Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van neurotoxiciteit bij volwassen Danio rerio met behulp van een reeks gedragstests in een enkele tank

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65869

⸱

3 november 2023

 ,  , 
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een uitgebreide gedragstestbatterij, inclusief de nieuwe tank-, Shoaling- en sociale voorkeurstests, om de potentiële neurotoxische effecten van chemicaliën (bijv. methamfetamine en glyfosaat) op volwassen zebravissen effectief te bepalen met behulp van een enkele tank. Deze methode is relevant voor neurotoxiciteit en milieuonderzoek.

Samenvatting

De aanwezigheid van neuropathologische effecten bleek jarenlang het belangrijkste eindpunt te zijn voor de beoordeling van de neurotoxiciteit van een chemische stof. In de afgelopen 50 jaar zijn de effecten van chemicaliën op het gedrag van modelsoorten echter actief onderzocht. Geleidelijk aan werden gedragseindpunten opgenomen in neurotoxicologische screeningsprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu routinematig gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Gedragstesten bij volwassen zebravissen bieden een gestandaardiseerde en betrouwbare manier om een breed scala aan gedragingen te bestuderen, waaronder angst, sociale interactie, leren, geheugen en verslaving. Gedragstesten bij volwassen zebravissen omvatten meestal het plaatsen van de vissen in een experimentele arena en het registreren en analyseren van hun gedrag met behulp van videotrackingsoftware. Vissen kunnen worden blootgesteld aan verschillende stimuli en hun gedrag kan worden gekwantificeerd met behulp van verschillende statistieken. De nieuwe tanktest is een van de meest geaccepteerde en meest gebruikte tests om angstachtig gedrag bij vissen te bestuderen. De scholen- en sociale voorkeurstests zijn nuttig bij het bestuderen van het sociale gedrag van zebravissen. Deze test is vooral interessant omdat het gedrag van de hele school wordt bestudeerd. Deze tests hebben bewezen zeer reproduceerbaar en gevoelig te zijn voor farmacologische en genetische manipulaties, waardoor ze waardevolle hulpmiddelen zijn voor het bestuderen van de neurale circuits en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag. Bovendien kunnen deze tests worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen om verbindingen te identificeren die potentiële gedragsmodulatoren kunnen zijn.

We zullen in dit werk laten zien hoe gedragsinstrumenten kunnen worden toegepast in de neurotoxicologie van vissen, waarbij we het effect van methamfetamine, een recreatieve drug, en glyfosaat, een milieuverontreinigende stof, analyseren. De resultaten tonen de significante bijdrage aan van gedragstesten in volwassen zebravissen aan het begrip van de neurotoxicologische effecten van milieuverontreinigende stoffen en medicijnen, naast het verschaffen van inzicht in de moleculaire mechanismen die de neuronale functie kunnen veranderen.

Inleiding

De zebravis (Danio rerio) is een populaire modelsoort van gewervelde dieren voor ecotoxicologie, ontdekking van geneesmiddelen en veiligheidsfarmacologische studies. De goedkope, gevestigde moleculair genetische hulpmiddelen en het behoud van belangrijke fysiologische processen die betrokken zijn bij de morfogenese en het onderhoud van het zenuwstelsel maken zebravissen tot een ideaal diermodel voor neurowetenschappelijk onderzoek, inclusief neurogedragstoxicologie 1,2. Het belangrijkste eindpunt voor het evalueren van de neurotoxiciteit van een chemische stof was tot voor kort de aanwezigheid van neuropathologische effecten. De laatste tijd zijn gedragseindpunten echter opgenomen in neurotoxicologische screeningprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu vaak gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Bovendien zijn gedragseindpunten zeer relevant vanuit ecologisch oogpunt, aangezien zelfs een zeer milde gedragsverandering bij vissen het voortbestaan van het dier in natuurlijke omstandigheden in gevaar kan brengen.

Een van de meest gebruikte gedragstesten in het onderzoek naar volwassen zebravissen is de nieuwe tanktest (NTT), die angstachtig gedrag meet 6,7. In deze test worden vissen blootgesteld aan nieuwigheid (vissen worden in een onbekend aquarium geplaatst), een milde aversieve stimulus en hun gedragsreacties worden geobserveerd. NTT wordt voornamelijk gebruikt om basale locomotorische activiteit, geotaxis, bevriezing en grillige bewegingen van vissen te beoordelen. Grillig8 wordt gekenmerkt door abrupte richtingsveranderingen (zigzaggen) en herhaalde episodes van versnellingen (darten). Het is een alarmreactie en wordt meestal waargenomen voor of na bevriezingsepisodes. Bevriezingsgedrag komt overeen met een volledige stopzetting van de bewegingen van de vis (behalve operculaire en oculaire bewegingen) op de bodem van de tank, in tegenstelling tot immobiliteit veroorzaakt door sedatie, die hypolocobeweging, akinesie en zinken veroorzaakt8. Bevriezing is meestal gerelateerd aan een hoge staat van stress en angst en maakt ook deel uit van onderdanig gedrag. Complex gedrag is een uitstekende indicator van de staat van angst van dieren. Van NTT is aangetoond dat het gevoelig is voor farmacologische en genetische manipulatie9, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bestuderen van de neurale basis van angst en aanverwante aandoeningen.

Zebravissen zijn een zeer sociale soort, dus we kunnen een breed scala aan sociaal gedrag meten. De ondieptetest (ST) en de sociale voorkeurstest (SPT) zijn de meest gebruikte tests om sociaal gedrag te beoordelen10. De ST meet de neiging van vissen om11 te groeperen door hun ruimtelijk gedrag en bewegingspatronen te kwantificeren. ST is nuttig voor het bestuderen van groepsdynamiek, leiderschap, sociaal leren en het begrijpen van het sociale gedrag van veel vissoorten12. De SPT in volwassen zebravissen werd aangepast van Crawley's voorkeur voor sociale nieuwheidstest voor muizen13 en werd al snel een populaire gedragstest voor de studie van sociale interactie in deze modelsoort14. Deze twee tests zijn ook aangepast voor gebruik in drugsscreeningstests en zijn veelbelovend gebleken voor het identificeren van nieuwe verbindingen die sociaal gedrag moduleren15,16.

Over het algemeen zijn gedragstesten bij volwassen zebravissen krachtige hulpmiddelen die waardevolle informatie kunnen opleveren over de gedragsmechanismen of de neurofenotypes van actieve stoffen en misbruikte medicijnen. Dit protocol beschrijft hoe deze gedragshulpmiddelen7 kunnen worden geïmplementeerd met elementaire materiële middelen en hoe ze kunnen worden toegepast in toxiciteitstests om de effecten van een breed scala aan neuroactieve stoffen te karakteriseren. Daarnaast zullen we zien dat dezelfde tests kunnen worden toegepast om de neurologische gedragseffecten van acute blootstelling aan een neuroactieve stof (methamfetamine) te beoordelen, maar ook om deze effecten te karakteriseren na chronische blootstelling aan omgevingsconcentraties van een pesticide (glyfosaat).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Strikte naleving van ethische normen garandeert het welzijn en de juiste behandeling van de zebravissen die voor experimenten worden gebruikt. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn opgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC). De hieronder gepresenteerde protocollen en resultaten zijn uitgevoerd onder de vergunning die is verleend door de lokale overheid (overeenkomstnummer 11336).

1. Huisvesting van dieren voor gedragstesten

  1. Voer alle tests (weergegeven in figuur 1) uit in een geïsoleerde gedragsruimte bij 27-28 °C tussen 10:00 en 17:00 uur.
  2. Was zowel de controle- als de blootgestelde vissen meerdere keren in schoon viswater [gezuiverd water met omgekeerde osmose met 90 mg/L aquariumsysteemzout, 0,58 mM CaSO4·2H2O en 0,59 mM NaHCO3] voordat u met de experimenten begint om mogelijke verontreiniging van de experimentele tank te voorkomen.
  3. Laat de dieren 1 uur voor aanvang van de experimenten wennen aan de gedragsruimte.
  4. Zorg ervoor dat de dieren (≈50:50 man:vrouw-verhouding) experimenteel naïef zijn en voer alle gedragstesten op een blinde manier uit met waarnemers die niet op de hoogte zijn van de experimentele groep.
  5. Om zinvolle resultaten in gedragstesten te verkrijgen, moet u een totaal aantal van 18 proefpersonen per aandoening (n = 18) hebben, idealiter verkregen tussen twee of meer onafhankelijke experimenten. Analyseer bijvoorbeeld in individuele tests het gedrag van 9 dieren per aandoening, per replica. Analyseer in groepstests het gedrag van een school van 6 tot 9 dieren per conditie, per replica.
  6. Voer alle tests uit volgens een batterijtestbenadering (zie planningsvoorstellen in figuur 2). Deze methode is ethisch geschikter en maakt het mogelijk om het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek te verminderen, in overeenstemming met het 3V-reductieprincipe7.
  7. Meestal zijn gedragstesten verbonden met biologische tests, dus offer de dieren volgens euthanasierichtlijnen18 voordat u monsters verzamelt en analyseert (OMIC's of chemicaliën). Als het eindpunt geen steekproef blijkt te zijn, moet de controlegroep aan het einde van het experiment opnieuw worden gestabiliseerd. Hergebruik de controledieren na enkele dagen voor fok- of experimentele doeleinden.

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimentele opstellingen. Drie configuraties van de vierkante tank om een breed scala aan gedragingen bij volwassen zebravissen te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Experimentele tijdlijn. Twee planningsvoorstellen voor de registratie van gedragstesten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Experimentele configuraties van de tank

  1. Angstachtig gedrag: de nieuwe tanktest (NTT)
    1. Pas de experimentele opstelling aan (aantal tanks, camera's en computers) om het maximale aantal vissen tegelijk vast te leggen. Individuele gedragstesten zijn tijdrovend, dus optimaliseer tijd, materiaal en ruimte.
    2. Bereid de experimentele tanks voor op NTT: Vierkante tank (20 cm lang, 20 cm breed, 25 cm hoog) bedekt met acrylpanelen op zijwanden en bodem om reflectie en interferentie tussen proefpersonen te voorkomen.
    3. Vul de experimentele tanks met 7 L (hoogte waterkolom: 20 cm hoogte) goed zuurstofrijk viswater bij 28 °C.
    4. Pas de positie van de tank voor de camera aan om vervormd beeld te voorkomen.
    5. Controleer de verlichtingsinstelling. LED-achtergrondverlichting (10000 lux) zorgt voor een homogene verlichting op het hele deel van de tank voor video-opnamen in goede omstandigheden.
    6. Schakel de camera's in en pas ze aan volgens hoofdstuk 3.
    7. Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van de experimentele tanks voordat u zo snel mogelijk begint met opnemen.
      NOTITIE: Het is belangrijk om te beginnen met opnemen met het dier op de bodem van de tank.
    8. Zorg ervoor dat u de dieren niet stoort tijdens het opnemen. Gebruik van een gordijn of paneel om de visuele interactie te beperken, niet alleen tussen tanks, maar ook tussen de steun en de buitenkant.
    9. Breng aan het einde van de registratie (de standaardopnametijd is 6 minuten) de dieren die de test al hebben doorstaan over naar een andere tank om ze niet te mengen met de naïeve dieren.
    10. Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Het is raadzaam om in totaal 18 proefpersonen per aandoening te hebben om zinvolle resultaten te verkrijgen in individuele onderzoeken (van twee of meer onafhankelijke replicaten).
    11. Randomiseer de experimentele groep die aan elke tank is toegewezen tussen proeven om mogelijke tankeffecten te voorkomen (als u meerdere aandoeningen tegelijkertijd registreert).
  2. Sociaal groepsgedrag: De Shoaling Test (ST)
    1. De experimentele configuratie van ST is dezelfde als die van NTT (dezelfde tanks kunnen direct worden hergebruikt).
    2. Volg de stappen 2.1.1-2.1.6. om de ST op te zetten.
    3. Introduceer de school (6 tot 9 proefpersonen tegelijkertijd) op de bodem van de experimentele tanks voordat u zo snel mogelijk begint met opnemen.
      NOTITIE: Het is belangrijk om te beginnen met opnemen met het dier op de bodem van de tank.
    4. Volg de stappen 2.1.8-2.1.11. om de ST uit te voeren.
    5. Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Om zinvolle resultaten in deze test te verkrijgen, maakt u ten minste twee onafhankelijke replicaten met dezelfde bankgrootte in elke replicaat.
    6. Houd de grootte van de ondiepte consistent voor alle experimentele groepen en repliceert binnen hetzelfde experiment.
  3. Sociaal individueel gedrag: De Sociale Voorkeurstest (SPT)
    1. Pas de experimentele opstelling aan om de experimentele ruimte en opnametijd te optimaliseren.
    2. Bereid de experimentele tanks voor op SPT: Vierkante tank (20 cm lang, 20 cm breed, 25 cm hoog) transparant (glas of plastic) om zijdelings zicht te bieden. De enkelvoudige focale vis is vrij om te interageren met een conspecifieke virtuele zone - een school vis die in de eenzijdige externe huisvestingstank is geplaatst, of met de niet-specifieke virtuele zone - een eenzijdige externe lege huisvestingstank.
    3. Vul de experimentele tanks met 5 L (hoogte waterkolom: 15 cm, dezelfde hoogte als de waterkolom in de tanks aan de buitenkant) schoon viswater bij 28 °C.
    4. Pas de positie van de tank voor de camera aan om vervormd beeld te voorkomen.
    5. Controleer of het systeem homogeen verlicht is.
    6. Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van de experimentele tanks voordat u onmiddellijk begint met opnemen met het dier in het midden.
    7. Vermijd visuele interacties tussen waarnemers en dieren tijdens het opnemen.
    8. Breng aan het einde van de opname van 6 minuten de aanwezige dieren over naar een andere tank om ze niet te mengen met de naïeve dieren.
    9. Herhaal de procedure met alle beschikbare onderwerpen. Zorg voor een totaal aantal van 18 proefpersonen per aandoening om zinvolle resultaten te verkrijgen in individuele onderzoeken (van twee of meer onafhankelijke replicaten).

3. Video-opname voor gedragstests

  1. Open de cameramanager om de beschikbaarheid van de GigE-camera op elke computer te controleren.
  2. Start de GigE-camerabesturingssoftware (zoals uEye Cockpit, hier beschreven). Open de optie Camera , selecteer de modus Monochroom en pas de afbeeldingsgrootte aan (1:2).
  3. Camera-eigenschappen openen
    1. Stel onder Camera de pixelklok in op Maximum, stel de framesnelheid in op 30 frames per seconde (fps) en pas de belichting aan (automatisch of handmatig aanpassen als het beeld te donker is).
    2. Stel onder Afbeelding de versterking in op 0 (automatisch) en de zwartniveaus (automatisch of handmatig aanpassen om een goed contrast te verkrijgen).
    3. Pas onder Grootte de grootte van het venster aan op het gebied dat moet worden gegraveerd (Breedte: Breedte-Links, Hoogte: Hoogte-Boven). Deze stap maakt het mogelijk om de grootte van de afbeelding en dus de uiteindelijke grootte van de video te verkleinen.
    4. Sluit Camera-eigenschappen.
  4. Maak een algemene map voor de experimentsessie om de camera-instellingen en video's op te slaan.
  5. Als u de camera-instellingen wilt opslaan, stelt u Bestand > Parameters opslaan > Naar bestand in en selecteert u de experimentmap die onlangs is gemaakt.
    OPMERKING: Het bestand met camera-instellingen kan dus opnieuw in de applicatie worden geladen om op elk moment met dezelfde beeldparameters te blijven werken (bijv. wanneer de camera plotseling wordt uitgeschakeld of om dezelfde instellingen opnieuw te gebruiken, de insteltijd te verkorten en de experimentele omstandigheden te homogeniseren). Als de camera op een bepaald moment vastloopt tussen video's, stopt u met opnemen, sluit u de camera af en schakelt u deze uit. Schakel het weer in, laad de cameraparameters opnieuw door naar Bestand te gaan > Laadparameters > Naar bestand en start de opname opnieuw. Controleer of de huidige video volledig is verkregen om de vis weg te gooien of te herhalen (geef de dieren wat tijd om opnieuw te acclimatiseren voordat u ze herhaalt).
  6. Herhaal deze procedure voor het instellen van de camera (stappen 3.1-3.5) op alle camera's.
  7. Wanneer alle camera's correct zijn geconfigureerd, opent u Videoreeks opnemen.
  8. Selecteer Maken om het als een nieuw videobestand op te slaan, selecteer de experimentmap die onlangs is gemaakt en vermeld in de naam van het videobestand de informatie van het onderwerp, het type experiment en de datum.
  9. Selecteer Max. Frames. Typ 10800 in de framedoos. Standaard video neemt 6 minuten op (Video 1) met 30 fps in AVI-formaat; Daarom 6 min x 60 s x 30 fps= 10800 frames in totaal.
  10. Selecteer Framesnelheid berekenen of geef de framesnelheid handmatig aan (opnamesnelheid: 30 fps).
  11. Herhaal de procedure voor het maken van videobestanden op alle computers.
  12. Introduceer de proefpersonen één voor één op de bodem van elke experimentele tank. Alle tests worden in één keer uitgevoerd.
  13. Start de records snel door op Record te klikken en wacht tot het maximale aantal gevraagde frames is verkregen (stap 3.10).
  14. Zodra de video's zijn opgenomen, verschijnt er een chatbox met de boodschap Maximaal aantal frames bereikt!. Selecteer Accepteren.
  15. Selecteer Sluiten om de opname te beëindigen en het videobestand te sluiten.
  16. Verwijder de vissen die zojuist zijn waargenomen. Zorg ervoor dat je ze scheidt van de naïeve vissen.
  17. Selecteer direct Maken en herhaal het proces om door te gaan met het opnemen van video's.
  18. Zodra alle opnamen zijn voltooid, selecteert u Afsluiten.
  19. Om de camera's uit te schakelen, selecteert u Camera sluiten en het programma afsluiten .

4. Analyse van opgenomen video's

  1. Start de analysesoftware (zie Tabel met materialen).
  2. Om een nieuwe sjabloon uit te werken, klikt u op Nieuw van sjabloon > een vooraf gedefinieerde sjabloon toegepast > van videobestand en selecteert u een video om te beginnen met het instellen van de sjabloon. Probeer een representatieve video van het experiment te kiezen met een proefpersoon die een goede mobiliteit en goede opnameomstandigheden vertoont.
  3. Configureer in Parameters de parameters in de volgende vensters (1 tot 4/7). Selecteer het model Fish > Adult Zebrafish, de arena Open Field Square > One Arena, het aantal Subject per Arena (voor de ST is een multi tracking pakket [volg verschillende onderwerpen in één arena] vereist), het type Detectie door Center-Point en pas tot slot de framerate aan naar 30 fps. Wijzig in de volgende vensters (5 tot 7/7) geen parameters; standaardconfiguratie is OK.
  4. Geef het experiment een naam als sjabloon en plaats het in dezelfde map als de rest van de opgeslagen video. De sjabloon wordt gemaakt als een experimentmap met verschillende onderverdelingen die alle instellingsinformatie bevatten.
  5. Controleer onder Experimentinstellingen de gedefinieerde instellingen (van videobestand, arena, aantal onderwerpen, frame per seconde). Hier kunnen de systeemeenheden worden gewijzigd.
  6. Klik onder Arena-instellingen met de rechtermuisknop op het midden van het scherm en selecteer Grijpen. Van Bestand in het display. Kies een videobeeld van goede kwaliteit en accepteer om dit beeld vast te leggen voor de achtergrondinstellingen. Kalibreer eerst de afbeelding en genereer een gekalibreerde regel. Gebruik de breedte van de tank als schaal (19 cm). Teken vervolgens de arena. Zorg ervoor dat u het vierkant net genoeg maakt om de reflecties van het dier te voorkomen wanneer het het oppervlak nadert of eventuele verwarring van de vissoftware met de zwarte gebieden van het aquarium. Teken ten slotte de vormzones met de functie Kader .
    1. Verdeel voor NTT en ST de voorkant van de tank in twee gelijke virtuele zones, boven en onder (zie afbeelding 1). Teken twee gelijke horizontale vakken. Dozen bestrijken een halve arena voor elk. Geef de boven- en onderkant een naam voor respectievelijk de bovenste en onderste zones. Zorg ervoor dat de vakken dezelfde breedte (9-10 cm) en lengte (8-9 cm) hebben, de grenzen van de arena (oranje vierkant) niet overschrijden en elkaar niet overlappen, en controleer of elke pijlzone precies zijn zones aangeeft.
    2. Voor SPT verdeel je de experimentele arena conceptueel in drie zones van gelijke grootte: leeg, gecentreerd en conspecifiek (zie figuur 1). Teken drie gelijke verticale vakken. Noem de doos die op de ondieptetank is georiënteerd als Conspecifiek, de doos die op de lege tank is georiënteerd als Leeg en de middelste als Midden. Zorg ervoor dat de dozen dezelfde breedte (6 cm) en lengte (18-19 cm) hebben, de arenalimieten niet overschrijden en elkaar niet overlappen.
  7. Controleer onder Detectie-instellingen welke video moet worden behandeld in het videobestand. Controleer vervolgens de detectiekwaliteit (vis in geel, rood middelpunt). Klik op Auto Detect om de detectie aan te passen en het dier opnieuw scherp te stellen (kies een afbeelding waarin het dier zwemt profiel op de witte achtergrond, teken de foto door zijn hele lichaam te nemen en valideer de detectie met Ja). Open Geavanceerd om de detectie te verbeteren door Dynamisch aftrekken, Donkerder onderwerp, Achtergrondinstellingen, Achtergrondonderwijs, Onderwerpgrootte, Ruisonderdrukking, enz. te selecteren.
  8. Plaats onder Proefversie-instellingen één proefversie en verwijder de andere (klik met de rechtermuisknop en verwijder)
  9. Maak onder Gegevensinstellingen dialoogvensters voor resultaten. Parametriseren van resultaten per tijd en per zone. Maak bijvoorbeeld een resultatenvenster voor gegevensuitvoer in minuten en een ander venster voor gegevensuitvoer op basis van totale tijd (6 minuten). Vraag de gegevensuitvoer voor elke zone op (vraag deze aan als de afstand in elke zone nodig is). Koppel de verschillende resultatenvensters met pijlen aan het startvenster.
  10. Selecteer onder Analyse-instellingen de parameters die u wilt analyseren en het type statistieken voor elke parameter. Deze parameters worden automatisch berekend op basis van de gegevens die uit de tracking zijn verkregen.
    1. Selecteer voor NTT en SPT de opties zoals hieronder gedefinieerd:
      1. Selecteer Verplaatste afstand (selecteer Totaal) om de afgelegde afstand in de arena (cm) en de afgelegde afstand in de respectievelijke zones (cm) te verkrijgen.
      2. Selecteer In Zones (selecteer Zones, Frequentie, Cumulatief en Latentie tot eerst) om de tijd die in de zone(s) wordt doorgebracht en de latentie tot de eerste toegang in de zone(s) weer te geven.
      3. Selecteer Zoneovergang (selecteer Drempel: 0 cm, Zone 1 toevoegen > Zone 2; Zone 2 > Zone 1, in alle zones, Frequentie) om het aantal ingangen in de zones te verkrijgen.
      4. Selecteer Mobility Sate (vul in Hoog mobiel boven 70%, Immobiel onder 3%, minimaal 150 frames en selecteer frequentie, cumulatief en latentie eerst) om de duur van hypermobiliteit (s), de duur van bevriezing (s) te hebben.
        OPMERKING: Zie de sectie Discussie voor meer informatie over de benadering van bevriezingsgedrag met behulp van de geautomatiseerde analyse en het aantal en de duur(len) van bevriezingsepisodes.
      5. Selecteer Versnelling en draaihoek (selecteer frequentie en cumulatief) om het optreden van complex gedrag te evalueren, zoals darten en grillige (snelle acceleratiebewegingen).
    2. Selecteer voor de ST, naast de bovenstaande verkennende parameters, de optie Afstand tussen onderwerpen (selecteer alle onderwerpen, gemiddelde, maximum, minimum) om de gemiddelde afstand tussen vissen (cm), de gemiddelde afstand tussen de dichtstbijzijnde buur (cm) en de gemiddelde afstand tussen de verste buur te krijgen.
  11. De sjabloon is klaar voor gebruik. Sla de laatste wijzigingen op en sluit de sjabloon zonder gegevens uit de video te halen (onderhoud het sjabloonbestand; het is licht en gemakkelijk te beheren en te kopiëren). Als er meerdere softwarelicenties zijn, analyseert u de video's van dezelfde sjabloon die naar elke computer is gekopieerd.
  12. Om de sjabloon te kopiëren en te gebruiken, zijn er twee opties:
    1. Open het sjabloonbestand met de gedragsanalysesoftware, ga naar Bestand > Opslaan als om een nieuw identiek bestand te maken.
    2. Selecteer in de welkomstinterface Nieuw van sjabloon > Een aangepaste sjabloon toegepast > van videobestand (kies sjabloon. EthXV-bestand). Geef het nieuwe experiment een naam en selecteer de locatie. Het kan enkele minuten duren voordat de software de informatie uit het sjabloonbestand heeft gekopieerd.
  13. Ga naar Arena-instellingen om de sjabloon opnieuw aan te passen als de video met een andere camera is opgenomen (volg stap 4.6 en 4.7).
  14. Ga naar Detectie-instellingen of Acquisitie om te controleren welke video is geselecteerd en wijzig indien nodig het videobestand.
  15. Selecteer onder Acquisitie de optie DDS > Klaar om te beginnen. Het kan enkele minuten duren voordat de software de video heeft verwerkt.
  16. Wanneer de acquisitie is voltooid, gaat u naar Track Editor. Selecteer versnelling x16 om de verwerkte video sneller te lezen en controleer of de tracking correct is.
    OPMERKING: Soms kunnen er "verliezen" zijn in de tracking (als gevolg van reflecties of verwarring van de software zelf). Ze kunnen handmatig vanuit dit deel worden bewerkt als er maar weinig zijn; Anders verdient het de voorkeur om het hele experiment opnieuw te verwerken, waardoor de definitie van het canvas en de detectie worden verbeterd.
  17. Klik onder Statistieken op Gegevens berekenen > exporteren. Het exporteren van gegevens bevindt zich rechtstreeks in de experimentmap.
  18. Genereer en exporteer onder Trackvisualisatie of Heatmaps (klik met de rechtermuisknop, exporteer afbeelding, selecteer de map Bestanden exporteren van het experiment om deze gegevens op te slaan met het spreadsheetrapport) trackingafbeeldingen van het dier.
  19. Ga naar Bestand om het actieve experiment te sluiten en herhaal deze procedure voor de volgende video.

5. Statistische analyse

  1. Analyseer de normaliteit (Shapiro-Wilk-test) van gegevens in elke groep.
  2. Beoordeel homoscedasticiteit met de test van Levene.
  3. Gebruik eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstests van Dunnett en Tukey om verschillen tussen groepen te testen wanneer criteria van normaliteit en homoscedasticiteit niet kunnen worden afgewezen.
  4. Gebruik de Kruskal-Wallis-test gevolgd door een paarsgewijze vergelijking met behulp van de Bonferroni-correctie om verschillen tussen groepen te testen wanneer criteria van normaliteit en homoscedasticiteit worden afgewezen.
  5. Plot de gegevens met grafische software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze sectie zullen we kijken naar enkele mogelijke toepassingen van deze gedragshulpmiddelen in de neurotoxicologie van vissen. De volgende resultaten komen overeen met de karakterisering van de acute of binge-effecten van methamfetamine (METH), een recreatieve drug, en de subchronische effecten van glyfosaat, een van de belangrijkste herbiciden die in aquatische ecosystemen worden aangetroffen.

Karakterisering van een methamfetamine binge neurotoxiciteitsmodel in volwassen zebravis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kenmerkend angstgedrag dat bij NTT is waargenomen, is positief gecorreleerd met serotoninespiegels die in de hersenen zijn geanalyseerd21. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan para-chloorfenylalanine (PCPA), een remmer van 5-HT biosynthese, vertoonden vissen positieve geotaxis en verlaagde 5-HT-niveaus in de hersenen22, resultaten die sterk lijken op die verkregen met METH. Daarom suggereert de afname van de serotoninespiegels in de hersenen en de weergave van positieve geota...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door "Agencia Estatal de Investigación" van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en Innovatie (project PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz werd ondersteund door een doctoraatsbeurs (PRE2018-083513) medegefinancierd door de Spaanse regering en het Europees Sociaal Fonds (ESF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aquarium Cube vormBlau Aquaristic7782025Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision softwareNoldusEthovision XTVersie 12.0 of nieuwer
GigE cameraImaging Development SystemsUI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02GraphPad software IncGraphPad Prism 9.02 Voor Windows
IDS camera managerImaging Development Systems
LED achtergrondverlichtingQuirumedGP-G2
SPSS SoftwareIBMIBM SPSS v26
uEye Cockpit software Imaging Development Systemsversie 4.90

Referenties

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118(2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591(2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759(2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918(2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435(2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057(2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319(2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702(2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467(2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397(2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597(2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Volwassen ZebravissenGedragstestsNovel Tank TestShoaling-testSociale VoorkeurstestBlootstelling aan MethamfetamineBlootstelling aan GlyfosaatVideotrackingAngstgedrag
Beoordeling van neurotoxiciteit bij volwassen Danio rerio met behulp van een reeks gedragstests in een enkele tank
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.