, levende cellen) en blauwe (405 nm, nucleaire kleuring) excitatiekanalen. Voor de beste resultaten in 3D-modellen beeldt u modellen met een confocale microscoop met een hoog gehalte en voert u beeldvorming uit met behulp van een Z-stack-functie bij een vergroting van 4x of 10x.
    OPMERKING: In deze studie werden celmodellen in beeld gebracht met behulp van de INCell Analyzer 6500HS (high-content imaging system) en werd de analyse uitgevoerd met behulp van Signals Image Artist (beeldanalyseplatform, zie stap 4.7).
  6. Nadat de beeldvorming is voltooid, brengen de celmodellen terug naar de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Laat echter celmodellen die worden gebruikt voor levensvatbaarheidsanalyse weg uit verdere studies vanwege de levende/dode reagensmedia voor de levensvatbaarheid op lange termijn.
  7. Analyse van beelden op het beeldanalyseplatform
    1. Selecteer elk vlak van de Z-stack-afbeelding in de software. Combineer vlakke beelden als een projectiebeeld met maximale intensiteit.
    2. Maak een nieuwe analyse door het biogeprinte model te selecteren als een interessegebied (ROI) door fluorescentie te identificeren van het levende celkanaal bij 488 nm (zorg ervoor dat alle cellen zijn geselecteerd onder ROI).
    3. Gebruik binnen het interessegebied de beeldvormingssoftware om het aantal cellen in de ROI te identificeren via het nucleaire kleuringskanaal (405 nm), het aantal levende cellen in de ROI met behulp van het 488 nm-kanaal en het aantal dode cellen in de ROI met behulp van het 647 nm-kanaal.
    4. Voer de analyse uit op alle levende/dode behandelde celmodelputjes en exporteer de gegevenstabel met het ROI-gebied, het totale aantal cellen, het aantal levende cellen en het aantal dode cellen.
    5. Bereken het aantal levende en dode cellen als percentage van het totale aantal cellen per analysedag.

5. Immunokleuring en celpopulatieanalyse

  1. Verwijder vóór de fixatie media uit de celmodellen en was de modellen eenmaal in PBS.
  2. Fixeer cellen met 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS bij RT gedurende 20 minuten.
    LET OP: Alle werkzaamheden met paraformaldehyde moeten worden uitgevoerd volgens laboratoriumprocedures.
  3. Zuig 4% (v/v) paraformaldehyde-oplossing uit de modellen en was de modellen vier keer in PBS om paraformaldehyde volledig te verwijderen.
  4. Permeabiliseer de celmodellen met 0,2% triton-X gedurende 30 minuten bij RT en was drie keer met PBS.
  5. Blokkeer de celmodellen met 10% (v/v) normaal ezelserum (NDS) gedurende 3 uur bij RT.
  6. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg primaire antilichamen (verdund in 1% v/v NDS in PBS) toe aan de modellen. Als u een analyse van de celpopulatieratio uitvoert (zie stap 5.11), zorg er dan voor dat u celmodellen opneemt die gelijktijdig gekleurd zijn voor Β-III-tubuline (met rode AF647-conjugatie) en GFAP (met groene AF488-conjugatie). Incubeer modellen met primaire antilichamen gedurende 24 uur bij 4 °C.
  7. Was na de primaire incubatie de modellen die met geconjugeerde primaire antilichamen zijn gekleurd driemaal in PBS en versla de kleuring met 20 μM Hoechst gedurende 30 minuten. Afbeelding zoals beschreven in stap 5.10.
  8. Was de modellen die gekleurd zijn met niet-geconjugeerde primaire antilichamen driemaal in PBS en voeg secundaire antilichamen toe (verdund in 1% v/v NDS in PBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 4 °C.
  9. Verwijder secundaire antilichamen door drie keer te wassen in PBS en ga modellen tegen met 20 μM Hoechst gedurende 30 minuten voordat ze worden gescreend.
  10. Voer beeldvorming uit op standaardmicroscopen met rode (647 nm) en groene (488 nm) excitatiekanalen. Voor de beste resultaten in 3D-modellen maakt u echter beeldmodellen met behulp van een confocale microscoop met een hoog gehalte en voert u beeldvorming uit met behulp van een Z-stack-functie bij een vergroting van 4x of 10x.
  11. Analyse van celpopulatieratio's op het beeldanalyseplatform
    1. Verkrijg een analyse van celpopulaties met behulp van modellen die gelijktijdig gekleurd zijn voor GFAP (met AF488-conjugatie) en Β-III-tubuline (met AF647-conjugatie).
    2. Selecteer elk vlak van de Z-stack-afbeelding in de software en combineer de vlakafbeeldingen als een projectiebeeld met maximale intensiteit.
    3. Maak een nieuwe analyse door het biogeprinte model te selecteren als ROI door fluorescentie te identificeren van het Β-III-tubulinekanaal bij 647 nm (zorg ervoor dat alle celbevattende gebieden zijn geselecteerd onder ROI).
    4. Gebruik binnen de ROI de software om het aantal cellen in het Hoechst-kanaal (405 nm), het aantal GFAP+-astrocyten in de ROI met behulp van het 488 nm-kanaal en het aantal Β-III-tubuline+-cellen in de ROI met behulp van het 647 nm-kanaal te identificeren.
    5. Voer de analyse uit op alle co-gekleurde celmodelputjes en exporteer de gegevenstabel met het ROI-gebied, het totale celaantal, het aantal GFAP+-cellen en het aantal Β-III-tubuline+-cellen.
    6. Bereken het aantal GFAP+- en Β-III-tubuline+-cellen als percentage van het totale aantal cellen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van de groei van de neuriet
In dit protocol werden iPSC-afgeleide glutamaterge neuronen en astrocyten in cocultuur gebioprint in een hydrogelmatrix met behulp van de 3D-bioprinter. Gedurende de eerste 7 dagen na het printen werden cellen elke 12 uur afgebeeld met behulp van een levende celmicroscoop. Na het bioprinten moeten cellen een afgeronde morfologie hebben en verspreid zijn over de hydrogelmatrix, waarbij ze geleidelijk veranderen om kleinere celclusters te vormen met weinig uitsteeksels gedurende de eerste paar dagen van de kweek (zie aanvullende video 1 voor representatieve gezonde celgroei). Op dag 4 zullen gezonde cellen door de gel migreren om grotere clusters te vormen, die met elkaar verbonden zijn door uitgroeiingen van neurieten. Op dag 7 zouden er bijna geen afzonderlijke cellen meer over moeten zijn, de onderling verbonden bundels neurieten en astrocytaire uitsteeksels zouden versterkt moeten lijken en er kunnen veel kleinere neurietuitgroeiingen worden gezien die zich uit de clusters vormen (Figuur 2A). Met behulp van een reeks live celhelderveldbeelden die gedurende de groeiperiode van 7 dagen zijn gemaakt, werd een analyse van de uitgroei van neurieten uitgevoerd zoals beschreven in sectie 3. Deze analyse toonde aan dat de uitgroei van neurieten bijna lineair toeneemt (R2-waarde = 0,84) tussen 12 uur en 156 uur (Figuur 2B). Tijdens deze periode van uitgroei van neurieten nemen ook de clusters van cellichamen in omvang toe (zie aanvullende video 1), wat wijst op celmigratie door de hydrogel.

Levensvatbaarheid van cellen en populatieverhouding
In dit protocol wordt een concentratie van 20 miljoen cellen/ml, bestaande uit 15 miljoen neuronen/ml en 5 miljoen astrocyten/ml, gebruikt voor het bioprinten van de celmodellen. Met behulp van kleuring van levende cellen met calceïne-AM (levende cellen), ethidiumhomodimeer-1 (dode cellen) en een nucleaire kleuring, kan het aantal cellen dat overleeft over een periode van 7 dagen worden berekend volgens sectie 4 (Figuur 3A). Resultaten van de levensvatbaarheid van cellen voor representatieve culturen worden getoond voor dag 4, waar 72% ± 1% (gemiddelde ± SEM) van de totale cellen levend zijn en kleuring vertonen voor Calceïne-AM, terwijl 29% ± 2% (gemiddelde ± SEM) totale cellen dood zijn en kleuring vertonen met ethidiumhomodimeer-1 (Figuur 3B). Representatieve beelden van celkleuring met Calceïne-AM en ethidiumhomodimeer-1 zijn te zien in aanvullende figuur 1. Opgemerkt moet worden dat celoverlevingswaarden voor 3D-culturen niet direct kunnen worden vergeleken met 2D-culturen, omdat dode cellen in de hydrogel worden vastgehouden en niet worden verwijderd tijdens celvoedingsprocessen.

Met behulp van de immunofluorescerende kleuring voor Β-III-tubuline en GFAP, zoals beschreven in rubriek 5 en in figuur 4, kan beeldanalyse worden uitgevoerd om de celpopulatieverhoudingen tussen neuronen en astrocyten te bepalen (figuur 3A). Van het totale aantal cellen per model in representatieve culturen vertegenwoordigen Β-III tubuline-positieve neuronen 49% ± 3% (gemiddelde ± SEM), terwijl GFAP-positieve astrocyten 30% ± 4% (gemiddelde ± SEM vertegenwoordigen). Dit geeft een verhouding van respectievelijk 1:1,5, astrocyten en neuronen. Dit laat een rest over van 21% totale cellen per model, die voor geen van beide celmarkers kleuren. Aangezien de analyse van de levensvatbaarheid van cellen heeft aangetoond dat een gemiddelde waarde van 29% van de cellen op dag 4 niet levensvatbaar is, is het waarschijnlijk dat deze cellen dood zijn in de hydrogel.

Expressie van celmarkers
De morfologie van de gebioprinte neuronen en astrocyten werd beoordeeld door middel van immunokleuring voor neuronale celtypemarker (Β-III-tubuline) en astrocytaire marker (GFAP). In de getoonde representatieve culturen is immunokleuring gelokaliseerd in individuele celtypen, wat een gezonde celmorfologie vertoont, waarbij beide celtypen uitgroei van cellulaire uitsteeksels vertonen (Figuur 4A,B). Omdat de hydrogel en de celstructuren driedimensionaal zijn, vertegenwoordigt elke afbeelding slechts één plak door de structuur in figuur 4A,B. Figuur 4C toont een samengevoegde stapel afbeeldingen in de hydrogel, die weergaven van cellokalisatie in de X-, Y- en Z-vlakken laat zien. Figuur 4D toont immunokleuring voor alleen Β-III-tubuline; het benadrukken van fijnere uitgroeiingen van neurieten uit de clusters van het cellichaam. Om het fenotype van de glutamaterge neuronen verder te onderzoeken, kan immunokleuring voor de glutamaterge ionische receptormarker, GluR2, worden uitgevoerd. In figuur 4E is gebied 4E.1 (inzet) gemarkeerd om puntkleuring met een hogere resolutie langs de neurietbundels te laten zien. Dit bevestigt dus dat neuronen in deze cocultuur een glutamaterge fenotype hebben. In alle immunokleuringsbeelden kunnen immunofluorescerend gekleurde niet-celstructuren worden waargenomen rond de celclusters en neurieten. Het is waarschijnlijk dat deze structuren puin vertegenwoordigen dat in de hydrogel wordt vastgehouden in combinatie met kleine hoeveelheden niet-specifieke antilichamen die aan de hydrogel binden. Dit wordt verwacht in biogeprinte culturen, omdat binnen 3D-steigermodellen dode cellen en puin niet worden verwijderd tijdens celvoeding. Een representatief negatief beeld van immunokleuring van de negatieve controle wordt weergegeven in aanvullende figuur 2 voor een demonstratie van hydrogel niet-specifieke binding van secundaire antilichamen.

figure-results-1
Figuur 2: Glutamaterge neuronen en astrocyten werden met behulp van de bioprinter in de hydrogelmatrix gebioprint en werden elke 12 uur in beeld gebracht met behulp van een helderveldmicroscoop . (A) Een voorbeeld van een helderveldopname van celculturen tijdens de analyse. De afbeelding vertegenwoordigt het tijdstip 156 uur en de schaalbalk vertegenwoordigt 400 μm. (B) De gemiddelde lengte van neurietuitgroeiingen (μm) van de culturen gemeten met behulp van het NeuronJ-pakket voor ImageJ. Elk datapunt is n = 3 neurieten en de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Een concentratie van 20 miljoen cellen/ml activatoroplossing werd gebruikt voor het bioprinten van de celmodellen. (A) De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend met behulp van levende/dode celkleurstoffen (respectievelijk Calceïne-AM en ethidiumhomodimeer-1). Uit de waarden blijkt dat 72% ± 1% (gemiddelde ± SEM, n = 3) van het totale aantal cellen per put levend is en 29% ± 2% (gemiddelde ± SEM, n = 3) van de cellen dood is van de totale celpopulatie per put op dag 4. De getoonde waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. (B) Het percentage neuronen en astrocyten per putje in celpopulaties werd berekend door middel van beeldanalyse van kleuring zoals weergegeven in figuur 4. Neuronen vertegenwoordigen het percentage cellen dat positief kleurt voor Β-III-tubuline op dag 7 (49% ± 3%, gemiddelde ± SEM, n = 3), terwijl astrocyten het percentage cellen vertegenwoordigen dat positief kleurt voor GFAP op dag 7 (30% ± 4%, gemiddelde ± SEM, n = 3). De getoonde waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. Alle beeldvorming voor berekeningen die in figuur 3 worden getoond, werd uitgevoerd op een confocaal beeldvormingssysteem en alle analyses werden uitgevoerd op het beeldanalyseplatform en GraphPad Prism volgens methoden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Expressie van markers van neurale celtypen in 3D-gebioprinte coculturen van glutamaterge neuronen en astrocyten op dag 7 . (A,B) Immunofluorescerende kleuring van neuronale marker Β-III tubuline en astrocytmarker GFAP, afgebeeld op een omgekeerd microscoopplatform bij een vergroting van 10x. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (C) Immunofluorescerende kleuring van neuronale marker β-III tubuline en astrocytmarker GFAP gekleurd in combinatie met Hoechst, weergegeven in XYZ-vlakweergave, afgebeeld op een confocaal beeldvormingssysteem bij een vergroting van 10x. Gemaakt op het beeldanalyseplatform. De schaalbalk geeft 100 μm aan. (D) Immunofluorescerende kleuring van neuronale marker β-III tubuline in co-kleuring met Hoechst, afgebeeld op een confocaal beeldvormingssysteem bij een vergroting van 20x. De schaalbalk staat voor 100 μm. (E) Immunofluorescerende kleuring van glutamaterge marker GluR2 in co-kleuring met Hoechst, afgebeeld op een omgekeerd microscoopplatform met een vergroting van 10x. Vak 3E.1 toont gemarkeerde gebieden met GluR2-kleuring. De schaalbalk staat voor 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: Glutamaterge neuronen en astrocyten werden met behulp van de bioprinter in de hydrogelmatrix gebioprint en werden elke 12 uur afgebeeld met behulp van een helderveldmicroscoop. Video van helderveldfoto's gemaakt van celculturen tijdens analyse, tijdpunten worden aangegeven in de rechterbenedenhoek en schaalbalken vertegenwoordigen 400 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Voorbeeldafbeeldingen van levende/dode analyse van gebioprinte neuronen en astrocyten op dag 4. Calceïne-AM-kleuring in groen (488 nm) en ethidiumhomodimeerkleuring in rood (647 nm). De afbeelding wordt weergegeven in XYZ-vlakweergave, gemaakt op het beeldanalyseplatform . De schaalbalk staat voor 100 μm. (A) De beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem met een vergroting van 4x. (B) Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem bij een vergroting van 10x Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Voorbeeld van een negatief controlebeeld na immunofluorescerende kleuring. Primaire antilichamen werden weggelaten en groene (488 nm) en rode (647 nm) secundaire antilichamen werden gebruikt volgens immunokleuringsprotocollen. De afbeelding wordt weergegeven in XYZ-vlakweergave, gemaakt op het beeldanalyseplatform. De schaalbalk staat voor 100 μm. De beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem bij een vergroting van 10x. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De behoefte aan nauwkeurige modellen van het CZS is nog nooit zo groot geweest, en de beperkingen van tweedimensionale (2D) traditionele celkweekmodellen hebben de afgelopen jaren geleid tot een generatie complexe CZS-modellen19. Veel complexe 3D-modellen die interacties tussen neurale celtypen en de ECM weergeven, hebben echter beperkingen die de toepassing van deze modellen in industriële processen zouden verhinderen 6,20,21. In dit protocol ontwikkelen we een 3D-cocultuurmodel van menselijke iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten, dat tot doel heeft enkele van deze beperkingen op te lossen met behulp van 3D-bioprinttechnologie om een bioactieve hydrogelsteiger te creëren in formaten met 96 putjes en 384 putjes.

De methodologie voor het ontwikkelen van deze modellen is vereenvoudigd door middel van de software voor het ontwerpen van plaatkaarten, automatisch gegenereerde printprotocollen en het begeleide printproces van de bioprinter. Vanwege de gevoelige aard van de gevoelige iPSC-afgeleide celtypen die in dit protocol worden gebruikt, moet echter voorzichtigheid worden betracht met de volgende kritieke stappen bij het ontdooien en kweken. Ten eerste heeft de opname van ROCK-remmer (ROCKi) verschillende voordelen tijdens het bioprintproces en tijdens de vroege kweek. Het ontdooien van cellen is een kritiek punt waarop de neuronen een stressreactie kunnen ervaren, en onjuiste ontdooiprotocollen kunnen de overlevingskansen verkleinen22. Het wordt meestal aanbevolen om cellen zo efficiënt mogelijk te ontdooien, media toe te voegen en cellen zo efficiënt mogelijk op incubatortemperatuur te brengen23. Tijdens het bioprintproces dat in dit protocol wordt beschreven, is het echter noodzakelijk dat neuronen en astrocyten opnieuw worden gesuspendeerd in een activatoroplossing in plaats van media, en dat cellen pas aan het einde van de printrun (tot 30 minuten na ontdooien) boven kamertemperatuur worden gebracht. De toevoeging van ROCKi aan de media onmiddellijk na het ontdooien en het opnemen van dit tijdens de twee centrifugatiestappen (stappen 2.1-2.7 en 1.3.15-1.3.20) is dus absoluut noodzakelijk om de celspanningsroutes te remmen, wat zou resulteren in lagere levensvatbaarheidsniveaus24. Bovendien is aangetoond dat ROCKi de uitgroei van neurieten bevordert en de neuronale rijping verbetert25. Zo wordt de suppletie met ROCKi voortgezet gedurende 48 uur na het bioprinten. Het is echter absoluut noodzakelijk om de ROCKi-suppletie na 48 uur te verwijderen om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden afgewassen tijdens de daaropvolgende mediawisselingen voordat de cellen voor de test worden gebruikt.

Een volgende stap die kritische aandacht vereist, is het toevoegen van media na het printen en het wisselen van media (stappen 2.8-2.13). De biogeprinte hydrogelsteiger heeft een equivalente biomechanische stijfheid van slechts 1,1 kPa, wat overeenkomt met grijze stof. Zoals beschreven in stap 2.10 is het van cruciaal belang om tijdens het toevoegen en opzuigen van media voorzichtig in de zijkant van de put te pipetten om verstoring te voorkomen. Dit is met name van belang voor platen met 384 putjes, waar het gelniveau een groter deel van het totale putvolume in beslag neemt. Deze methode moet ook worden gebruikt in 2D-controleputten om het optillen van de randen van cellen en het afschuiven van neurietuitgroeiingen te voorkomen. De auteurs willen ook het belang benadrukken van een steriele techniek in de bioprinter, die met dezelfde voorzichtigheid moet worden behandeld als die van een bioveiligheidskast die wordt gebruikt voor iPSC-afgeleide celculturen. Dit omvat het steriel filteren van 70% EtOH en dH2O die worden gebruikt bij de greenlight- en printprocedures, het houden van deksels op de cartridges en platen terwijl de handen in en uit de bioprinter worden bewogen, en het ontsmetten van oppervlakken in de bioprinter met 70% ethanoldoekjes voor en na het printen.

De biogeprinte hydrogelsteiger, gevormd uit bio-inkt en activatoroplossingen, geselecteerd om dit model te ontwikkelen, is geselecteerd uit een reeks bio-inkten en activatoroplossingen die door Inventia Life Science zijn ontwikkeld voor gebruik in de RASTRUM-bioprinter. Laminine en hyaluronzuur werden geïdentificeerd als moleculen die relevant zijn voor iPSC-afgeleide neuronale rijping vanwege hun rol bij axonale geleiding, synapsvorming en vorming van het perineuronale net26,27. Verder werd gekozen voor een biomechanische stijfheid van 1,1 kPa, omdat is aangetoond dat hydrogels met een lagere dichtheid een betere uitgroei van neurieten uit neuronen mogelijk maken12. Als er wijzigingen in het protocol worden aangebracht door gebruik te maken van neuronen en astrocyten die intern of van een andere commerciële leverancier zijn gedifferentieerd, wordt aanbevolen om een matrixselectietest uit te voeren om de meest ondersteunende hydrogelsteiger te bepalen15. Bovendien kan het ook nodig zijn om de celdichtheid te optimaliseren als er wijzigingen in de celbronnen worden aangebracht om een optimale levensvatbaarheid te garanderen en overbevolking van hydrogel te voorkomen. Voor alle wijzigingen en probleemoplossing met betrekking tot de bioprinterfunctie raden de auteurs aan contact op te nemen met fabrikanten en te verwijzen naar de protocollen van de fabrikant.

Het CZS bevat een breed scala aan neuronale subtypes en gliacellen, die allemaal in verschillende hersenniches bestaan en specifieke rollen hebben die bijdragen aan de neurale functie28. Binnen de context van deze brede reikwijdte vertegenwoordigt dit model alleen de twee meest voorkomende celtypen (astrocyten en excitatoire glutamaterge neuronen). Belangrijke celtypen zoals microglia, oligodendrocyten en bloed-hersenbarrièrevormende endotheelcellen worden uit dit systeem weggelaten. De opname van microglia zou van belang kunnen zijn bij de focus op neuro-immuuninteracties, en oligodendrocyten zouden van belang kunnen zijn bij ziekten die centrale myelinisatie beïnvloeden. Naast hun rol in de pathologie scheiden cellen zoals bloed-hersenbarrièrevormende endotheelcellen geneesmiddelmetaboliserende enzymen uit, wat het gebruik van dit model voor farmacokinetische assays zou kunnen beïnvloeden29. Een verdere beperking van het model kan de verhouding tussen astrocyten en neuronen zijn; De verhouding tussen astrocyten en neuronen varieert sterk tussen hersengebieden, met voorgestelde waarden tussen 1:1 en 1:330,31. Dit model heeft een geschatte verhouding van 1:1,5 astrocyten tot neuronen; Dit model is dus mogelijk niet relevant voor het modelleren van hersengebieden waar astrocyten overvloediger voorkomen, zoals in gebieden met wittestof30.

Andere protocollen om 3D-biogeprinte cocultuurmodellen te ontwikkelen, zijn de afgelopen jaren gepubliceerd. Een publicatie van Sullivan et al., 2021, presenteerde een 3D-biogeprint neuraal model met behulp van iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen, dat een hoge levensvatbaarheid na het printen en verbetering van de neuronale functie aantoont in vergelijking met 2D-culturen32. In dit protocol werden neurale voorlopercellen echter gebruikt als celbron en werden ze gedurende 4 weken in kweek gehouden. In dit protocol werden in de handel verkrijgbare iPSC-afgeleide glutamaterge neuronen en astrocyten gebruikt. Hierdoor kan in slechts 7 dagen een 3D-netwerk van co-gekweekte cellen worden opgezet; Zoals aangetoond door de analyse van de neurietgroei, begint de uitgroei van neurieten binnen 24 uur en gaat deze lineair door gedurende de periode van 156 uur waarin de celgroei werd gevolgd. De snelle oprichting van deze netwerken kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan het gebruik van glutamaterge neuronen die gebruik maken van geoptimaliseerde doxycycline-induceerbare genexpressie van NGN2, die expressie van volwassen neuronale subtypemarkers binnen 7 dagen vertoont, zelfs in 2D-cultuur33. Het verkorten van deze groeiperiode met behulp van deze techniek is belangrijk voor het implementeren van modellen binnen de biofarmaceutische industrie, aangezien de ontwikkeling van tests een snelle doorlooptijd en ontwikkeling van celmodellenvereist15.

Concluderend toont dit model potentieel voor een 3D-model van neuronen en astrocyten, dat snel en gemakkelijk kan worden opgesteld voor screeningsdoeleinden. Toekomstige toepassingen voor dit modeltype zouden kunnen zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen voor verschillende CZS-ziekten, met de mogelijkheid om uit te breiden naar verschillende ziekten met behulp van iPSC-lijnen voor patiënten of gen-bewerkte ziekten. Bovendien zorgt het gebruik van doxycycline-induceerbare NGN2-expressie iPSC-afgeleide glutamaterge neuronen ervoor dat cellen in minder tijd volwassen kunnen worden, wat kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van modellen van het ouder wordende brein voor neurodegeneratieonderzoek. Dit systeem kan ook worden uitgebreid door het gebruik van extra celtypen in cocultuur, waaronder microglia en oligodendrocyten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CW, NC en JB zijn werknemers van Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, Londen, VK. YH is een werknemer van Merck Sharp & Dohme LLC, een dochteronderneming van Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

Figuur één is gemaakt met behulp van Biorender.com.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Alex Volkerling, Martin Engel en Rachel Bleach bedanken voor hun hulp bij het ontwikkelen van het protocol en de feedback op het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolThermofisher31350010
384-well platePerkinElmer6057300
96-well platePerkinElmer6055300
Activator fluid F299Inventia Life ScienceN/A
Activator fluid F3Inventia Life ScienceN/A
B27 (50x) minus Vit AThermofisher12587010
Bioink fluid F261Inventia Life ScienceN/A
Bioink fluid F32Inventia Life ScienceN/A
Doxycycline hyclateSigma AldrichD5207
GlutaMAX (100x)Thermofisher35050061
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647Abcamab150115
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488Abcamab150077
HoechstAbcamab228551
Human BDNF Recombinant ProteinThermofisherPHC7074
Human NT3 Recombinant ProteinThermofisherPHC7036
iCell AstrocytesFujifilm CDI1434
INCell Analyser 6500HSMolecular DevicesN/Ahigh content imaging system
Incucyte S3Sartorius N/A
ioGlutamatergic Neurons (Large vial)Bit.bioe001
Laminin (1 mg/mL)Sigma AldrichL2020
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)InvitrogenL3224
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugatedR&D systemsSC024
Neurobasal mediaThermofisher21103049
Normal Donkey SerumAbcamab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342)ThermofisherR37605
Opti-MEMThermofisher11058021
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
PEI 50% in H2OSigma Aldrich181978
Pierce Borate Buffer 20xThermofisher28341
PrismGraphPadData analysis software
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2)Abcamab206293
RASTRUM(TM) BioprinterInventia Life ScienceN/ABioprinter
RASTRUM(TM) Bioprinter CartridgesInventia Life ScienceN/ABioprinter Cartridges
RASTRUM(TM) Targeting plateInventia Life ScienceN/ATargeting plate
Rho kinase (ROCK) inhibitorAbcamab120129
Sheep anti-GFAP NL493 conjugatedR&D systemsSC024
Signals Image Artist PerkinElmer N/AImage analysis platform
Triton X-100ThermofisherHFH10
Zeiss Axio ObserverZeissN/AInverted microscope platform 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
  2. Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1(2020).
  3. Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
  4. Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22(2021).
  5. Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
  6. Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
  7. Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
  8. Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
  9. Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159(2019).
  10. Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760(2022).
  11. Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242(2019).
  12. Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
  13. Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165(2018).
  14. Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
  15. Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876(2021).
  16. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
  18. Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
  19. Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328(2020).
  20. de Souza, N. Organoid variability examined. Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).
  21. Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
  22. Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960(2021).
  23. Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
  24. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799(2022).
  25. Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
  26. Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
  27. Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
  28. Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
  29. Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
  30. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
  33. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. The Authors section was updated from:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD R&D Innovation Centre Ltd
2Merck & Co., Inc.

to:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD Research Laboratories, London, UK
2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Trefwoorden

3D bioprintenneuronen astrocyten cocultuurhumane iPSC neuronenhydrogelmatrixextracellulaire matrixeiwittenneurale celmarkershigh throughputscreeningneurietuitgroeianalyseimmunokleuringstechniekenmodellen voor geneesmiddelenontwikkeling

Gerelateerde artikelen