Mechanische dissociatie van weefsels voor analyse van één cel met behulp van een gemotoriseerd apparaat

Summary

Er wordt een algemeen protocol opgesteld voor de gecombineerde enzymatische en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van weefsels om eencellige suspensies te genereren voor stroomafwaartse analyses, zoals flowcytometrie. Instructies voor de fabricage, montage en bediening van het goedkope mechanische apparaat dat voor dit protocol is ontwikkeld, zijn inbegrepen.

Abstract

Het kunnen isoleren en voorbereiden van afzonderlijke cellen voor de analyse van weefselmonsters is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen en onderzoek. Handmatige protocollen voor eencellige isolaties zijn zeer tijdrovend en vatbaar voor gebruikersvariabiliteit. Geautomatiseerde mechanische protocollen zijn in staat om de verwerkingstijd en de variabiliteit van monsters te verminderen, maar zijn niet gemakkelijk toegankelijk of kosteneffectief in onderzoeksomgevingen met minder middelen. Het hier beschreven apparaat is ontworpen voor semi-geautomatiseerde weefseldissociatie met behulp van in de handel verkrijgbare materialen als een goedkoop alternatief voor academische laboratoria. Er zijn instructies gegeven voor het vervaardigen, monteren en bedienen van het apparaatontwerp. Het dissociatieprotocol produceert op betrouwbare wijze eencellige suspensies met vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters als handmatige preparaten in meerdere muizenweefsels. Het protocol biedt de mogelijkheid om tot 12 weefselmonsters tegelijk per apparaat te verwerken, waardoor onderzoeken die grote steekproefgroottes vereisen, beter beheersbaar worden. De bijbehorende software maakt het ook mogelijk om het apparaatprotocol aan te passen aan verschillende weefsels en experimentele beperkingen.

Introduction

Single-cell analyse is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen, of het nu gaat om toepassingen zoals flowcytometrie, het identificeren van verschillende celtypen, single-cell sequencing, of voor het identificeren van genomische of transcriptomische variaties tussen cellen^. Om dergelijke celisolaties uit weefsels van belang uit te voeren, moeten ontlede weefsels worden gehakt en door een fijne celzeef worden geduwd om bindweefsel uit de gewenste cellen te filteren (Figuur 1A). Het isoleren van aanhangende celtypen, zoals dendritische cellen of macrofagen, of cellen uit bijzonder vezelige weefsels....

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Voor deze onderzoeken werden weefsels van 7 tot 9 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).

1. Handmatige dissociatie

OPMERKING: Deze stap is een bewerking van Maisel K. et ^al.7.

1. Verwijder ontleed weefsel en plaats het in koude celkweekmedia met 5% foetaal runderserum (FBS).
2. Hak het weefsel fijn met een scherpe dissectieschaar totdat de fragmenten kleiner zijn dan 1 m....

Results

Dit semi-geautomatiseerde mechanische protocol kan resultaten repliceren van experimenten waarbij cellen handmatig werden verwerkt. Celsuspensies die met dit apparaat en door handmatige dissociatie worden bereid, vertonen vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters in long-, nier- en hartweefsel van muizen (Figuur 2A,B). Populaties van immuuncellen, zoals T-cellen en dendritische cellen, werden niet significant beïnvloed door een verschil in isolatieprotoc.......

Discussion

Dit apparaat is ontworpen voor eenvoudige montage in de onderzoeksomgeving om eencellige suspensies uit hele weefsels te leveren voor daaropvolgende analyse van één cel. De functies, hoewel eenvoudig, zijn voldoende om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in academische omgevingen en daarbuiten. Een belangrijk voordeel van het gebruik van dit apparaat is het potentieel om de bereiding van eencellige suspensies te verbeteren door de variabiliteit te verminderen. Bovendien zou de mogelijkheid om 12+ monsters tegeli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3