Weefselverwerking en isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina

Summary

Dit protocol demonstreert een betrouwbare en effectieve techniek om primaire fibroblasten te isoleren uit premenopauzaal of postmenopauzaal menselijk vaginaal weefsel. Bestaande protocollen voor vaginale fibroblastisolatie houden geen rekening met de uitdagingen van celisolatie uit senescent weefsel. Vaginaal weefsel werd verkregen van vrouwen na een operatie voor bekkenorgaanverzakking.

Abstract

Verzakking van het bekkenorgaan is een aandoening die ernstige gevolgen heeft voor de kwaliteit van leven van vrouwen. Het treedt op wanneer spieren en ligamenten verzwakken en ervoor zorgen dat bekkenorganen lager in het bekken vallen, waardoor een uitstulping in de vagina ontstaat. Chirurgie om verzakking van het bekkenorgaan te corrigeren is een steunpilaar van de behandeling geweest. De laatste tijd is er een groeiende belangstelling voor het bestuderen van de weefselsamenstelling van patiënten met verzakking op cellulair niveau.

Er is momenteel weinig consensus over het effect van de leeftijd van de donor of patiënt op celgebaseerde therapieën. De huidige gepubliceerde protocollen voor vaginale fibroblastisolatie concentreren zich ofwel op premenopauzaal weefsel of verwaarlozen commentaar op de leeftijd van donorweefsel. De meeste bestaande protocollen maken gebruik van diermodellen. De consistentie van menselijk vaginaal weefsel is dichter dan de weefsels die in de meeste protocollen worden gebruikt. In deze studie werd menselijk vaginaal weefsel voornamelijk verkregen van oudere donoren, wat waarschijnlijk heeft bijgedragen aan het falen van bestaande protocollen.

Het doel van deze studie is het beschrijven van een standaardprotocol voor het betrouwbaar verkrijgen van menselijke vaginale fibroblasten, ongeacht de leeftijd van de donor en de menopauze. De resultaten werden gereproduceerd met behulp van weefsel van negen afzonderlijke donoren die een operatie aan een bekkenorgaanverzakking ondergingen. Zes patiënten waren postmenopauzaal, waarvan de oudste donor 78 jaar oud was. De mediane leeftijd van de weefseldonoren was 59 jaar.

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het genereren van een met fibroblasten verrijkte eencellige suspensie met behulp van een combinatie van enzymatische en mechanische dissociatie en celsuspensiepooling van meerdere vaginale biopsieën van een enkele donor. Betrouwbare isolatie van menselijke vaginale primaire fibroblasten kan nuttig zijn bij de studie van bekkenorgaanverzakking en microbioom-gastheerinteracties.

Introduction

Genderongelijkheid in wetenschap en onderzoek is een voortdurend probleem. Onderzoek naar aandoeningen die vooral mensen van vrouwelijk geslacht treffen, wordt ondergefinancierd¹. Bekkenorgaanverzakking is een aandoening die sterk geassocieerd is met het vrouwelijk geslacht. Het treedt op wanneer spieren en ligamenten verzwakken en ervoor zorgen dat bekkenorganen lager in het bekken vallen, waardoor een uitstulping in de vagina ontstaat². Er is weinig bekend over cellulaire interacties in de context van deze pathofysiologie, noch over hoe factoren op weefselniveau het succes van chirurgische ingrepen beïnvloeden^.

Primaire cellen in plaats van cellijnen worden algemeen erkend als essentieel voor translationeel klinisch onderzoek om meer fysiologische relevantie te bieden⁴. Primaire cellen worden rechtstreeks uit het lichaamsweefsel van belang gehaald en kunnen de in vivo fysiologie nauwkeuriger nabootsen. Isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina kan nuttig zijn voor het bestuderen van biologische mechanismen van bekkenorgaanverzakking en ziektemodellering, rekening houdend met belangrijke donorkenmerken, zoals leeftijd en menopauzale status.

Verzakking van het bekkenorgaan treft vaak oudere of postmenopauzale personen. De isolatie en proliferatie van primaire fibroblastcellen bij het bestuderen van deze aandoening zijn een uitdaging vanwege verminderde celpopulaties en het klonogene vermogen van oudere donoren⁵. In onze ervaring slaagde het gebruik van eerder beschreven protocollen voor de dissociatie van vaginaal weefsel er niet in om fibroblasten te extraheren uit een standaard weefselbiopsie van 1^cm2 .

Via een literatuuronderzoek ontdekten we dat vergelijkbare studies waren onderverdeeld in twee groepen: diermodellen, zoals muizen⁶, en menselijke modellen ^7,8. Bij het volgen van het muisprotocol leverde het gebruik van een schaar voor weefselverwerking van menselijk vaginaal weefsel onvoldoende mechanische vertering op. Extrapolatie van protocollen met behulp van muizenweefsel en andere weefselplaatsen⁹ was niet succesvol.

De meeste artikelen die menselijke vaginale monsters gebruikten, gebruikten weefsel van premenopauzale personen met bekkenorgaanverzakking ^7,10. Hoewel een paar artikelen het gebruik van monsters van zowel premenopauzale als postmenopauzale personen^{rapporteerden11}, beschreven ze niet voldoende in detail het protocol dat werd gebruikt om fibroblasten van oudere of postmenopauzale donoren met succes te isoleren. Isolatie en ziektemodellering met behulp van fibroblasten uit postmenopauzaal weefsel kunnen essentieel zijn voor het begrijpen van de cellulaire pathofysiologie van verzakking van het bekkenorgaan, aangezien deze aandoening de hoogste prevalentie heeft bij individuen in het decennium na de menopauze¹².

We beschrijven een methode voor het isoleren en kweken van een met fibroblasten verrijkte eencellige suspensie uit menselijk vaginaal weefsel met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar protocol voor het verkrijgen van postmenopauzale of verouderende menselijke vaginale fibroblasten. Van geïsoleerde cellen werd bevestigd dat ze fibroblasten waren door middel van morfologisch onderzoek met behulp van fasecontrastmicroscopie en immunofluorescentie (IF) om de expressie van vimentine, F-actine en α-gladde spieractine (α-SMA) te beoordelen.

Protocol

Vaginaal weefsel werd verkregen van vrouwen die een operatie voor bekkenorgaanverzakking ondergingen. Het vaginale weefsel dat na de operatie werd verzameld, werd beschouwd als afvalmateriaal en zou anders worden weggegooid. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Massachusetts General Brigham.

1. Vaginale weefseloogst van de patiënt

1. Diagnose bekkenorgaanverzakking door een anamnese af te nemen en de bevindingen van het bekkenonderzoek te gebruiken: Kwantificering van bekkenorgaanverzakking (POP-Q) metingen werden in de kliniek verkregen, die bewijs van bekkenorgaanverzakking aantoonden.
2. Gebruik de volgende inclusiecriteria: ouder dan 18 jaar; Geschiedenis van symptomatische verzakking van het bekkenorgaan; Kiezen voor chirurgische correctie van bekkenorgaanverzakking.
3. Sluit het volgende uit: Zwangere vrouwen en patiënten die weigeren weefsel te doneren.
4. Snijd het overtollige vaginale weefsel bij als een noodzakelijke stap van een operatie voor bekkenorgaanverzakking. Dit vaginale epitheel wordt in totale dikte weggesneden na de volgende operaties: anterieure colporrhaphy, posterieure colporrhaphy en colpocleisis.
5. Transporteer weefsel naar het laboratorium in een steriele monsterafnamebeker met normale zoutoplossing of serumvrije DMEM/F12 (Gibco) media. Blijf op het ijs.

2. Weefselverwerking en -vertering

1. Voorbereiding van weefsels
   1. Meet en snijd het weefsel zodat het de volledige dikte van het vaginale epitheel omvat, zodat er segmenten van ongeveer 1 cm² ontstaan.
   2. Zorg voor een nauwkeurige meting van de biopsiegrootte 1 cm².
      OPMERKING: Het overschatten van de grootte van de weefselbiopsie kan de weefselvertering belemmeren.
   3. Bereid 2-3 extra vaginale biopsieën van elk 1^cm2 voor van een enkele donor en leg de biopsieën opzij.
2. Mechanische vergisting
   1. Plaats de vaginale biopsie in een petrischaaltje van 10 cm celcultuur. Pipeteer 500-1.000 μL serumvrije media aangevuld met 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine Bonto het vaginale weefsel om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt.
   2. Hak het vaginale weefsel in kleine fragmenten met behulp van twee steriele scalpels (nr. 11 of nr. 15) in beide handen.
   3. Zorg ervoor dat de punten van de messen loodrecht op het oppervlak van het weefsel staan. Oefen gelijkmatige en gelijkmatige druk uit op het weefseloppervlak met behulp van twee scalpels. Voer een afwisselende trekkende actie uit om het weefsel in zeer kleine stukjes te snijden.
   4. Herhaal deze haktechniek met behulp van de techniek met twee scalpels totdat het monster een uniforme consistentie heeft met stukjes van 1-2 mm.
      OPMERKING: Mechanische vertering met behulp van deze techniek met twee scalpels van een biopsie van 1 cm² duurt ongeveer 15-20 minuten om te voltooien.
   5. Voeg 2-3 ml serumvrije DMEM/F12-media aangevuld met 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine B toe aan de plaat en suspendeer het gehakte weefsel. Pipeteer de oplossing met weefselfragmenten op en neer om eventuele klonten te breken.
3. Enzymatische vertering
   1. Breng de oplossing met weefselfragmenten over in een conische buis van 15 ml. Voeg serumvrije DMEM/F12-media toe aan de weefselkweekschaal waar vaginaal weefsel werd fijngehakt om eventuele resterende weefselfragmenten te verzamelen. Breng de oplossing met weefselfragmenten over in de conische buis. Voeg extra serumvrije DMEM/F12-media toe tot het totale volume 10 ml is.
   2. Los 5 mg Liberase op in 1 ml steriel water (5 mg/ml). Bewaren in aliquots van 230 μl bij -20 °C gedurende maximaal een maand of -80 °C gedurende 6 maanden.
   3. Voeg 230 μL Liberase (voorraad 13 E/ml) toe aan de tube, met een eindconcentratie van 0,3 E/ml.
      OPMERKING: Liberase-activiteit kan variëren tussen batches. Ontdooi elke aliquot onmiddellijk voor gebruik met behulp van een waterbad. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.
   4. Herhaal stap 2.1-2.3 voor 2-3 extra vaginale biopsieën van dezelfde donor.
      OPMERKING: Bewaar elke oplossing die weefselfragmenten van een enkele biopsie bevat in afzonderlijke conische buisjes. Bijvoorbeeld 4 vaginale biopsieën in 4 buisjes. Dit is belangrijk voor een optimale celpelletering na het centrifugeren.
   5. Incubeer de buisjes gedurende 3 uur bij 37 °C met constante, krachtige beweging met behulp van een monstermenger.
   6. Plaats een monstermenger in een CO₂ -incubator. Zorg voor constante agitatie. (Voorbeeldinstellingen van de mixer: 25 tpm rotatiebeweging gedurende 5 s, 30° wederzijdse (kantelende rotatie) gedurende 5 s en 2° trilbeweging (vortexen) gedurende 3 s).
   7. Tijdens de incubatie, wervel de buizen met tussenpozen van 30 minuten.
   8. Centrifugeer de monsters bij 3.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en gooi deze weg.
   9. Resuspendeer de pellet in 1-2 ml DMEM/F12-media met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2,5 μg/ml amfotericine B om het Libree-enzym te verdunnen. Pipetteer krachtig totdat de pellet volledig is geresuspendeerd.

3. Celcultuur

1. Verwijdering van niet-verteerde weefselfragmenten
   1. Plaats een celzeef van 100 μm op een steriele conische container van 50 ml.
   2. Bundel de celsuspensie van de meerdere weefselbiopten van dezelfde donor samen.
   3. Zeef de weefsel-/enzymsuspensie en druk deze aan met een spuitzuiger van 5 ml. Herhaal deze stap totdat de resterende weefselfragmenten volledig lijken te zijn doorgedrukt.
      OPMERKING: Er kan wat slijm uit de vaginaweefselfragmenten komen dat niet volledig door de zeef is gewerkt. Gooi het slijm weg met de celzeef.
2. Bundeling van celculturen
   1. Plaat gepoolde celsuspensie van meerdere vaginale biopsieën (van dezelfde donor) op een petrischaaltje (60 mm x 15 mm).
   2. Incubeer de petrischaal een nacht in een CO₂ -incubator bij 37 °C.
   3. Observeer en bevestig de aanwezigheid van niet-hechtende cellen met een fasecontrastmicroscoop.
   4. Zorg ervoor dat de focus van de microscoop op de onderkant van de plaat ligt.
      OPMERKING: Er kunnen veel immuuncellen op de voorgrond staan. Een kleiner aantal fibroblasten zal aan de onderkant van de plaat worden bevestigd.
   5. Wacht 18-24 uur voordat u de celkweekmedia vervangt, om voldoende celhechting te garanderen.
   6. Verander het kweekmedium elke drie dagen totdat 80% samenvloeiing optreedt. Wanneer cellen 80-90% samenvloeiing bereiken, breid dan uit naar een grotere kolf of vries aliquots van cellen in voor toekomstig gebruik.

Results

Vaginaal weefsel werd verzameld van 10 onafhankelijke donoren die een bekkenorgaanverzakkingsoperatie ondergingen. Met behulp van het beschreven protocol werden cellen geïsoleerd uit menselijk vaginaal weefsel. Celpopulaties hadden een karakteristiek langwerpig, plat en spoelvormig uiterlijk. Net als andere studies zagen we significant langzamere celverdubbelingscapaciteiten en een verminderd klonogene vermogen van fibroblasten bij toenemende leeftijd van de donor. Deze verschillen werden opgemerkt bij het vergelijken van fibroblasten geïsoleerd van oudere personen (75-78 jaar oud) met die geïsoleerd van jonge personen (35-47 jaar oud). Cellen van donoren van middelbare leeftijd vertoonden een intermediair profiel (56-61 jaar oud). De proliferatiesnelheid van cellen werd aanvankelijk geschat door directe visualisatie met behulp van een fasecontrastmicroscoop met dezelfde bekende zaaidichtheid.

Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 1 toont een schematische weergave van het dissociatie- en isolatieprotocol. Na deze stappen leverde dit protocol een slagingspercentage van 90% op van primaire fibroblastisolatie bij negen van de tien donoren in voldoende celaantallen om subculturing van cellen mogelijk te maken. De mediane leeftijd van de donoren was 59 jaar.

Protocol (auteur, jaar)	Donorweefsel van het originele protocol	Aantal donateurs	Leeftijd van de donor in jaren	Verkregen fibroblasten	Morfologie
Ruiz-Zapata et al., 2013	Menselijke vagina	3	56-78	Nee	N.V.T
Khan et al., 2016	Het oor en de staart van de muis	2	48-65	Nee	N.V.T
Waise et al., 2019	Menselijk weefsel	3	56-75	Nee	N.V.T
Nadalutti et al., 2020	Menselijke voorhuid	1	65	Nee	N.V.T
Actueel	Menselijke vagina	10	35-79	Ja	Spindel-vormig

Tabel 1: Vergelijking van protocollen voor succesvolle isolatie van menselijke vaginale fibroblasten. Vergelijking van verschillende bestaande protocollen met de onze en aangetoond door morfologische resultaten.

Tabel 1 toont de resultaten van het gebruik van andere protocollen om vaginale fibroblastisolatie in deze studie te proberen. We ontwikkelden een standaardprotocol voor de isolatie van primaire fibroblasten uit vaginaal slijmvlies en oudere donoren⁵.

We hebben verschillende gevestigde protocollen getest, waaronder die vermeld in tabel 1, en hebben in ons onderzoek geen succes waargenomen bij het isoleren van cellen met behulp van deze protocollen. We stellen de volgende redenen voor hun beperkingen voor.

Het protocol gepubliceerd door Ruiz et ^al.3 omvat het afschrapen van fascia en het snijden van het weefsel in kleine stukjes. In onze ervaring is het moeilijk om fascia te onderscheiden en pogingen tot schrapen kunnen leiden tot een aanzienlijke vermindering van de celopbrengst. Hoewel deze methode eenvoudig is, ontbreken er kritische details, wat de generaliseerbaarheid beperkt. Bovendien lijkt de mechanische vertering in dit protocol onvoldoende voor postmenopauzaal weefsel, dat de neiging heeft dichter te zijn.

Protocollen gepubliceerd door Khan et ^al.9 en Waise et ^al.13 maken gebruik van een schaar voor weefselverminking, die geen significante multidirectionele schuifkrachten introduceert in vergelijking met de scalpeltechniek. In onze ervaring werkte de schaarmethode ook niet effectief.

Ten slotte leverde het protocol van Nadalutti et ^al.14 , dat de explantatiemethode gebruikte, geen fibroblasten op in onze handen. Deze methode kan minder effectief zijn vanwege de aard van postmenopauzaal weefsel, dat mogelijk een agressievere mechanische en enzymatische verwerking vereist om fibroblasten met succes te dissociëren.

Figuur 2: Fasecontrastbeeld van zwevende cellen op dag 0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 toont gesuspendeerde cellen op dag 0 met behulp van ons protocol.

Figuur 3: Fasecontrastbeeld van vaginale primaire fibroblasten op dag 14 van de kweek bij 100x vergroting van een gepoolde celsuspensie van drie weefselbiopten van 1 cm2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont primaire fibroblasten bij een vergroting van 100x van een gepoolde celsuspensie van 3 weefselbiopten van 1 cm² in afmetingen.

De identiteit van fibroblasten werd onderzocht met behulp van immunofluorescerende technieken zoals eerder beschreven, met kleine aanpassingen. Om de cellulaire oorsprong van primaire vaginale cellen te verifiëren, gebruikten we specifieke biomarkers van fibroblastische oorsprong via immunofluorescerende kleuring. Cellen werden geïdentificeerd als fibroblasten op basis van positieve kleuring van vimentine (figuur 4), F-actine en α-SMA uit premenopauzale en postmenopauzale weefselmonsters (figuur 5). Fibroblasten werden gekweekt tot expansie met een hoge levensvatbaarheid (>90%) voor gebruik in experimenten.

Figuur 4: Positieve kleuring van vimentine van vaginale fibroblasten. De geïsoleerde primaire fibroblasten van het premenopauzale en postmenopauzale weefsel werden onderworpen aan IF-analyse en de beelden werden gemaakt met een vergroting van 200x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Positieve kleuring van F-actine en α-SMA van vaginale fibroblasten. De resultaten van eiwitexpressie vergeleken met IgG-controle. De beelden zijn verzameld met een vergroting van 200x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Veel eerdere studies hebben gerapporteerd hoe primaire fibroblasten uit de menselijke vagina kunnen worden geïsoleerd ^3,7. In verschillende onderzoeken werd menselijk vaginaal weefsel gebruikt van premenopauzale personen met een verzakking van het bekkenorgaan. Hoewel een paar artikelen het gebruik van weefsel van premenopauzale en postmenopauzale personen rapporteerden ^7,11, beschreven ze niet in voldoende detail het protocol dat werd gebruikt om fibroblasten van oudere of postmenopauzale donoren met succes te isoleren. De vaginale wand is dikker bij postmenopauzale vrouwen met genitale verzakking dan bij premenopauzale vrouwen, wat de verhoogde moeilijkheid met isolatie in deze populatie kan verklaren¹³. Succesvolle isolatie van postmenopauzale donoren is essentieel voor ziektemodellering en onderzoek, aangezien bekkenbodemaandoeningen het meest voorkomen in de postmenopauzale of oudere leeftijdsgroepen.

We hebben een protocol opgesteld om met succes en consistentie menselijke vaginale fibroblasten te oogsten en te kweken van donoren in de leeftijd van 35-78 jaar. De cellulaire oorsprong van primaire vaginale cellen werd bevestigd door biomarkers van fibroblastische oorsprong via immunofluorescerende kleuring.

De hier gepresenteerde isolatieprocedure voor menselijke vaginale fibroblasten maakt isolatie en kweek van primaire fibroblastcellen mogelijk. In onze ervaring slaagde het gebruik van eerder gepubliceerde protocollen voor dierlijk⁹en menselijk ^3,14,16 weefsel voor dissociatie van primaire cellen er niet in om fibroblasten uit menselijke vaginamonsters te extraheren in deze studie ¹⁴.

We veronderstelden twee waarschijnlijke redenen voor uitdagingen van celdissociatie van menselijk vaginaal weefsel: (1) de dermale dikte van het slijmvlies is groter bij oudere donoren en in vergelijking met die van niet-mucosale weefsel van oudere donoren^13,17 waardoor celdissociatie moeilijker wordt en (2) de dichtheid van fibroblasten kan aanzienlijk worden verminderd bij oudere personen¹⁷.

Gezien deze uitdagingen zijn er een paar cruciale stappen in dit protocol die niet mogen worden gewijzigd. De eerste cruciale stap is de implementatie van een zeer rigoureuze mechanische vergisting. Hier gebruiken we de techniek met twee scalpels. Onze ervaring is dat vervanging door een schaar om het weefsel fijn te hakken geen fragmenten oplevert die klein genoeg zijn om fibroblasten te dissociëren van menselijk vaginaal weefsel.

De andere cruciale stap is het samenvoegen van de celsuspensie en het samenvoegen van 3-4 biopsieën van volledige dikte (1^cm2) van een enkele donor. Dit is nodig om voldoende cellen te verkrijgen voor de voortdurende teelt. In alle gevallen hebben we aanzienlijk meer weefsel dan 1^cm2 geoogst, omdat overtollig vaginaal epitheel wordt bijgesneden als een noodzakelijk onderdeel van een operatie voor bekkenorgaanverzakking. In deze studie hebben we alleen celsuspensies samengevoegd die afkomstig waren van dezelfde donor, omdat we probeerden cellulaire kenmerken en proliferatie tussen verschillende donoren te onderzoeken en te differentiëren.

Ons protocol heeft een duidelijk voordeel: de mechanische en enzymatische vertering leiden tot betere opbrengsten voor postmenopauzaal weefsel, maar hebben geen negatieve invloed op premenopauzale monsters.

We erkennen verschillende beperkingen van ons protocol. Toegang tot menselijk vaginaal weefsel kan een uitdaging zijn in situaties waarin geen vaginale verzakkingsoperatie wordt uitgevoerd. De noodzaak van pooling van celsuspensies van meerdere weefselbiopsiemonsters kan ook een beperking zijn.

Concluderend zal dit protocol voor het verkrijgen van menselijke vaginale fibroblasten een nuttig hulpmiddel zijn voor toekomstig onderzoek naar bekkenbodemaandoeningen, vooral bij postmenopauzale personen, evenals een belangrijke aanvulling op het onderzoek naar de gezondheid van vrouwen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Bio Techne	B23192
Cell strainer (100 μm)	ThermoFisher Scientific	22363549
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Feather Disposable Scalpel No. 15	Socorex	FB.15
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	NC1983075
High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer Sample Mixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISA	R&D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penicillin/Streptomycin (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Serologic pipettes (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Sterile syringes (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458