Dit protocol demonstreert een betrouwbare en effectieve techniek om primaire fibroblasten te isoleren uit premenopauzaal of postmenopauzaal menselijk vaginaal weefsel. Bestaande protocollen voor vaginale fibroblastisolatie houden geen rekening met de uitdagingen van celisolatie uit senescent weefsel. Vaginaal weefsel werd verkregen van vrouwen na een operatie voor bekkenorgaanverzakking.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Weefselverwerking en isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verzakking van het bekkenorgaan is een aandoening die ernstige gevolgen heeft voor de kwaliteit van leven van vrouwen. Het treedt op wanneer spieren en ligamenten verzwakken en ervoor zorgen dat bekkenorganen lager in het bekken vallen, waardoor een uitstulping in de vagina ontstaat. Chirurgie om verzakking van het bekkenorgaan te corrigeren is een steunpilaar van de behandeling geweest. De laatste tijd is er een groeiende belangstelling voor het bestuderen van de weefselsamenstelling van patiënten met verzakking op cellulair niveau.
Er is momenteel weinig consensus over het effect van de leeftijd van de donor of patiënt op celgebaseerde therapieën. De huidige gepubliceerde protocollen voor vaginale fibroblastisolatie concentreren zich ofwel op premenopauzaal weefsel of verwaarlozen commentaar op de leeftijd van donorweefsel. De meeste bestaande protocollen maken gebruik van diermodellen. De consistentie van menselijk vaginaal weefsel is dichter dan de weefsels die in de meeste protocollen worden gebruikt. In deze studie werd menselijk vaginaal weefsel voornamelijk verkregen van oudere donoren, wat waarschijnlijk heeft bijgedragen aan het falen van bestaande protocollen.
Het doel van deze studie is het beschrijven van een standaardprotocol voor het betrouwbaar verkrijgen van menselijke vaginale fibroblasten, ongeacht de leeftijd van de donor en de menopauze. De resultaten werden gereproduceerd met behulp van weefsel van negen afzonderlijke donoren die een operatie aan een bekkenorgaanverzakking ondergingen. Zes patiënten waren postmenopauzaal, waarvan de oudste donor 78 jaar oud was. De mediane leeftijd van de weefseldonoren was 59 jaar.
Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het genereren van een met fibroblasten verrijkte eencellige suspensie met behulp van een combinatie van enzymatische en mechanische dissociatie en celsuspensiepooling van meerdere vaginale biopsieën van een enkele donor. Betrouwbare isolatie van menselijke vaginale primaire fibroblasten kan nuttig zijn bij de studie van bekkenorgaanverzakking en microbioom-gastheerinteracties.
Inleiding
Genderongelijkheid in wetenschap en onderzoek is een voortdurend probleem. Onderzoek naar aandoeningen die vooral mensen van vrouwelijk geslacht treffen, wordt ondergefinancierd1. Bekkenorgaanverzakking is een aandoening die sterk geassocieerd is met het vrouwelijk geslacht. Het treedt op wanneer spieren en ligamenten verzwakken en ervoor zorgen dat bekkenorganen lager in het bekken vallen, waardoor een uitstulping in de vagina ontstaat2. Er is weinig bekend over cellulaire interacties in de context van deze pathofysiologie, noch over hoe factoren op weefselniveau het succes van chirurgische ingrepen beïnvloeden.
Primaire cellen in plaats van cellijnen worden algemeen erkend als essentieel voor translationeel klinisch onderzoek om meer fysiologische relevantie te bieden4. Primaire cellen worden rechtstreeks uit het lichaamsweefsel van belang gehaald en kunnen de in vivo fysiologie nauwkeuriger nabootsen. Isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina kan nuttig zijn voor het bestuderen van biologische mechanismen van bekkenorgaanverzakking en ziektemodellering, rekening houdend met belangrijke donorkenmerken, zoals leeftijd en menopauzale status.
Verzakking van het bekkenorgaan treft vaak oudere of postmenopauzale personen. De isolatie en proliferatie van primaire fibroblastcellen bij het bestuderen van deze aandoening zijn een uitdaging vanwege verminderde celpopulaties en het klonogene vermogen van oudere donoren5. In onze ervaring slaagde het gebruik van eerder beschreven protocollen voor de dissociatie van vaginaal weefsel er niet in om fibroblasten te extraheren uit een standaard weefselbiopsie van 1cm2 .
Via een literatuuronderzoek ontdekten we dat vergelijkbare studies waren onderverdeeld in twee groepen: diermodellen, zoals muizen6, en menselijke modellen 7,8. Bij het volgen van het muisprotocol leverde het gebruik van een schaar voor weefselverwerking van menselijk vaginaal weefsel onvoldoende mechanische vertering op. Extrapolatie van protocollen met behulp van muizenweefsel en andere weefselplaatsen9 was niet succesvol.
De meeste artikelen die menselijke vaginale monsters gebruikten, gebruikten weefsel van premenopauzale personen met bekkenorgaanverzakking 7,10. Hoewel een paar artikelen het gebruik van monsters van zowel premenopauzale als postmenopauzale personenrapporteerden11, beschreven ze niet voldoende in detail het protocol dat werd gebruikt om fibroblasten van oudere of postmenopauzale donoren met succes te isoleren. Isolatie en ziektemodellering met behulp van fibroblasten uit postmenopauzaal weefsel kunnen essentieel zijn voor het begrijpen van de cellulaire pathofysiologie van verzakking van het bekkenorgaan, aangezien deze aandoening de hoogste prevalentie heeft bij individuen in het decennium na de menopauze12.
We beschrijven een methode voor het isoleren en kweken van een met fibroblasten verrijkte eencellige suspensie uit menselijk vaginaal weefsel met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar protocol voor het verkrijgen van postmenopauzale of verouderende menselijke vaginale fibroblasten. Van geïsoleerde cellen werd bevestigd dat ze fibroblasten waren door middel van morfologisch onderzoek met behulp van fasecontrastmicroscopie en immunofluorescentie (IF) om de expressie van vimentine, F-actine en α-gladde spieractine (α-SMA) te beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Vaginaal weefsel werd verkregen van vrouwen die een operatie voor bekkenorgaanverzakking ondergingen. Het vaginale weefsel dat na de operatie werd verzameld, werd beschouwd als afvalmateriaal en zou anders worden weggegooid. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Massachusetts General Brigham.
1. Vaginale weefseloogst van de patiënt
- Diagnose bekkenorgaanverzakking door een anamnese af te nemen en de bevindingen van het bekkenonderzoek te gebruiken: Kwantificering van bekkenorgaanverzakking (POP-Q) metingen werden in de kliniek verkregen, die bewijs van bekkenorgaanverzakking aantoonden.
- Gebruik de volgende inclusiecriteria: ouder dan 18 jaar; Geschiedenis van symptomatische verzakking van het bekkenorgaan; Kiezen voor chirurgische correctie van bekkenorgaanverzakking.
- Sluit het volgende uit: Zwangere vrouwen en patiënten die weigeren weefsel te doneren.
- Snijd het overtollige vaginale weefsel bij als een noodzakelijke stap van een operatie voor bekkenorgaanverzakking. Dit vaginale epitheel wordt in totale dikte weggesneden na de volgende operaties: anterieure colporrhaphy, posterieure colporrhaphy en colpocleisis.
- Transporteer weefsel naar het laboratorium in een steriele monsterafnamebeker met normale zoutoplossing of serumvrije DMEM/F12 (Gibco) media. Blijf op het ijs.
2. Weefselverwerking en -vertering
- Voorbereiding van weefsels
- Meet en snijd het weefsel zodat het de volledige dikte van het vaginale epitheel omvat, zodat er segmenten van ongeveer 1 cm2 ontstaan.
- Zorg voor een nauwkeurige meting van de biopsiegrootte 1 cm2.
OPMERKING: Het overschatten van de grootte van de weefselbiopsie kan de weefselvertering belemmeren. - Bereid 2-3 extra vaginale biopsieën van elk 1cm2 voor van een enkele donor en leg de biopsieën opzij.
- Mechanische vergisting
- Plaats de vaginale biopsie in een petrischaaltje van 10 cm celcultuur. Pipeteer 500-1.000 μL serumvrije media aangevuld met 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine Bonto het vaginale weefsel om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt.
- Hak het vaginale weefsel in kleine fragmenten met behulp van twee steriele scalpels (nr. 11 of nr. 15) in beide handen.
- Zorg ervoor dat de punten van de messen loodrecht op het oppervlak van het weefsel staan. Oefen gelijkmatige en gelijkmatige druk uit op het weefseloppervlak met behulp van twee scalpels. Voer een afwisselende trekkende actie uit om het weefsel in zeer kleine stukjes te snijden.
- Herhaal deze haktechniek met behulp van de techniek met twee scalpels totdat het monster een uniforme consistentie heeft met stukjes van 1-2 mm.
OPMERKING: Mechanische vertering met behulp van deze techniek met twee scalpels van een biopsie van 1 cm2 duurt ongeveer 15-20 minuten om te voltooien. - Voeg 2-3 ml serumvrije DMEM/F12-media aangevuld met 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine B toe aan de plaat en suspendeer het gehakte weefsel. Pipeteer de oplossing met weefselfragmenten op en neer om eventuele klonten te breken.
- Enzymatische vertering
- Breng de oplossing met weefselfragmenten over in een conische buis van 15 ml. Voeg serumvrije DMEM/F12-media toe aan de weefselkweekschaal waar vaginaal weefsel werd fijngehakt om eventuele resterende weefselfragmenten te verzamelen. Breng de oplossing met weefselfragmenten over in de conische buis. Voeg extra serumvrije DMEM/F12-media toe tot het totale volume 10 ml is.
- Los 5 mg Liberase op in 1 ml steriel water (5 mg/ml). Bewaren in aliquots van 230 μl bij -20 °C gedurende maximaal een maand of -80 °C gedurende 6 maanden.
- Voeg 230 μL Liberase (voorraad 13 E/ml) toe aan de tube, met een eindconcentratie van 0,3 E/ml.
OPMERKING: Liberase-activiteit kan variëren tussen batches. Ontdooi elke aliquot onmiddellijk voor gebruik met behulp van een waterbad. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien. - Herhaal stap 2.1-2.3 voor 2-3 extra vaginale biopsieën van dezelfde donor.
OPMERKING: Bewaar elke oplossing die weefselfragmenten van een enkele biopsie bevat in afzonderlijke conische buisjes. Bijvoorbeeld 4 vaginale biopsieën in 4 buisjes. Dit is belangrijk voor een optimale celpelletering na het centrifugeren. - Incubeer de buisjes gedurende 3 uur bij 37 °C met constante, krachtige beweging met behulp van een monstermenger.
- Plaats een monstermenger in een CO2 -incubator. Zorg voor constante agitatie. (Voorbeeldinstellingen van de mixer: 25 tpm rotatiebeweging gedurende 5 s, 30° wederzijdse (kantelende rotatie) gedurende 5 s en 2° trilbeweging (vortexen) gedurende 3 s).
- Tijdens de incubatie, wervel de buizen met tussenpozen van 30 minuten.
- Centrifugeer de monsters bij 3.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en gooi deze weg.
- Resuspendeer de pellet in 1-2 ml DMEM/F12-media met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine B om het Libree-enzym te verdunnen. Pipetteer krachtig totdat de pellet volledig is geresuspendeerd.
3. Celcultuur
- Verwijdering van niet-verteerde weefselfragmenten
- Plaats een celzeef van 100 μm op een steriele conische container van 50 ml.
- Bundel de celsuspensie van de meerdere weefselbiopten van dezelfde donor samen.
- Zeef de weefsel-/enzymsuspensie en druk deze aan met een spuitzuiger van 5 ml. Herhaal deze stap totdat de resterende weefselfragmenten volledig lijken te zijn doorgedrukt.
OPMERKING: Er kan wat slijm uit de vaginaweefselfragmenten komen dat niet volledig door de zeef is gewerkt. Gooi het slijm weg met de celzeef.
- Bundeling van celculturen
- Plaat gepoolde celsuspensie van meerdere vaginale biopsieën (van dezelfde donor) op een petrischaaltje (60 mm x 15 mm).
- Incubeer de petrischaal een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C.
- Observeer en bevestig de aanwezigheid van niet-hechtende cellen met een fasecontrastmicroscoop.
- Zorg ervoor dat de focus van de microscoop op de onderkant van de plaat ligt.
OPMERKING: Er kunnen veel immuuncellen op de voorgrond staan. Een kleiner aantal fibroblasten zal aan de onderkant van de plaat worden bevestigd. - Wacht 18-24 uur voordat u de celkweekmedia vervangt, om voldoende celhechting te garanderen.
- Verander het kweekmedium elke drie dagen totdat 80% samenvloeiing optreedt. Wanneer cellen 80-90% samenvloeiing bereiken, breid dan uit naar een grotere kolf of vries aliquots van cellen in voor toekomstig gebruik.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vaginaal weefsel werd verzameld van 10 onafhankelijke donoren die een bekkenorgaanverzakkingsoperatie ondergingen. Met behulp van het beschreven protocol werden cellen geïsoleerd uit menselijk vaginaal weefsel. Celpopulaties hadden een karakteristiek langwerpig, plat en spoelvormig uiterlijk. Net als andere studies zagen we significant langzamere celverdubbelingscapaciteiten en een verminderd klonogene vermogen van fibroblasten bij toenemende leeftijd van de donor. Deze verschillen werde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Veel eerdere studies hebben gerapporteerd hoe primaire fibroblasten uit de menselijke vagina kunnen worden geïsoleerd 3,7. In verschillende onderzoeken werd menselijk vaginaal weefsel gebruikt van premenopauzale personen met een verzakking van het bekkenorgaan. Hoewel een paar artikelen het gebruik van weefsel van premenopauzale en postmenopauzale personen rapporteerden 7,11
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen onze dank uitspreken aan alle leden van het Vincent Center of Reproductive Biology in het Massachusetts General Hospital, evenals de VIncent Memorial Hospital Foundation, voor hun genereuze steun. Speciale dank aan Dr. Bo Rueda en zijn lab voor hun waardevolle suggesties en voor het uitlenen van laboratoriumapparatuur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Bio Techne | B23192 | |
| Cell strainer (100 μm) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Feather Disposable Scalpel No. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer Sample Mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Human Fibronectin DuoSet ELISA | R&D Systems | DY1918-05 | |
| Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicillin/Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Petri dishes, polystyrene (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| Serologic pipettes (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Sterile syringes (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Referenties
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
