Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Astrocyten en microglia spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, letselreacties en neurodegeneratieve ziekten. Deze zeer dynamische cellen vertonen snelle reacties op veranderingen in de omgeving en vertonen een aanzienlijke heterogeniteit in termen van morfologie, transcriptieprofielen en functies. Hoewel ons begrip van de functies van gliacellen bij gezondheid en ziekte aanzienlijk is verbeterd, blijft er behoefte aan in vitro, celspecifieke analyses die worden uitgevoerd in de context van beledigingen of verwondingen om verschillende celpopulaties volledig te karakteriseren. Het isoleren van cellen van de volwassen muis biedt verschillende voordelen ten opzichte van cellijnen of neonatale dieren, omdat het de analyse van cellen onder pathologische omstandigheden en op specifieke tijdstippen mogelijk maakt. Bovendien maakt de focus op ruggenmergspecifieke isolatie, met uitzondering van betrokkenheid van de hersenen, onderzoek mogelijk naar ruggenmergpathologieën, waaronder experimentele auto-immuunencefalomyelitis, ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het isoleren van astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor onmiddellijke of toekomstige analyse wordt vergemakkelijkt met mogelijke toepassingen in functionele, moleculaire of proteomische stroomafwaartse studies.
Inleiding
Astrocyten en microglia zijn veelzijdige gliacellen die een vitale rol spelen in het centrale zenuwstelsel (CZS), met verantwoordelijkheden zoals het reguleren van de neuronale functie, het bijdragen aan de ontwikkeling van het CZS, het onderhouden van de bloed-hersenbarrière en het deelnemen aan andere kritieke processen 1,2,3,4 . Naast hun rol bij het handhaven van de homeostase, spelen deze gliacellen ook een cruciale rol bij letsel- en herstelmechanismen. Microglia staan bekend om hun fagocytische, inflammatoire en migrerende eigenschapp....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd na goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, DC, VS; IACUC#2021-004). De studie maakte gebruik van mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J wild-type (WT) muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, die afkomstig waren van een commerciële leverancier (zie Tabel met materialen) en gehuisvest waren aan de George Washington University. Een overzicht van de protocolworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het rug....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De methoden die in dit protocol worden beschreven, maken het mogelijk om zuivere en levensvatbare microglia en astrocyten uit het ruggenmerg van volwassen muizen te isoleren, waardoor verschillende stroomafwaartse toepassingen mogelijk worden, waaronder in vitro functionele of histologische assays en RNA-analyse.
Een succesvolle isolatie voor in vitro studies zal resulteren in continue celproliferatie gedurende meerdere dagen. Volwassen cellen vertonen een langzamere prolifer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het isoleren van zuivere, levensvatbare primaire cellen is van het grootste belang voor het onderzoeken van de structuur en functie van specifieke celtypen. Bij de volwassen muis, met name in het ruggenmerg, brengt deze taak aanzienlijke uitdagingen met zich mee, omdat bestaande protocollen vaak niet zijn afgestemd op het volwassen ruggenmerg10,17. Dit protocol biedt een efficiënte en kosteneffectieve methode die van toepassing is op verschillende stroomafwaartse.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
We danken Castle Raley van de George Washington University Genomics Core voor RNA-analyses en Q2 Lab Solutions voor RNA-sequencing-analyses. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke [subsidienummer F31NS117085] en de Vivian Gill Research Endowment aan Dr. Robert H. Miller. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referenties
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
