Dit protocol beschrijft het model van voorbijgaande focale cerebrale ischemie bij muizen door intraluminale occlusie van de middelste hersenslagader. Daarnaast worden voorbeelden van uitkomstbeoordeling getoond met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming en gedragstests.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbijgaand occlusiemodel van de middelste cerebrale slagader van een beroerte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Beroerte is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak of chronische invaliditeit. Desalniettemin zijn de bestaande optimale behandelingen beperkt tot reperfusietherapieën tijdens de acute fase van ischemische beroerte. Om inzicht te krijgen in de fysiopathologie van beroertes en innovatieve therapeutische benaderingen te ontwikkelen, spelen in vivo knaagdiermodellen van beroerte een fundamentele rol. De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde dieren heeft met name het gebruik van muizen als experimentele beroertemodellen gestimuleerd.
Bij patiënten met een beroerte komt occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) vaak voor. Bijgevolg omvat het meest voorkomende experimentele model intraluminale occlusie van de MCA, een minimaal invasieve techniek die geen craniectomie vereist. Deze procedure omvat het inbrengen van een monofilament door de externe halsslagader (ECA) en het door de interne halsslagader (ICA) naar voren brengen totdat het het vertakkingspunt van de MCA bereikt. Na een arteriële occlusie van 45 minuten wordt het monofilament verwijderd om reperfusie mogelijk te maken. Gedurende het hele proces wordt de cerebrale bloedstroom gecontroleerd om de vermindering tijdens occlusie en het daaropvolgende herstel na reperfusie te bevestigen. Neurologische en weefselresultaten worden geëvalueerd met behulp van gedragstests en MRI-onderzoeken (magnetic resonance imaging).
Inleiding
Beroerte is een verwoestende ziekte die volgens de WHO jaarlijks wereldwijd ongeveer 15 miljoen mensen treft. Ongeveer een derde van de patiënten bezwijkt aan de aandoening, terwijl nog eens een derde blijvende invaliditeit ervaart. Beroerte is een complexe pathologie waarbij verschillende celtypen betrokken zijn, zoals neurale en perifere immuuncellen, vasculatuur en systemischereacties1. Het ingewikkelde netwerk van reacties die worden veroorzaakt door een beroerte op systeemniveau kan momenteel niet worden gerepliceerd met behulp van in-vitromodellen . Proefdiermodellen zijn dus essentieel om de mechanismen van de ziekte te onderzoeken en nieuwe therapieën te ontwikkelen en te testen. Momenteel is vroege weefselreperfusie de enige goedgekeurde interventie, hetzij door trombolyse met weefseltype plasminogeenactivator (tPA) of endovasculaire trombectomie1.
Occlusies van de middelste hersenslagader (MCA) komen vaak voor bij patiënten met een beroerte. Bijgevolg werden knaagdiermodellen van voorbijgaande MCA-occlusie (tMCAo) aanvankelijk ontwikkeld bij ratten 2,3,4. Tegenwoordig zijn genetisch gemodificeerde muizen de meest gebruikte dieren in experimentele beroertemodellen. In deze studie beschrijven we een minimaal invasief model van intraluminale tMCAo bij muizen. De aanpak wordt uitgevoerd via de halsslagader ter hoogte van de nek, zonder craniectomie.
De duur van de occlusieperiode is een kritische factor die de omvang van de ischemische laesie bepaalt. Zelfs korte occlusies van 10 minuten kunnen selectieve neuronale dood veroorzaken zonder een duidelijk infarct, terwijl langere occlusies, die meestal 30 tot 60 minuten duren, resulteren in een zekere mate van herseninfarct. In tegenstelling tot de proximale en distale takken van de MCA die de cortex voeden en collateralen hebben, missen de lenticulo-striatale slagaders die bloed naar het striatum leveren collateralen5. Als gevolg hiervan is er een grotere vermindering van de bloedstroom in het striatum dan in de cortex na tMCAo. Occlusies van 30 minuten of minder hebben dus over het algemeen invloed op het striatum, maar niet op de cortex, terwijl langere occlusies, vanaf 45 minuten, vaak een ischemische laesie veroorzaken in het hele MCA-gebied, inclusief het striatum en de dorsolaterale cortex.
Om het welzijn van de muizen te garanderen, dienen we voorafgaand aan de ingreep pijnstillers toe en gebruiken we anesthesie tijdens de operatie. Desalniettemin kan anesthesie mogelijk kunstmatige veranderingen in de fysiologie van de muis introduceren en sommige uitkomstmaten beïnvloeden6. De chirurgische ingreep, uitgevoerd door ervaren personeel, duurt meestal ongeveer 15 minuten voor het induceren van MCAo. Vervolgens is de totale tijd onder narcose afhankelijk van de occlusieperiode. Voor experimenten waarbij het minimaliseren van anesthesie cruciaal is, is een alternatieve stap in de procedure het stopzetten van de anesthesie tijdens de occlusieperiode en het beperken tot alleen de chirurgische stappen voor het inbrengen en terugtrekken van het filament dat de MCA afsluit. Deze benadering verkort de duur van de anesthesie en minimaliseert de potentiële artefactische effecten op het experimentele model 7,8. Daarom wordt de methode voor het induceren van voorbijgaande focale ischemie gepresenteerd door intraluminale occlusie van de MCA met twee varianten: met de muis verdoofd tijdens de gehele occlusieperiode of met de muis wakker tijdens deze periode. In beide gevallen moet een schijnoperatie worden uitgevoerd parallel aan de ingreep die wordt uitgevoerd op de ischemische muizen. Bovendien worden gegevens over de uitkomstbeoordeling verstrekt, zoals gemeten door gedragstests en MRI op verschillende tijdstippen na reperfusie. Ten slotte worden de belangrijkste factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij de uitvoering van de experimentele procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het dierenwerk werd uitgevoerd volgens de Catalaanse en Spaanse wetten (Real Decreto 53/2013) en de Europese richtlijnen, met goedkeuring van de ethische commissie (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) van de Universiteit van Barcelona en de lokale regelgevende instanties van de Generalitat de Catalunya. Studies worden gerapporteerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen. Deze procedure is ontworpen om te worden uitgevoerd bij volwassen muizen, vanaf de leeftijd van 8 weken, zonder leeftijdsgrens. Voorbeelden van de chirurgische ingreep die is ontwikkeld bij C57BL/6-muizen van 10-12 weken oud worden hier gegeven. Er moet rekening worden gehouden met anatomische verschillen, afhankelijk van de belasting van de muis.
1. Voorbereiding van dieren
- Voordat u met de chirurgische ingreep begint, verzamelt en steriliseert u alle benodigde materialen en gereedschappen. Richt de operatietafel in met alle benodigde chirurgische materialen (vermeld in de Materiaaltabel).
- Verdoof het dier met inhalatie van isofluraan in een mengsel van zuurstof en lachgas (30%/70%).
- Dien buprenorfine (zie materiaaltabel) subcutaan toe in een dosering van 0,05 mg/kg lichaamsgewicht om analgesie te bieden en pijn en ongemak te verlichten.
LET OP: Analgesie is verplicht, maar er worden verschillende protocollen geaccepteerd. Pijn- en ongemaksverschijnselen moeten ook onder controle worden gehouden tijdens de eerste dagen na MCAo (zie stap 4). Pas indien nodig corrigerende oplossingen toe. - Plaats het dier in een anesthesie-inductiebox (zie Materiaaltabel) met 5% isofluraan totdat het een toestand van diepe anesthesie bereikt (verlies van reflex bij pootpunctie en oogreflex).
- Plaats de muis op de operatietafel en verlaag het niveau van isofluraan tot 1,5%, toegediend door het gezichtsmasker. Breng dierenartszalf aan om droge ogen tijdens de procedure te voorkomen.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 ± 0,5 °C, gecontroleerd door een rectale sonde die is aangesloten op een verwarmingskussen (zie Materiaaltabel).
- Scheer het ventrale deel van de nek en het hoofd (calvaria) met een elektrisch scheerapparaat. Verwijder voorzichtig vachtresten en desinfecteer de huidgebieden drie keer in cirkelvormige bewegingen met een ontsmettingsmiddel op basis van jodium en 70% alcohol.
.
2. Beoordeling van de cerebrale bloedstroom (CBF) met laser Doppler-flowmetrie (LDF)
- Maak met een schaar een incisie op de huid van het hoofd, in de richting van de sagittale hechting, van de oren naar het gebied tussen de ogen.
- Trek de huid terug en verwijder het periosteum aan de rechterkant van de schedel.
- Zoek de coördinaten (2,5 mm lateraal van Bregma) en bevestig de Dopplerhouder (zie Materiaaltabel) met cyanoacrylaat. Nadat de lijm is opgedroogd, sluit u de Doppler-sonde aan en controleert u op de juiste signaaluitlezing.
3. Voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader (tMCAo)
- Draai de muis om naar de rugligging en bevestig hem met medische tape op de operatietafel.
- Maak een incisie in de middellijn in de nek. Trek de huid en de speekselklieren zijdelings terug met behulp van retractors (zie Materiaaltabel) om het halsslagadergebied bloot te leggen.
- Identificeer de vasculaire anatomie van de gemeenschappelijke halsslagader (CCA), de ICA en de ECA, evenals de verschillende slagaders die daarvan zijn afgeleid (maxillair en linguaal, superieure schildklier, occipitale en pterygopalatine) (Figuur 1A).
- Maak de hoofdslagaders los van het aangrenzende bindweefsel zodat ze kunnen worden gehanteerd.
OPMERKING: Let er vooral op dat u de zenuwen niet beschadigt, vooral de nervus vagus, die parallel loopt aan de CCA. - Wikkel een 6-0 zijden hechtdraad (zie Materiaaltabel) rond de ECA bij de maxillaire/linguale bifurcatie. Zet een knoop stevig vast om de bloedsomloop permanent te onderbreken.
- Haal een tweede hechting rond dezelfde slagader, tussen de eerste knoop en de CCA-bifurcatie, en houd deze knoop los.
- Plaats een derde draad rond de CCA en leg een schuifknoop die gemakkelijk kan worden losgemaakt.
OPMERKING: Dit kan ook worden uitgevoerd met een vasculaire clip, maar de draad laat meer beweging en flexibiliteit toe. In dit stadium is het mogelijk om een eerste afname van CBF in het LDF-signaal waar te nemen. - Plaats een vasculaire clip (zie Materiaaltabel) die de bloedcirculatie vanuit de ICA onderbreekt.
- Maak een kleine incisie in de ECA, dicht bij het gebied waar de strakke knoop zich bevindt.
- Plaats het monofilament totdat de dikke coating volledig in het arteriële lumen is gekomen.
- Draai de tweede knoop vast om het monofilament in de slagader te houden en te voorkomen dat de druk die door het bloed wordt uitgeoefend het naar buiten duwt (Figuur 1B).
- Verwijder de vasculaire clip van de ICA.
- Knip de ECA onder de eerste knoop door en draai de stronk om deze in de richting van de ICA te oriënteren (Figuur 1C).
- Beweeg het monofilament via de ICA naar het punt waar de MCA zich vertakt.
OPMERKING: De occlusie wordt weerspiegeld in een abrupte daling van de bloedstroom in de LDF-uitlezing. We beschouwen een succesvolle occlusie wanneer de daling van CBF groter is dan 70% ten opzichte van de basale waarde. Als CBF-meetsystemen niet beschikbaar zijn, kan het punt van occlusie worden opgemerkt door de weerstand tegen vooruitgang, die bij volwassen muizen meestal ongeveer 11 mm verwijderd is van de bifurcatie van de CCA.- Als de anesthesie wordt voortgezet tijdens de occlusieperiode, houd de muis dan in de gaten en houd deze gedurende 45 minuten constant in de gaten.
- Als de muis tijdens de occlusieperiode wakker wordt, hecht dan de huid van de nek met verschillende hechtingen. Zonder de LDF-sonde los te koppelen, plaatst u de muis in de temperatuurgecontroleerde doos, zodat u kunt herstellen van de anesthesie.
OPMERKING: Het is gebruikelijk dat de muis tijdens deze periode spontaan cirkelgedrag vertoont, wat wijst op succesvolle occlusie. - Verdoof de muis na 40 minuten opnieuw volgens dezelfde anesthesie- en desinfectieprocedures als aangegeven in de punten 1.4, 1.5 en 1.7. Plaats het terug op de operatietafel en verwijder de hechtingen uit de nek.
- Maak na 45 minuten occlusie de knoop los die het monofilament op zijn plaats houdt. Trek langzaam en voorzichtig aan het filament en controleer of er weefselrekanalisatie plaatsvindt.
- Trek het filament eruit en trek de knoop aan om bloedverlies te voorkomen.
- Maak de CCA-knoop los. Zorg ervoor dat er geen schade aan de slagaderwand is.
- Verwijder de retractors en herpositioneer de spieren, klieren en huid. Hecht de huid (6-0) en breng een ontsmettingsmiddel aan.
- Koppel de Doppler-sonde los en maak de houder los. Hecht en desinfecteer de huid van het hoofd.
- Laat de muis tijdens de herstelperiode van anesthesie in een kooi met verwarming om de temperatuur op peil te houden. Houd het constant in de gaten totdat het volledig is hersteld van de anesthesie. Na herstel kan de muis weer terug in zijn kooi.
LET OP: Huisvesting met sociale verrijking wordt sterk aanbevolen. Meng geopereerde muizen echter nooit met niet-geopereerde muizen in dezelfde kooi zonder enige fysieke scheiding om agressie te voorkomen.
4. Postoperatieve zorg
- Houd periodiek toezicht op de dieren volgens de procedures en voorschriften die zijn vastgesteld volgens de lokale voorschriften. Zorg voor een pijnstillende behandeling volgens het juiste schema om de pijn na de operatie te minimaliseren.
OPMERKING: In de huidige studie werd dezelfde pijnstiller toegepast als aan het begin van de ingreep (buprenorfine 0,05 mg/kg lichaamsgewicht) 6 uur en 24 uur na de operatie. - Euthanasie uitvoeren wanneer de toezichtparameters dit aangeven, volgens de institutioneel goedgekeurde protocollen.
- Dagelijks het gewicht van de dieren monitoren. Geef de dieren de eerste dagen na de operatie zacht voer. Hydrateer ze bovendien door subcutane injectie van zoutoplossing (200 μL) onmiddellijk na de operatie en periodiek daarna als wordt waargenomen dat de muis niet vanzelf hydrateert. Schik voedsel en water op een manier die gemakkelijk toegankelijk is voor het dier.
- Zodra het in vivo onderzoek is voltooid, verdooft u de muizen, euthanaseert u ze en verwijdert u het hersenweefsel voor verdere histopathologische analyse (indien nodig).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Er zijn verschillende benaderingen om de uitkomst van de tMCAo-procedure te evalueren. Hierbij wordt gebruik gemaakt van in-vivo-neuroimaging-methoden (MRI) en gedragstesten.
Muizen ontwikkelen ischemische laesies in de hersenen, die voornamelijk het gebied beïnvloeden dat door de MCA ipsilateraal aan de occlusie wordt geleverd, zoals het striatum en de dorsolaterale cortex. Er bestaan verschillende methoden om de omvang van de laesie te bepalen, waaronder 2,3,5-trifenyltetrazoliumchl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De intraluminale tMCAo-procedure is het meest gebruikte model van focale hersenischemie met reperfusie in fundamenteel onderzoek. Momenteel zijn muizen het geprefereerde diermodel vanwege de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen. Het is echter essentieel om te erkennen dat genetisch gemodificeerde muizen en hun genetische achtergrond van invloed kunnen zijn op de vascularisatie van de hersenen. De aanwezigheid van collaterale circulatie en anastomosen tussen verschillende arteriële gebieden kan de uitkomst...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Studie ondersteund door subsidie PID2020-113202RB-I00 gefinancierd door Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 en "Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO). Een manier om Europa te maken". NCC en MAR hadden predoctorale beurzen (respectievelijk PRE2021-099481 en PRE2018-085737) gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033 en door "Europees Sociaal Fonds (ESF) Investeren in je toekomst". Wij danken Francisca Ruiz-Jaén en Leonardo Márquez-Kisinousky voor hun technische ondersteuning. We erkennen de steun van de MRI-beeldvormingsfaciliteit van het Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Het Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) programma van de Generalitat de Catalunya ondersteunt IDIBAPS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6/0 suture | Arago | Vasculaire ligaturen | |
| 6/0 suture met gebogen naald | Arago | Hudnaden | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | Voor hydratatie |
| Anesthesiesysteem | SurgiVet | ||
| Blunt retractoren, 1 mm breed | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | Voor pijnverlichting | |
| Klemtoepastang | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini pincet | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Pincet | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Lijm | Loctite | Om LDF-sonde aan schedel te plakken | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isofluraan | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Sondehouders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medische tape | |||
| MRI-magneet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Duitsland | BioSpec 70/30 horizontale dierenscanner | |
| Naaldhouder met naaldsnijder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Herstelkooi met verwarmingskussens | |||
| Chirurgische schaar | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Klein vaatcauterisatieset | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscoop en koellicht | Leica | M60 | |
| Naaldvlechttang | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostaat, rectale sonde en muismat | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas veerscharen (4mm snijkant) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vasculaire klemmen | Fine Science Tools | 00396-01 |
Referenties
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1(2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176(2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175(2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80(2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
