Methodenartikel

Implantatiechirurgie voor stimulatie van de nervus vagus in de buik en opnamestudies bij wakkere ratten

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65896

⸱

19 januari 2024

 ,  , 
1Bionics Institute, 2Medical Bionics Department, University of Melbourne, 3Department of Otolaryngology, University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft de chirurgische techniek voor het implanteren van een elektrode-array op de abdominale nervus vagus bij ratten, samen met methoden voor chronische elektrofysiologische tests en stimulatie met behulp van het geïmplanteerde apparaat.

Samenvatting

Abdominale nervus vagus stimulatie (VNS) kan worden toegepast op de subdiafragmatische tak van de nervus vagus bij ratten. Vanwege de anatomische locatie heeft het geen respiratoire en cardiale off-target effecten die gewoonlijk worden geassocieerd met cervicale VNS. Het ontbreken van off-target effecten op de ademhaling en het hart betekent dat de intensiteit van de stimulatie niet hoeft te worden verlaagd om bijwerkingen te verminderen die vaak worden ervaren tijdens cervicale VNS. Er zijn maar weinig recente studies die de ontstekingsremmende effecten van abdominale VNS aantonen in rattenmodellen van inflammatoire darmaandoeningen, reumatoïde artritis en glycemievermindering in een rattenmodel van diabetes type 2. Rat is een geweldig model om het potentieel van deze technologie te verkennen vanwege de gevestigde anatomie van de nervus vagus, de grote omvang van de zenuw die gemakkelijk te hanteren is en de beschikbaarheid van veel ziektemodellen. Hier beschrijven we de methoden voor het reinigen en steriliseren van de abdominale VNS-elektrode-array en het chirurgische protocol bij ratten. We beschrijven ook de technologie die nodig is voor de bevestiging van supradrempelstimulatie door het registreren van evoked compound action potentials. Abdominale VNS heeft het potentieel om selectieve, effectieve behandeling te bieden voor een verscheidenheid aan aandoeningen, waaronder ontstekingsziekten, en de toepassing zal naar verwachting op dezelfde manier worden uitgebreid als cervicale VNS.

Inleiding

Nervus vagus stimulatie (VNS) toegediend op de cervicale plaats in de nek is door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde behandeling voor refractaire epilepsie, refractaire depressie en revalidatie na ischemische beroerte1, en door de Europese Commissie goedgekeurd voor hartfalen in Europa2. Niet-invasieve cervicale VNS is door de FDA goedgekeurd voor migraine en hoofdpijn1. De toepassing ervan zal naar verwachting toenemen, met recente klinische onderzoeken die de werkzaamheid van VNS aantonen bij andere indicaties zoals de ziekte van Crohn3, reumatoïde artritis 4,5 en verminderde glucosetolerantie en diabetes type 2 6,7. Hoewel veelbelovend, kan cervicale VNS bradycardie en apneu veroorzaken als gevolg van off-target activering van de zenuwvezels die de longen en het hart innerveren 8,9,10. Bijwerkingen zoals hoesten, pijn, stemverandering, hoofdpijn en verhoging van de apneu-hypopneu-index worden vaak gemeld bij patiënten die cervicale VNS11,12 krijgen. Vermindering van de stimulatiesterkte is een gebruikelijke strategie om deze bijwerkingen te verminderen, maar een verminderde lading kan de werkzaamheid van VNS-therapie beperken door therapeutische vezels niet teactiveren11. Ter ondersteuning van deze hypothese was het responderpercentage van patiënten die stimulatie met hoge intensiteit kregen voor de behandeling van epilepsie hoger dan dat van patiënten die stimulatie met lage intensiteit kregen13.

Abdominale VNS wordt aangebracht op de subdiafragmatische nervus vagus, boven de lever- en coeliakietakken14 (Figuur 1). Onze vorige studie toonde aan dat abdominale VNS bij ratten geen cardiale of respiratoire bijwerkingen veroorzaakt die verband houden met cervicale VNS10. Eerdere studies tonen ook ontstekingsremmende effecten van abdominale VNS aan in een rattenmodel van inflammatoire darmaandoeningen en reumatoïde artritis 10,15, evenals vermindering van glycemie in een rattenmodel van diabetes type 216. Onlangs is de abdominale VNS-technologie vertaald voor een eerste klinische studie bij mensen voor de behandeling van inflammatoire darmaandoeningen (NCT05469607).

De perifere zenuwelektrode-array die wordt gebruikt om stimulatie toe te dienen aan de abdominale nervus vagus (WO201909502017) is op maat ontwikkeld voor gebruik bij ratten en bestaat uit twee tot drie platina-elektrodeparen die 4,7 mm uit elkaar zijn geplaatst, ondersteund door een manchet van siliconenelastomeer van medische kwaliteit, een hechtlipje om de array aan de slokdarm te verankeren, een geleidingsdraad en een percutane connector die op het lumbale gebied moet worden gemonteerd (Figuur 2). De looddraad wordt aan de linkerkant van het dier onder de huid getunneld. Het ontwerp van meerdere elektrodeparen maakt elektrische stimulatie van de zenuw mogelijk, evenals het registreren van elektrisch opgewekte samengestelde actiepotentialen (ECAP's), wat de juiste plaatsing van het implantaat op de zenuw en de stimulatie-intensiteiten boven de drempel bevestigt. Abdominale VNS wordt maandenlang goed verdragen bij vrij bewegende ratten 10,15,16. Dit maakt het mogelijk om de werkzaamheid ervan op ziektemodellen te beoordelen.

Dit manuscript beschrijft de methoden voor de sterilisatie van de elektrode-array, implantatiechirurgie van de nervus vagus abdominaal en chronische stimulatie en registratie van ECAP's bij wakkere ratten voor het bestuderen van de werkzaamheid van abdominale VNS in verschillende ziektemodellen. Deze methoden zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor het bestuderen van de werkzaamheid van abdominale VNS in het rattenmodel van inflammatoire darmaandoeningen10 en zijn ook met succes gebruikt voor een rattenmodel van reumatoïde artritis15 en diabetes16.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het St. Vincent's Hospital (Melbourne) en voldeden aan de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (National Health and Medical Research Council of Australia) en de Prevention of Cruelty to Animals (1986) Act. In totaal werden 24 vrouwelijke Dark Agouti-ratten (8-9 weken oud) gebruikt voor dit onderzoek. De experimentele groepen bestonden uit: een normaal cohort (n = 8) dat geen collageeninjectie of VNS-implantaat kreeg; een niet-gestimuleerd ziektecohort (n = 8) dat een implantaat en een collageeninjectie kreeg (geen elektrofysiologische tests uitgevoerd); en een gestimuleerd ziektecohort (n = 8) dat een implantaat, een collageeninjectie, elektrofysiologische tests en VNS-therapie kreeg. De implantatieoperatie vond 5 dagen voorafgaand aan de collageeninjectie plaats en de gewenning aan VNS-therapie begon 4 dagen na de collageeninjectie en vond plaats gedurende 7 dagen. VNS-therapie werd toegepast van dag 11 tot en met dag 17 na collageeninjectie15. Voor het gestimuleerde ziektecohort werd elektrofysiologisch onderzoek uitgevoerd onmiddellijk na de implantatieoperatie onder anesthesie, op de dag van collageeninjectie, 10 dagen na collageeninjectie en de dag van beëindiging (17 dagen na collageeninjectie).

1. Sonicatie en sterilisatie van elektrode-array

  1. Stel de ultrasoonreiniger in op een frequentie van 80 kHz en vul de ultrasone tank met kraanwater. Dompel de elektrode-array onder in de reinigingsoplossing in een schone plastic container en plaats deze in de ultrasone tank.
    NOTITIE: De reinigingsoplossing en de sonicatietijd die voor elke stap moeten worden gebruikt, zijn samengevat in tabel 1. Gebruik voor elke stap een schone container.
  2. Plaats de gesoniseerde elektrode-array in een sterilisatiezak met behulp van een schone pincet, gesoniseerd met 0.5% vloeibare reinigingsoplossing in gedestilleerd water en gespoeld in gedestilleerd water. Autoclaaf de elektrode-array gedurende 45 minuten met een maximale temperatuur van 130 °C en laat deze drogen op een schone bank.

2. Implantatie van elektrode-array op de abdominale nervus vagus

OPMERKING: In deze studie hebben we vrouwelijke donkere agouti-ratten gebruikt (8-9 weken oud)15. We hebben dit protocol ook met succes gebruikt om volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten (10-14 weken oud) chronisch te implanteren10,16. Chirurgie wordt uitgevoerd onder aseptische omstandigheden en alle instrumenten, elektrode-array en verbruiksartikelen zoals gaas en wattenstaafjes worden gesteriliseerd door middel van autoclaveren.

  1. Verdoof de rat in een inductiekamer met 3% isofluraan en 1 l/min zuurstof. Zodra er geen pedaalreflex is om de teen te knijpen, verplaats je de rat naar de warmtemat met een thermostaat op de operatietafel en plaats je een isofluraanmasker over de neus.
  2. Bewaak de ademhalingsfrequentie en rectale temperatuur tijdens de operatie en pas het isofluraanniveau aan tussen 1,5% en 2,5% om de ademhalingsfrequentie tussen 40 en 62 ademhalingen per minuut te houden. Pas indien nodig de instelling van de warmtemat aan om het rectale temperatuurbereik tussen 35.9 - 37.5 °C te behouden.
  3. Dien vóór de operatie vóór de operatie subcutaan analgesie toe met behulp van spuiten van 1 ml met naalden van 25 G (carprofen 5 mg/kg en buprenorfine 0,03 mg/kg subcutaan).
  4. Scheer royaal rond de incisieplaats, inclusief het gebied langs de ventrale middellijn van de processus xyphoid tot het einde van de ribbenkast, het lumbale aspect van de rug langs de dorsale middellijn en de linkerkant van het lichaam tussen de voorpoot en de achterpoot om onderhuidse tunneling van de array mogelijk te maken.
  5. Reinig de operatieplaatsen drie keer in een cirkelvormige beweging met afwisselend rondjes betadine en alcohol en leg een chirurgisch laken over het dier. Dien bupivacaïne (1-2 mg/kg) subcutaan toe met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 25 G op de dorsale en ventrale incisieplaatsen.
  6. Plaats het dier in buikligging en maak een 2 cm lange incisie op de rug waar de percutane sokkel wordt verankerd met een scalpelmesje.
  7. Draai de rat naar dorsale ligplaats en maak een incisie van 3 cm op de huid langs de middellijn net onder de processus xyphoid met behulp van een scalpelmesje. Houd de huid in de buurt van de incisieplaats omhoog en ontleed met een ontleedschaar de huidlaag van de spierlaag rond de incisie.
  8. Om subcutane tunneling van de array van het voetstuk naar de plaats van implantatie mogelijk te maken, plaatst u het dier op zijn rechterzij, brengt u een hemostaat in vanaf de ventrale incisie en ontleedt u de stompe dissectie in de richting van de dorsale incisieplaats. Snijd de rand van een naalddop af en plaats de elektrode-array om deze tijdens het transport te beschermen (Figuur 1B). Gebruik de handen (draag steriele handschoenen) om de elektrodereeks onder de huid naar de ventrale incisie te tunnelen.
  9. Om toegang te krijgen tot de slokdarm en de nervus vagus, legt u het dier weer in dorsale ligligging. Maak een incisie van 3 cm op de spierlaag langs de middellijn onder de processus xyphoid, groot genoeg om de hele lengte van de lever bloot te leggen. Voorkom beschadiging van de lever tijdens deze stap.
  10. Maak een kleinere incisie (minder dan 1 cm) op de spierlaag lateraal (de linkerkant van het dier) tot aan de belangrijkste ventrale incisie. Tunnel de elektrode-array door deze kleine incisie met behulp van de naalddop die in stap 2.8 is gebruikt om de array in de buikholte te plaatsen.
    NOTITIE: Deze stap vermindert de spanning die wordt uitgeoefend op de hoofdincisieplaats en vermindert het risico op het barsten van hechtingen.
  11. Trek de huid- en spierlagen terug om de buikholte open te houden. Zorg ervoor dat u de weefsels vochtig houdt door wattenstaafjes en gaas gedrenkt in steriele zoutoplossing te gebruiken om het weefsel te hanteren.
  12. Trek de lever voorzichtig terug door het bindweefsel eromheen door te knippen met een Vannas-schaar en een oprolmechanisme over een klein stukje gaas gedrenkt in zoutoplossing te plaatsen ter bescherming. Trek de maag voorzichtig terug, om de slokdarm en de bovenliggende nervus vagus recht te trekken, door een retractor tussen de slokdarm en de maag te plaatsen.
    NOTITIE: Oprolmechanismen worden gemaakt door het puntige uiteinde van vishaken af te ronden.
  13. Identificeer na blootstelling van het ventrale oppervlak van de slokdarm de abdominale nervus vagus en zijn subtakken, waaronder de leverzenuw, de nervus coeliakie en twee maagtakken (Figuur 1D).
  14. Knip het bindweefsel door waarmee de nervus vagus in de buik aan de slokdarm is bevestigd met een fijne pincet en een Vannas-schaar en ontleed de lengte van de zenuw van net boven de lever- en coeliakietakken naar het middenrif. Zorg ervoor dat u de zenuw niet scheurt, uitrekt of beknelt. Plaats een elektrode-array naast de zenuw om te bevestigen dat er voldoende lengte van de zenuw is gescheiden van het bindweefsel om in de array te passen.
  15. Nadat het bindweefsel rond de zenuw is verwijderd, passeert u de zijden hechtingen (7-0) aan de elektrodezijde van de array-manchet onder de zenuw. Open de manchet van de array en plaats de zenuw voorzichtig in het arraykanaal.
  16. Zorg ervoor dat de volledige lengte van de zenuw zich in het arraykanaal bevindt. Bind de hechtingen rond de manchet aan elkaar om de manchet stevig te sluiten om ervoor te zorgen dat de zenuw niet uit het kanaal glijdt. Knip de hechtingen af.
  17. Gebruik 7-0 zijden hechting om het lipje van de array op de slokdarm te hechten om de array op zijn plaats te houden en te voorkomen dat deze draait. Vermijd beschadiging van de andere takken van de nervus vagus of het te diep inbrengen van de naald in de gladde spier van de slokdarm.
  18. Verwijder voorzichtig de oprolmechanismen en zorg ervoor dat al het gaas uit de buikholte is verwijderd. Dien 1-2 ml warme steriele zoutoplossing toe met behulp van een spuit van 1 ml in de buikholte en plaats de lever in de juiste positie.
  19. Sluit de spierlaag met 3-0 zijden hechting met behulp van de eenvoudige lopende hechtdraadtechniek, waarbij veilige vierkante knopen worden gemaakt met ten minste 3 worpen aan beide uiteinden. Ruimte dicht bij elkaar (ongeveer 3 mm uit elkaar) om complicaties zoals hernia/uitsteeksel van de processus xyphoid te voorkomen.
  20. Gebruik een hechtdraad om de incisie van het buikvlies samen met de incisie van de spierlaag te sluiten, om de kans op weefselverkleving te verkleinen.
  21. Sluit met behulp van een resorbeerbaar hechtmateriaal (Vicryl 4-0) de incisie in de huid. Gebruik een begraven hechttechniek, zoals de lopende begraven verticale matrashechting of de lopende begraven dermale hechting om te voorkomen dat het dier de hechting verwijdert.
  22. Draai het dier naar ventrale lighouding en verleng met een schaar de dorsale incisie tot 4-5 cm en ontleed de stompe dissectie tussen de spier en de huidlaag verder, zodat de connectorbasis van de percutane connector plat op de spierlaag kan zitten.
  23. Maak met behulp van zijden 3-0 hechting 6 tot 8 eenvoudige onderbroken hechtingen rond de connectorbasis om deze aan de onderliggende spierlaag te bevestigen. Sluit de huidincisie met zijde 3-0 hechting, met behulp van de horizontale matrashechtingstechniek, en zorg voor veilige vierkante knopen met ten minste 3 worpen.
    OPMERKING: In deze stap wordt de voorkeur gegeven aan gevlochten zijden hechtingen vanwege hun gebruiksgemak en hun vermogen om veiligere knopen te creëren in vergelijking met monofilamenthechtingen.
  24. Aan het einde van de operatie Hartmann's oplossing subcutaan toedienen (1 ml/100 g/uur). Schakel de isofluraan uit en laat het dier herstellen op een warmtemat terwijl het zuurstof laat lopen (1,5 L/min). Zodra de rat bij bewustzijn en volledig mobiel is, brengt u de rat terug naar zijn thuiskooi, geplaatst op een warmtekussen, totdat hij volledig hersteld is van de verdoving.
  25. Houd het herstel van het dier van isofluraan nauwlettend in de gaten en zorg ervoor dat het dier toegang heeft tot eten en drinken. Zorg in de volgende twee dagen voor subcutane toediening van postoperatieve analgesie (carprofen 5 mg/kg, dagelijks) om de pijn te verlichten. Controleer het dier minstens 2x per dag en controleer op tekenen van ontlasting, kwaliteit van de vacht, activiteitsniveau en aanwezigheid van zwelling of afscheiding uit de chirurgische wonden.
  26. Noteer het gewicht van het dier en in het zeldzame geval dat het dier 10% of meer verliest, start dan een intensieve behandeling. De intensieve behandeling omvat subcutane toediening van vloeistoffen (Hartmann's oplossing, 2x 10 ml) per dag, het verstrekken van extra voedsel zoals verse groenten en voedingsgelsupplementen, en het plaatsen van de helft van de kooi op een warmtekussen met een thermostaat voor extra warmte. Verhoog de frequentie van de monitoring totdat het dier herstelt. Ga door met toediening van analgesie (carprofen 5 mg/kg, SQ, dagelijks) indien nodig op basis van een Grimace-schaal.

3. Elektrofysiologisch onderzoek

NOTITIE: Het registreren van Evoked Compound Action Potentials (ECAP's) bevestigt de juiste plaatsing van de elektrode-array op de nervus vagus. Bovendien biedt de registratie van ECAP's met behulp van de hierboven beschreven elektrode-array een waarschijnlijke bevestiging van elektrische activering van vagale C-vezels en VNS10,15 boven de drempelwaarde.

  1. Meet de gemeenschappelijke aardimpedantie van elektroden om hun integriteit te beoordelen en eventuele open of kortsluiting van draden te detecteren voordat ECAP's worden geregistreerd. Functionerende abdominale nervus vagus elektroden in vivo moeten impedantiewaarden hebben tussen 4 - 20 kΩ.
  2. Test dieren terwijl ze onder narcose zijn, d.w.z. onmiddellijk na de operatie, of wakker en vrij bewegend. Voer ten minste 2-3 dagen na de operatie wakkere tests uit om de chirurgische huidwonden te laten genezen en stabiliseren. Verzamel de apparatuur die nodig is voor impedantie- en elektrofysiologische tests, waaronder een op maat gemaakte stimulator, een apparaat voor gegevensverzameling, een geïsoleerde differentiële versterker en software voor gegevensverzameling en -analyse, zoals vermeld in de materiaaltabel.
  3. Wikkel het dier indien nodig in een handdoek, sluit een kabel aan op de percutane connector aan de achterkant en sluit het andere uiteinde van de kabel aan op een stimulator. Om de gemeenschappelijke aardimpedantie van elektroden te testen, past u bifasische stroompulsen (100 μs per fase en stroom van 107 μA) toe tussen de betreffende elektrode en alle andere elektroden op de array.
  4. Meet de piekspanning aan het einde van de eerste fase van de spanningsgolfvorm (Vtotaal) en bereken de totale impedantie (Ztotaal) met behulp van de wet van Ohm (Z = spanning/stroom).
  5. Sluit een paar elektroden aan op de stimulator en een paar elektroden op het opnameapparaat en pas bipolaire stimulatie toe om ECAP's te genereren met behulp van de referentie-elektrode van het VNS-implantaat dat onder de huid is geplaatst als referentie voor de differentiële registratie van ECAP's. Maak twee sets opnames gemiddeld van in totaal 50 herhalingen met behulp van de data-acquisitie- en analysesoftware.
  6. Gebruik de volgende instellingen voor metingen.
    Stromen: 0 tot 2 mA in stappen van 0,1 mA;
    Pulsbreedte: 25 - 200 μs;
    Interfase-tussenruimte: 8 - 50 μs;
    Stimulatiesnelheid: 10 - 30 pulsen/s;
    Bemonsteringsfrequentie: 100 kHz;
    Filter: Hoogdoorlaat 200 Hz, laagdoorlaat 2000 Hz, spanningsversterking 1 x 102.
  7. Analyseer met behulp van de data-analysesoftware de ECAP-respons door de piek-tot-piekspanning van de golfvormen binnen het analysevenster te meten (4 - 10 ms post-stimulus, aangegeven door arcering in figuur 3A,B). ECAP-drempel wordt gedefinieerd als de minimale stimulusstroomintensiteit die een responsamplitude van ten minste 0,1 μVpiek-piek produceert in beide sets van gemiddelde elektrofysiologische opnamen. Een geldig antwoord wordt herhaald voor ten minste twee stroomniveaus boven de drempel en niet aanwezig voor ten minste twee stroomniveaus onder de drempel10,15.

4. Chronische abdominale VNS bij wakkere ratten

OPMERKING: Abdominale VNS kan worden toegepast op wakkere dieren zodra de chirurgische wond rond de percutane connector is genezen en gestabiliseerd. Om eventuele stressrespons te verminderen en een betere gegevensverzameling mogelijk te maken, worden de dieren gewend aan de hanterings- en stimulatieomgeving van de testers, één uur per dag gedurende zeven dagen voorafgaand aan de implantatieoperatie en het begin van de VNS-therapie.

  1. Meet de impedantie van elke elektrode zoals beschreven in stap 3.4, voordat u een VNS aanbrengt. Zorg ervoor dat de impedantie van stimulerende elektroden lager is dan 20 kΩ.
  2. Sluit een kabel aan op de percutane connector aan de achterkant en sluit het andere uiteinde van de kabel aan op een stimulator die is geprogrammeerd om de juiste stimulatie toe te passen (bijv. 27 Hz, 1.6 mA, 200 μs pulsbreedte met 50 μs interfasetussenruimte, 30 s AAN, 2.5 min uit15), en zet de stimulator aan.
    NOTITIE: Hoewel dieren vaak in slaap vallen tijdens stimulatie als ze op de juiste manier gewend zijn, gebruik dan waar mogelijk een kabel met beschermend buitenmateriaal zoals stalen spoelen om te voorkomen dat erop wordt gekauwd.
  3. Observeer het dier aan het begin van elke VNS-therapiesessie om er zeker van te zijn dat er geen bijwerkingen optreden, zoals overmatige verzorging of plotselinge toename/afname van het activiteitsniveau, synchroon met de timing van de stimulatie.
  4. Controleer elke 30 minuten om te controleren op verdraaien of loskoppelen van de kabel. Om VNS chronisch toe te passen (bijv. 3 uur per dag gedurende 7 dagen15), herhaalt u stap 4.1-4.3 aan het begin van elke sessie.
    NOTITIE: Het gebruik van een collector kan de kans verkleinen dat kabels verdraaid raken en vereist mogelijk minder frequente controle.

Resultaten

Het registreren van evoked compound action potentials (ECAP's, figuur 3A,B) onmiddellijk na de operatie is een techniek die kan worden gebruikt om de juiste plaatsing van de zenuw in het arraykanaal te bevestigen, en dat stimulatie effectief is bij het activeren van de nervus vagus.

In figuur 3 werden vrouwelijke donkere agouti-ratten (8-9 weken oud) geïmplanteerd met de VNS-elektrode-array. Bij ratten die willekeurig werden geselecteerd om therapeutische stimulatie te krijgen, werden ECAP's geregistreerd onmiddellijk na de operatie (dag 0, figuur 3A) en aan het einde van de VNS-therapiesessie (dag 23, figuur 3B). De aanwezigheid van ECAP's (figuur 3B) gaf aan dat de stimulatie-intensiteit boven de neurale drempel lag en dat de zenuw met succes was geactiveerd. Dieren in de VNS-behandelingsgroep werden uitgesloten als ECAP's niet werden geregistreerd, omdat er geen garantie was dat de stimulatie met succes werd toegediend15. De latentie van de neurale respons (Figuur 3A,B, aangegeven met een groene pijl) kan worden gebruikt om te beoordelen welke klasse vezels werd geactiveerd.

In eerdere studies hebben we waargenomen dat de meeste neurale reacties meestal optreden tussen 4 ms en 10 ms10,15. Aangezien de afstand tussen stimulerende en registrerende paren 4,7 mm is, is de geschatte geleidingssnelheid van dit responsvenster 0,47 - 1,2 m/s, wat consistent is met de geleidingssnelheid van C-vezels18.

Er is een toename van de neurale drempel tussen dag 0 (377 μA, figuur 3A) en dag 23 (1335 μA, figuur 3B), die in de loop van de tijd optreedt, waarschijnlijk als gevolg van lichte goedaardige fibrose die zich vormt rond de weefsel-elektrode-interface10,15.

Figuur 3C gaf de experimentele testopstelling en de positionering van de backconnector weer, die stabiel bleef voor de duur van de testperiode van 3 weken15.

figure-results-1
Figuur 1: Plaatsen voor cervicale VNS en abdominale VNS. (A) Cervicale VNS wordt aangebracht boven de vertakkingen naar het hart en de luchtwegen, en abdominale VNS wordt aangebracht onder deze takken. (B) De elektrode-array wordt in een naalddop gestoken (met de rand verwijderd) om deze te beschermen tijdens het tunnelen onder de huid. (C) De abdominale VNS-array van ratten wordt geïmplanteerd en vastgezet met hechtingen (D) boven de coeliakie- en levertakken onder het middenrif. Afkortingen: VN = nervus vagus, b. = tak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Rat VNS-array. (A) Een rat VNS-array bestaat uit een percutane connector en een elektrode-array die met elkaar zijn verbonden door een geleidingsdraad. (B) Een lipje in de buurt van de elektrode-array kan aan de slokdarm worden gehecht om de positie van de array te helpen stabiliseren. De standaard abdominale nervus vagus array van ratten wordt geleverd met twee elektrodeparen (E1 en E2, en E3 en E4). Beide elektrodeparen kunnen worden gebruikt voor stimulatie of opname. De percutane connector wordt op het houtgebied van het dier gemonteerd en de geleidingsdraad wordt aan de linkerkant van het dier onder de huid getunneld. De referentie-elektrode langs de geleidingsdraad wordt onder de huid aan de linkerkant van het dier geplaatst zodra de elektrode-array is geïmplanteerd. De elektrode-array wordt geïmplanteerd op de nervus vagus langs de slokdarm boven de maag en net onder het middenrif. (C) De extra lengte van de geleidingsdraad aan de linkerkant van het dier onder de huid zorgt voor een verlichting van de trek. Afkortingen: E = elektrode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Typische elektrofysiologische sporen geregistreerd van de abdominale nervus vagus tijdens chronische implantatie en een rat die VNS-therapie krijgt. (A) Elk elektrofysiologisch spoor is gemiddeld 25 herhalingen. De groen gearceerde vakjes geven de typische latentie van C-vezelrespons in de abdominale nervus vagus van de rat aan, tussen 4 ms en 10 ms (met behulp van een elektrode-array met een afstand van 4,7 mm tussen stimulerende en registrerende elektrodeparen, van midden op hart). ECAP's zijn gelabeld met groene pijlpunten. (B) Een rat die VNS-therapie krijgt via de percutane connector op zijn rug in de thuiskooi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ReinigingsoplossingSonicatie tijd
1. 0,5% pyroneg in ultrapuur water15 min
2. Ultrapuur water5 min
3. Ultrapuur water5 min
4. 96% ethanol10 min
5. Ultrapuur water5 min
6. Ultrapuur water5 min

Tabel 1: Sonicatiestappen. De tabel geeft details over de sonicatie die hier wordt uitgevoerd.

Discussie

Deze methode van abdominale VNS-implantaatchirurgie en chronische stimulatie van de nervus vagus en registratie van ECAP's is met succes gebruikt en goed verdragen gedurende 5 weken bij ratten na implantatie 10,15,16. Terugtrekking van de maag, lever en darmen om een goed zicht te krijgen op de slokdarm en de nervus vagus is een van de belangrijkste stappen in de operatie. Zodra deze organen zijn ingetrokken, wordt de nervus vagus toegankelijk. Het terugtrekken van de maag kan de ademhaling in gevaar brengen, in welk geval het oprolmechanisme wordt losgemaakt. Bovendien moet bij het doorsnijden van het bindweefsel rond de slokdarm om toegang te krijgen tot de nervus vagus, ervoor worden gezorgd dat schade aan het middenrif wordt voorkomen, wat kan leiden tot verstoring van de intrathoracale druk, ernstige ademhalingsonderdrukking en de dood van het dier tijdens de operatie. Het wordt aanbevolen om het bindweefsel rond de slokdarm net genoeg te verwijderen om de elektrodereeks boven de lever- en coeliakietakken te plaatsen.

Mogelijke postoperatieve complicaties zijn onder meer weefseladhesie rond de slokdarm, hernia en postoperatieve ileus. Weefseladhesie kan worden geminimaliseerd door royale toepassing van steriele zoutoplossing in de buikholte tijdens de operatie en voorafgaand aan het sluiten van de buikholte. Hechting die de peritoneumlaag samen met de spierlaag sluit, zou ook moeten helpen de inwendige organen te beschermen en weefseladhesie te verminderen. Omdat de lever gemakkelijk gekneusd raakt en manipulatie van de darm postoperatieve ileus kan veroorzaken, is een minimale en zachte behandeling van deze organen belangrijk. Ten slotte is het, vooral bij zwaardere dieren, van cruciaal belang dat lopende hechtingen dicht bij elkaar worden geplaatst of dat in plaats daarvan onderbroken hechtingen worden gebruikt bij het sluiten van de buikholte om hernia en uitsteeksel van het xyfoïde proces te voorkomen.

Als standaard postoperatieve zorg moeten dieren na de operatie regelmatig worden gecontroleerd op tekenen van ontlasting, gewichtsverandering, vacht, activiteitsniveau en aanwezigheid van zwelling of afscheiding uit de chirurgische wonden. In zeldzame gevallen kunnen overmatige afscheiding, roodheid en zwelling rond chirurgische wonden optreden, wat wijst op een infectie. Bij dergelijke gelegenheden worden antibiotica zoals Baytril (0,2 mg/ml, in drinkwater gedurende 3-5 dagen) toegediend totdat de infectie is verdwenen. Terwijl normale ratten over het algemeen goed herstellen van de operatie, kunnen ratten met gecompromitteerde gezondheidsproblemen (d.w.z. ziektemodellen) meer tijd nodig hebben voordat het testen en de stimulatie na de operatie kunnen beginnen. Passende postoperatieve zorg (zoals samengevat in stap 2.26) voor dergelijke dieren is essentieel voor het welzijn van de dieren.

Een van de beperkingen van dit protocol is dat, hoewel het ontwerp van de VNS-elektrode-array van de rat uitstekend geschikt is voor het registreren van een langzamere C-vezelrespons, de afstand tussen de elektrodeparen (4,7 mm) mogelijk niet geschikt is voor het vastleggen van activiteit van sommige van de snellere vezeltypen. Hoewel de totale lengte van de array wordt beperkt door de beschikbare lengte van de subdiafragmatische nervus vagus boven de lever- en coeliakietakken, kunnen deze VNS-arrays worden gekocht met extra elektrodeparen. Dergelijke arrays kunnen worden gebruikt om de toepassing van blokkerende stimulatie te onderzoeken die de richting van VNS16,19 kan manipuleren, waardoor het mogelijke gebruik van dit model wordt uitgebreid.

Opname-ECAP's kunnen worden gebruikt om de plaatsing van de array rond de zenuw, de kwaliteit van de elektrode-interface en het vermogen van het apparaat om vagale vezels te activeren te beoordelen. De vagus is een autonome zenuw, bestaande uit 97%-99% C-vezels18,20, waarbij de resterende 1%-3% van de vezels gemyeliniseerde vezels zijn (functie onbekend), zoals bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopiestudies20. De reacties in figuur 3 zijn waarschijnlijk het gevolg van elektrisch opgewekte activiteit van de nervus vagus, in plaats van myogene activiteit, omdat ze passen bij de vorm en vorm van de samengestelde actiepotentiaal voor een perifere zenuw21,22. Bovendien is de typische geleidingssnelheid van de ECAP's van de abdominale nervus vagus van de rat 0,47 - 1,2 m/s, wat consistent is met de geleidingssnelheid van C-vezels18. In de eerste pilotstudies voor de ontwikkeling van het apparaat werden de opnames gevalideerd in verdoofde rattenstudies door de nervus vagus tussen de stimulerende en registrerende elektrode door te snijden, wat resulteerde in de eliminatie van alle opgewekte reacties (gegevens niet getoond). De elektrode-array is zo ontworpen dat de nervus vagus zich in een platina-siliconenkanaal bevindt, waardoor deze effectief elektrisch wordt geïsoleerd van omringende structuurstructuren (bijv. de slokdarm). Stimulatie en opname worden ook beide uitgevoerd met behulp van bipolaire configuraties met behulp van aangrenzende elektroden, waardoor de mogelijkheden voor verspreiding van stimulatie en besmetting van de opname verder worden geminimaliseerd. We hebben consequent vergelijkbare golfvormen gerapporteerd na elektrische stimulatie van de abdominale nervus vagus in verdoofde en wakkere preparaten 10,15,16,19,23, inclusief onderzoeken waarin fysiologische effecten van stimulatie de activering van de nervus vagus bevestigden 10,15,16. Hoewel het onmogelijk is om besmetting van de opname door myogene activiteit uit te sluiten, zijn myogene responsen meestal te onderscheiden van neurale respons vanwege hun snelle en grote groeiamplitudeprofiel24 in tegenstelling tot de graduele, kleinere groeiprofielen die zijn waargenomen in onze studies10,15 en in figuur 3A,B: Dag 0: huidig niveau 377 μA latentie: 7,24 ms > stroomniveau 1750 μA: 6,74 ms.

Hoewel is aangetoond dat de activering van de subdiafragmatische nervus vagus, die bijna volledig uit C-vezels20,25 bestaat, effectief is gebleken voor de behandeling van preklinische modellen van inflammatoire darmaandoeningen10, reumatoïde artritis15 en diabetes16, zijn de optimale abdominale VNS-parameters om het therapeutische effect ervan te maximaliseren nog niet volledig onderzocht14. Verder onderzoek naar dit onderwerp zou van groot nut zijn, aangezien de toepassing van abdominale VNS voor de behandeling van inflammatoire darmaandoeningen momenteel wordt onderzocht in een eerste klinische studie bij mensen. Aangezien het ontstekingsremmende effect van abdominale VNS als systemisch26 wordt beschouwd, is er een groot potentieel dat deze therapie ook effectief is voor andere ontstekingsaandoeningen zoals systemische lupus erythematosus27 en chronische nierziekte28.

Onze studies bij ratten tonen aan dat abdominale VNS een uniek voordeel heeft ten opzichte van cervicale VNS, in die zin dat het geen cardiale of respiratoire off-target effecten veroorzaakt10. Stimulatie met een hogere intensiteit kan gedurende langere tijd worden toegepast zonder de ademhaling of de hartslag van het dier in gevaar te brengen. In combinatie met de mogelijkheid om de opgewekte neurale respons te monitoren die de intensiteit van de supradrempelstimulatie bevestigt, biedt deze methode een geweldig model om de werkzaamheid van abdominale VNS voor de behandeling van een verscheidenheid aan ziekten te bestuderen. Naarmate de toepassing van VNS zich verder uitbreidt, zal de toepassing van deze methode van VNS naar verwachting ook toenemen.

Openbaarmakingen

Dit onderzoek werd uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict konden worden opgevat.

Dankbetuigingen

De ontwikkeling van het VNS-implantaat in de buik van ratten werd gefinancierd door het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) BTO, onder auspiciën van Dr. Doug Weber en Dr. Eric Van Gieson via het Space and Naval Warfare Systems Center (contractnr. N66001-15-2-4060). Het onderzoek in deze publicatie werd ondersteund door het Bionics Institute Incubation Fund. Het Bionics Institute erkent de steun die ze ontvangen van de Victoriaanse regering via haar Operational Infrastructurele Support Program. We willen de heer Owen Burns bedanken voor het mechanisch ontwerp, prof. John B Furness voor de anatomische expertise, prof. Robert K Shepherd voor de perifere interface, neuromodulatie en opname-expertise, mevrouw Philippa Kammerer en mevrouw Amy Morley voor het houden en testen van dieren, mevrouw Fenella Muntz en Dr. Peta Grigsby voor hun advies over postoperatieve dierenverzorging, en mevrouw Jenny Zhou en het elektrodefabricageteam van NeoBionica voor de productie van de VNS-arrays.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% salineBriemarpakSC3050
BaytrilBayer
BetadineSanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (Buprenorphine)Jurox
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6210
DietGel Boost (dietary gel supplement)ClearH2O
Dumont tweezer, style 5ProSciTechT05-822
Dumont tweezer, style N7, self-closingProSciTechEMS72864-D
Elmasonic P sonicatorElma
Hartmann's solutionBaxterAHB2323
HemostatProSciTechTS1322-140
HPMC/PAA Moisturising Eye GelAlcon
Igor Pro-8 softwareWavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)Zoetis
Isolated differential amplifierWorld Precision InstrumentsISO-80
Liquid pyronegDiverseyHH12291reinigingsoplossing
Marcaine (Bupivacaine)Aspen
Plastic drapeMultigate22-203
Rat vagus nerve implantNeo-Bionica
Rimadyl (Carprofen)Zoetis
Silk suture 3-0Ethicon
Silk suture 7-0Ethicon
SteriClave autoclaveCominox24S
Sterile disposable surgical gownZebravetDSG-S
Suicide Nickel hooksJarvis Walker
Ultrapure waterMerck MillipreMilli-Q Direct
UnderpadsZebravetUP10SM
Vannas scissorsProSciTechEMS72933-01
Vicryl suture 4-0Ethicon

Referenties

  1. Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987(2023).
  2. Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
  3. Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911(2020).
  4. Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
  5. Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
  6. Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662(2023).
  7. Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203(2014).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  9. McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
  10. Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418(2019).
  11. Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
  12. Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
  13. Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
  14. Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
  15. Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133(2022).
  16. Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257(2022).
  17. Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
  18. Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
  19. Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479(2020).
  20. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
  21. Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
  22. Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
  23. Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16(2023).
  24. Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5(2023).
  25. Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
  26. Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
  27. Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149(2021).
  28. Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).

Herprints en machtigingen

Tags

Implantatie van electrode-arrayschirurgie bij wakke rattenontstekingsremmende effecteninflammatoire darmziektemodel voor reumatoïde artritissamengestelde actiepotentialenelektrofysiologische registratiesubdiafragmatische VNS
Implantatiechirurgie voor stimulatie van de nervus vagus in de buik en opnamestudies bij wakkere ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.