Method Article

Mechanische dissociatie van weefsels voor analyse van één cel met behulp van een gemotoriseerd apparaat

DOI:

10.3791/65866

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2UMD Terrapin Works, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er wordt een algemeen protocol opgesteld voor de gecombineerde enzymatische en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van weefsels om eencellige suspensies te genereren voor stroomafwaartse analyses, zoals flowcytometrie. Instructies voor de fabricage, montage en bediening van het goedkope mechanische apparaat dat voor dit protocol is ontwikkeld, zijn inbegrepen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het kunnen isoleren en voorbereiden van afzonderlijke cellen voor de analyse van weefselmonsters is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen en onderzoek. Handmatige protocollen voor eencellige isolaties zijn zeer tijdrovend en vatbaar voor gebruikersvariabiliteit. Geautomatiseerde mechanische protocollen zijn in staat om de verwerkingstijd en de variabiliteit van monsters te verminderen, maar zijn niet gemakkelijk toegankelijk of kosteneffectief in onderzoeksomgevingen met minder middelen. Het hier beschreven apparaat is ontworpen voor semi-geautomatiseerde weefseldissociatie met behulp van in de handel verkrijgbare materialen als een goedkoop alternatief voor academische laboratoria. Er zijn instructies gegeven voor het vervaardigen, monteren en bedienen van het apparaatontwerp. Het dissociatieprotocol produceert op betrouwbare wijze eencellige suspensies met vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters als handmatige preparaten in meerdere muizenweefsels. Het protocol biedt de mogelijkheid om tot 12 weefselmonsters tegelijk per apparaat te verwerken, waardoor onderzoeken die grote steekproefgroottes vereisen, beter beheersbaar worden. De bijbehorende software maakt het ook mogelijk om het apparaatprotocol aan te passen aan verschillende weefsels en experimentele beperkingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell analyse is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen, of het nu gaat om toepassingen zoals flowcytometrie, het identificeren van verschillende celtypen, single-cell sequencing, of voor het identificeren van genomische of transcriptomische variaties tussen cellen. Om dergelijke celisolaties uit weefsels van belang uit te voeren, moeten ontlede weefsels worden gehakt en door een fijne celzeef worden geduwd om bindweefsel uit de gewenste cellen te filteren (Figuur 1A). Het isoleren van aanhangende celtypen, zoals dendritische cellen of macrofagen, of cellen uit bijzonder vezelige weefsels, vereist aanvullende mechanische of enzymatische scheidingsstappen 2,3,4. Dit proces wordt over het algemeen handmatig uitgevoerd, waardoor het zeer tijdrovend is en vatbaar voor gebruikersvariabiliteit bij het beoordelen van de celopbrengst en de levensvatbaarheid van het monster. Daarom is het van cruciaal belang om aanpasbare opties voor geautomatiseerde weefseldissociatie te introduceren. Hoewel er enkele pogingen zijn ondernomen om dergelijke systemen te ontwerpen, zijn de bestaande opties niet altijd gemakkelijk toegankelijk, met name in academische laboratoria en omgevingen met minder middelen, grotendeels vanwege de onbetaalbare aard van deze apparaten5. Bovendien zijn deze apparaten niet altijd aanpasbaar aan de individuele behoeften van een onderzoeksgroep6.

Hier werd een weefseldissociatorapparaat ontworpen om de vertering van hele weefsels of weefselstukken in eencellige suspensies te automatiseren met behulp van spijsverteringsenzymen en mechanische verstoring. Dit apparaat kan eenvoudig in het laboratorium worden geassembleerd, in verwarmings- of koelkamers worden geplaatst voor temperatuurregeling, aangepast aan het vereiste aantal te dissociëren weefsels en worden geprogrammeerd met de gewenste dissociatieprotocollen. Het brede gebruik van dit apparaat zou de reproduceerbaarheid van celextractieprotocollen aanzienlijk kunnen verbeteren en een tijdbesparend alternatief kunnen bieden voor handmatige dissociatie.

Het ontwerp maakt de gelijktijdige vertering van maximaal 12 weefsels mogelijk via een geautomatiseerd proces. Het apparaat bestaat uit 12 afzonderlijke motoren die parallel zijn aangesloten en worden gevoed door een standaard stopcontact via een AC/DC-adapter met een instelbare spanningsknop om de rotatie/snelheid van de motoren te regelen. De motoren draaien een zeskantbout die precies in de bovenkant van de C-buizen past. De C-buizen worden op hun plaats gehouden door neerwaartse spanning op een acrylplaat die aan weerszijden wordt vergrendeld aan de bovenplaat waar de motoren zijn vastgezet (Figuur 1B). Omdat de motoren parallel zijn aangesloten, zou hun snelheid bij een bepaalde spanning niet veel moeten variëren, maar de belasting (het aantal C-buizen dat op het apparaat is gemonteerd) zal de snelheid beïnvloeden, zelfs als de spanning constant wordt gehouden. Voor het meten van omwentelingen per minuut (rpm) is een toerenteller ingebouwd met behulp van een hall-effectsensor en een vaste magneet op een van de motorassen (aanvullende figuur 1). De CAD-bestanden voor het bouwen van motorarrays zijn te vinden in aanvullend coderingsbestand 1. Ook inbegrepen is een programmeerbare schakelaar om de draairichting om te keren door de positieve/negatieve ladingen die aan de motoren worden geleverd om te keren. Al deze functies zijn geïntegreerd met behulp van gecodeerde software (Arduino IDE-software, zie Tabel met materialen) op een Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Met behulp van aangesloten knoppen en een LCD-paneel (aanvullende afbeelding 2) is het mogelijk om opgeslagen en aangepaste protocollen te maken en uit te voeren, automatisch de draairichting om te keren op bepaalde tijden van een protocol, de snelheid aan te passen met behulp van de spanning (aanvullende afbeelding 3) en het huidige motortoerental en de resterende tijd weer te geven om een geprogrammeerd protocol te voltooien (aanvullende afbeelding 4).

Voor de huidige studie werden eencellige suspensies bereid met behulp van zowel mechanisch-enzymatische weefseldissociatie met dit apparaat als manueel-enzymatische weefseldissociatie om eventuele verschillen te bepalen in cellen die zijn teruggewonnen voor stroomafwaartse toepassingen. De celpreparaten werden geëvalueerd op basis van de totale celopbrengst per weefsel en het percentage cellevensvatbaarheid. Flowcytometrie werd gebruikt om potentiële verschillen in expressie van oppervlaktemarkers te vergelijken. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van grafische en statistische analysesoftware. Ongepaarde Welch t-tests werden gebruikt om paren van monsters of groepen te vergelijken, waarbij steekproefgroottes n > 4 muizen 2 gerepliceerde experimenten vertegenwoordigden. Gedetailleerde instructies voor de fabricage en montage van dit apparaat zijn te vinden in Aanvullend bestand 1. Materialen die nodig zijn voor dit protocol staan vermeld in de Tabel met materialen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is goedgekeurd door de UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Voor deze onderzoeken werden weefsels van 7 tot 9 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).

1. Handmatige dissociatie

OPMERKING: Deze stap is een bewerking van Maisel K. et al.7.

  1. Verwijder ontleed weefsel en plaats het in koude celkweekmedia met 5% foetaal runderserum (FBS).
  2. Hak het weefsel fijn met een scherpe dissectieschaar totdat de fragmenten kleiner zijn dan 1 mm in elke afmeting.
  3. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis van 15 ml en voeg 5 ml media toe.
  4. Voeg spijsverteringsenzymen toe op basis van de weefsel- en celtypen die worden geïsoleerd. Gebruik voor de gepresenteerde experimenten collagenase 4 (1 mg/ml), collagenase D (1 mg/ml) en DNase (40 μg/ml).
  5. Incubeer op een shaker of rocker gedurende 1 uur bij 37 °C en schud zachtjes tijdens de incubatie. Pipeteer het monster 100 keer op en neer.
  6. Voeg EDTA toe om een monstervolume met een concentratie van 5 mM te verkrijgen. Pipeteer het monster 100 keer op en neer en pipetteer het monster vervolgens krachtig 100 keer op en neer.
  7. Haal het monster door een celzeef van 70 μm en vang het op in een buisje van 50 ml of 15 ml.
  8. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in 1 ml lysebuffer voor rode bloedcellen. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  9. Neutraliseer de lysisbuffer door 9 ml koude 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen.
  10. Centrifugeer de verzamelde cellen opnieuw bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in de gewenste buffer of media.

2. Semi-automatische mechanische dissociatie

  1. Plaats ontleed weefsel in koude celkweekmedia met 5% foetaal runderserum (FBS).
    OPMERKING: Dit protocol is bedoeld voor celisolatie uit vaste weefsels.
  2. Hak het weefsel fijn met een scherpe dissectieschaar tot de weefselfragmenten ongeveer 5 mm in elke afmeting zijn. Breng het gehakte weefsel over in een C-buis en voeg 1 ml media toe.
  3. Laad de C-buis op het apparaat. Monteer de buishouderplaat (aanvullende afbeelding 1A) over de D-vormige buisbodems.
  4. Bevestig de buizen aan de motorplaat door de spanarmen in de acrylplaat te vergrendelen (aanvullende afbeelding 3).
  5. Stel een aangepast programma in: vooruit, 30 s; Achteruit, 10 s; Loop, 4 keer.
    1. Kies Aangepaste modus in het hoofdmenu door op de blauwe knop te drukken.
    2. Specificeer in het eerste menu van de aangepaste modus de duur van de voorwaartse rotatie tot 30 s door op de rode knop te drukken totdat de waarde op het scherm 30 s aangeeft. Druk op de blauwe knop om deze waarde te selecteren en naar het volgende menuscherm te gaan.
    3. Specificeer in het tweede menu van de aangepaste modus de duur van de omgekeerde rotatie tot 10 s door op de rode knop te drukken totdat de waarde op het scherm 10 s aangeeft. Druk op de blauwe knop om deze waarde te selecteren en naar het volgende menuscherm te gaan.
    4. Geef in het derde menu van de aangepaste modus het aantal keren op dat de selecties die zijn ingesteld in de stappen 2.5.2-2.5.3 moeten worden herhaald door op de rode knop te drukken totdat de waarde op het scherm 4X aangeeft. Druk op de blauwe knop om deze waarde te selecteren en het programma te starten.
      OPMERKING: Aangepaste programma's worden niet opgeslagen in het geheugen van het apparaat, maar kunnen worden geprogrammeerd als een van de vooraf ingestelde programma's voor een snellere werking (instructies voor het programmeren van het apparaat vindt u in aanvullend bestand 1).
  6. Voer het aangepaste programma uit op 200 tpm door de spanningsregelknop aan te passen (aanvullende afbeelding 3) totdat de berekende toerentalwaarde in de rechterbenedenhoek van het LCD-scherm 200 aangeeft (aanvullende afbeelding 4).
  7. Voeg spijsverteringsenzymen toe in media van 4 ml, afhankelijk van de weefsel- en celtypen die worden geïsoleerd.
    OPMERKING: Gebruik voor de gepresenteerde experimenten Collagenase 4 (1 mg/ml), Collagenase D (1 mg/ml) en DNase (40 μg/ml).
  8. Laad de C-buis op het apparaat en herhaal stap 2.3-2.6 om het volgende programma op 200 tpm uit te voeren: Vooruit, 30 s; Achteruit, 10 s; Loop, 4 keer.
  9. Breng het apparaat met de nog geladen slangen gedurende 45 minuten over naar een incubator van 37 °C.
  10. Laad de C-buis op het apparaat en herhaal stap 2.3-2.6 om het volgende programma op 50 tpm uit te voeren: Vooruit, 270 s; Achteruit, 30 s; Loop, 9 keer.
  11. Voeg EDTA toe om een concentratie van 5 mM in het monster te bereiken.
  12. Laad de C-buis op het apparaat en herhaal stap 2.3-2.6 om het volgende programma op 100 tpm uit te voeren: Vooruit, 30 s; Achteruit, 10 s; Loop, 2 keer.
  13. Duw het monster door een celzeef van 70 μm en vang het op in een buisje van 50 ml of 15 ml.
  14. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in 1 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  15. Neutraliseer de lysisbuffer met 9 ml koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  16. Centrifugeer de verzamelde cellen opnieuw bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in de gewenste buffer of media.

3. Data-analyse

  1. Analyseer de gegevens met behulp van grafische en statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen).
  2. Gebruik ongepaarde Welch t-tests om paren van monsters of groepen te vergelijken, waarbij steekproefgroottes n > 4 muizen 2 gerepliceerde experimenten vertegenwoordigen.
    OPMERKING: Verschillen werden als statistisch significant beschouwd wanneer (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit semi-geautomatiseerde mechanische protocol kan resultaten repliceren van experimenten waarbij cellen handmatig werden verwerkt. Celsuspensies die met dit apparaat en door handmatige dissociatie worden bereid, vertonen vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters in long-, nier- en hartweefsel van muizen (Figuur 2A,B). Populaties van immuuncellen, zoals T-cellen en dendritische cellen, werden niet significant beïnvloed door een verschil in isolatieprotoc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit apparaat is ontworpen voor eenvoudige montage in de onderzoeksomgeving om eencellige suspensies uit hele weefsels te leveren voor daaropvolgende analyse van één cel. De functies, hoewel eenvoudig, zijn voldoende om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in academische omgevingen en daarbuiten. Een belangrijk voordeel van het gebruik van dit apparaat is het potentieel om de bereiding van eencellige suspensies te verbeteren door de variabiliteit te verminderen. Bovendien zou de mogelijkheid om 12+ monsters tegeli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering werd ontvangen van het Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) en American Lung Association (KM). De auteurs willen Michele Kaluzienski bedanken voor zijn hulp bij het redigeren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
¼ inch acrylplaat  12" x 24"Acrylic Mega StoreN/A
½ inch acrylplaat 12" x 12"SimbaLuxSL-AS13-12x12
12 G roestvrij staal draad (voor trekstangen)Everbilt1000847413
16 G elektrische draad (gedraaid)Best ConnectionsN/A
2 x 3 mm magneet  SU-CRO0587N/A
2-kanaals relais board (om de polariteit van de stroom naar de motoren om te keren)AEDIKOAE06233
37 mm Diameter DC Motoren (12 V, 200 rpm) x 12GreartisanN/ANominale koppel: 2.2 Kg.cm
Overbrengingsverhouding: 1:22
Nominale stroom: 0.1 A
D-vormige uitlaatschaaftafmetingen: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L)
Versnellingsbakafmetingen: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L)
Motorafmetingen: 36,2 x 33,3 mm (1,43" x 1,31") (D x L)
Montagegatmaat: M3 (niet inbegrepen)
AC/C-voedingsadapter met variabele spanningsregelaar   (5 Amps, 3-12 volt)Mo-guJ19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precisie buck converter stap-down transformatorWalfront1A(voedingsadapter voor het voeden van Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)LAFVIN8541582500
Knoppen AwpeyePush-button
C57BL6/J muizen Jackson Laboratory
Collageenase 4WorthingtonCLS4 LS004188
Collageenase DRoche11088866001
DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Arendserum Medium)Corning10-013-CV
DNAseRoche11284932001
Dubbelzijdig schuimtapeSANKAN/A
Dubbelzijdige prototypingprintplaatdeyueN/A
EDTASigma- AldrichE7889
Elektrisch soldeer en soldeerboutLDK1002P
Elektrisch plakband3M03429NA
FBS (Fetaal Rundserum)Gibco16140089
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
Graphpad PrismGraphPad, La Jolla, CAGrafische en statistische analysesoftware
Hall effect sensor Afmetingen: 0,79 x 0,79 x 0,39 inchesSunFounder43237-2
Hex koppeling 6 mm Boor Motor Messing x 2 x 12UxcellN/A
Zeskantbouten (M4-.70 X 12 Zeskantkopschroef) x 12FASN/A
Jumperdraden (voor Arduino Nano)ELEGOOEL-CP-004
LCD schermJANSANEN/A
M3 Zeskant Kopschroeven x 12Shenzhen
Baishichuangyou
Technology co.Ltd		310luosditaozhuang
M3 Roestvrij StaalMachine schroeven Platte Kop Zeskant Kopschroeven (30 mm) x 36Still Awakea52400001
Snel loskoppelbare aansluitingenIEUYO22010064
Rode Bloedcel Lysis Buffer (10x)Cell Signaling46232
Terminal adapter schild Uitbreidingsbord voor Arduino Nano  12" x 24"Shenzhen
Weiyapuhua
Technology		60-026-3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).
  2. Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).
  3. Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
  4. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).
  5. McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
  6. Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).
  7. Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
  8. Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
  9. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  10. Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue DissociationSingle Cell AnalysisMechanical DissociationMotorized DeviceCell SuspensionFlow CytometryCell ViabilityImmune Cell IsolationSurface Marker ExpressionRed Blood Cell Lysis

Related Articles