Methodenartikel

In vivo visualisatie van spontane activiteit in de sensorische cortex van neonatale muizen met een resolutie van één neuron

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65899

⸱

21 november 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Primaire sensorische gebieden in de neocortex vertonen unieke spontane activiteiten tijdens de ontwikkeling. Dit artikel beschrijft hoe individuele neuronactiviteiten en primaire sensorische gebieden kunnen worden gevisualiseerd om gebiedsspecifieke synchrone activiteiten bij neonatale muizen in vivo te analyseren.

Samenvatting

De hersenen van zoogdieren ondergaan dynamische ontwikkelingsveranderingen op zowel cellulair als circuitniveau tijdens prenatale en postnatale periodes. Na de ontdekking van talrijke genen die bijdragen aan deze ontwikkelingsveranderingen, is nu bekend dat neuronale activiteit deze processen ook aanzienlijk moduleert. In de zich ontwikkelende hersenschors vertonen neuronen gesynchroniseerde activiteitspatronen die gespecialiseerd zijn in elk primair sensorisch gebied. Deze patronen verschillen duidelijk van die waargenomen in de volwassen cortex, wat hun rol benadrukt bij het reguleren van gebiedsspecifieke ontwikkelingsprocessen. Tekorten in neuronale activiteit tijdens de ontwikkeling kunnen leiden tot verschillende hersenziekten. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om de regulerende mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan activiteitspatronen in neuronale ontwikkeling. Dit artikel vat een reeks protocollen samen om primaire sensorische gebieden en neuronale activiteit bij neonatale muizen te visualiseren, om de activiteit van individuele neuronen binnen de corticale subvelden in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie in vivo, en om subveldgerelateerde activiteitscorrelaties te analyseren. We tonen representatieve resultaten van patchwork-achtige synchrone activiteit binnen individuele vaten in de somatosensorische cortex. Ook bespreken we verschillende mogelijke toepassingen en enkele beperkingen van dit protocol.

Inleiding

De hersenschors bevat verschillende sensorische gebieden met verschillende functies. De gebieden ontvangen input die afkomstig is van hun overeenkomstige sensorische organen, meestal overgebracht via het ruggenmerg of de hersenstam en doorgegeven via de thalamus 1,2. Met name neuronen in elk primair sensorisch gebied vertonen een unieke gesynchroniseerde activiteit tijdens vroege ontwikkelingsstadia, die ook afkomstig zijn van sensorische organen of de lagere zenuwcentra, maar in wezen verschillen van de activiteiten die worden waargenomen in de volwassen cortex3.

Bij neonatale knaagdieren, bijvoorbeeld, vertoont het primaire visuele gebied (V1) golfachtige activiteit, die zijn oorsprong vindt in het netvlies (netvliesgolf) en zich door het hele visuele pad voortplant met behoud van retinotopie4. Het primaire auditieve gebied (A1) vertoont synchrone activiteit georganiseerd in bandvormige subregio's die overeenkomen met de isofrequentiebanden in de volwassen hersenen. De activiteit komt voort uit de binnenste haarcellen van het slakkenhuis 5,6. De vatencortex in het primaire somatosensorische gebied (S1) vertoont een lappendekenachtig activiteitspatroon waarin laag 4-neuronen binnen individuele vaten, namelijk neuronen die reageren op individuele snorharen, synchroon worden geactiveerd7. Hoewel wordt aangenomen dat het afkomstig is van het trigeminusganglion, blijft de bron van de activiteit onbekend7. Bijgevolg zijn neonatale activiteitspatronen zowel gespecialiseerd in elk primair sensorisch gebied als binnen intra-areal subvelden. De gelijktijdige visualisatie van neuronale activiteit en structuur van primaire sensorische gebieden kan een onderzoek vergemakkelijken naar de bijdrage van deze activiteitspatronen aan de ontwikkeling van sensorische systemen.

In dit artikel hebben we een reeks protocollen samengevat: (1) om individuele neuronale activiteiten te visualiseren met behulp van schaarse labeling van GCaMP en primaire sensorische gebieden met behulp van TCA-RFP-muizen die rood fluorescerend eiwit tot expressie brengen in thalamocorticale axonen7, (2) om activiteit op celniveau in neonatale muizen in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie in vivo, en (3) om de activiteitscorrelaties binnen de S1-vatcortex te analyseren. De representatieve resultaten tonen patchwork-achtige gesynchroniseerde activiteit binnen individuele vaten van een postnatale dag (P)6 muis. Ondanks enkele beperkingen kan deze techniek worden gebruikt voor chronische beeldvorming, breedveldbeeldvorming over meerdere sensorische gebieden en verschillende manipulatie-experimenten. De veelzijdige analyse van neuronale activiteit tijdens de ontwikkeling zal ons begrip van de mechanismen voor de vorming van hersencircuits verrijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierproeven van de Universiteit van Kumamoto en het National Institute of Genetics en goedgekeurd door de commissies voor dierproeven.

1. Elektroporatie in utero (IUE)

  1. Koppel mannelijke TCA-RFP-muizen met een ICR-achtergrond aan vrouwelijke wildtype ICR-muizen. Observeer de vaginale plug om te controleren op paring in de vroege ochtend van de volgende dag. Observeer de buik om 2 weken later te controleren op zwangerschap.
  2. Bereid een plasmideoplossing met 5 ng/μL TRE-nCre, 1 μg/μL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE en 0,02 % Trypan Blue in ddH2O om neuronen spaarzaam te labelen door GCaMP met behulp van het Supernova-systeem8.
  3. Bereid een pijnstillende oplossing met 0,5 mg/ml carprofen en 0,01 mg/ml buprenorfine. Bescherm het tegen licht en bewaar het op kamertemperatuur.
  4. Voer op embryonale dag (E)14 IUE als volgt uit. De IUE-methoden zijn in wezen hetzelfde als eerdere rapporten 9,10,11.
    1. Veeg de laboratoriumtafel af met 70% ethanol- of glutaaraldehyde-oplossing. Steriliseer alle chirurgische instrumenten door middel van autoclaveren. Draag een masker en een laboratoriumjas om het risico op infectie voor de muis te verminderen.
    2. Bereid glazen micropipetten voor met behulp van een micropipettrekker. Neem de plasmidemengseloplossing in de glazen micropipet met behulp van een aspiratorbuis.
    3. Induceer anesthesie bij de drachtige muizen bij E14 met behulp van isofluraan (2,0% in lucht). Houd de muizen tijdens de procedure verdoofd met isofluraan (1,2% in de lucht). Knijp in de teen om er zeker van te zijn dat de verdoving diep genoeg is. Gebruik oogheelkundige zalf om droge ogen te voorkomen.
    4. Desinfecteer de buikstreek minstens drie keer met afwisselende rondes scrub op basis van jodium en 70% ethanol. Plaats een steriel laken om het operatiegebied te bedekken. Maak een incisie in de middellijn en leg de baarmoeder bloot op het gordijn.
    5. Herhaal het druppelen van warme zoutoplossing op de baarmoeder om te voorkomen dat deze uitdroogt of afkoelt tot de buik sluit (stap 1.4.8).
    6. Injecteer de plasmideoplossing één voor één in één kant van de laterale ventrikel van embryo's met behulp van een micropipet en een aspiratorbuis.
    7. Gebruik een elektrode van het pincettype om in de embryokoppen te knijpen en geef vijf keer vierkante elektrische pulsen (40 V, 50 ms) af met tussenpozen van 1 s met behulp van een elektroporator.
    8. Breng de baarmoeder terug naar de buikholte. Breng ~3 ml warme zoutoplossing aan in de holte. Hecht het buikvlies en de buikhuid. Dien de pijnstillende oplossing toe in een gewicht van 10 μl/g (carprofen bij een gewicht van 5 μg/g en buprenorfine bij een gewicht van 0,1 μg/g) onder de huid achter in de nek.
  5. Plaats de muis in een herstelkooi op een verwarmingskussen (37 °C) om te herstellen van de narcose. Leg de muis op zijn buik om te voorkomen dat zijn tong en speeksel de keel verstikken. Houd de muis uit de buurt van andere muizen en houd hem in de gaten totdat hij weer normaal kan bewegen. Plaats de muis terug in de kooi.
  6. Voer na de geboorte genotypering uit om te controleren op RFP-allel en euthanaseer de pups zonder het allel. Deze stap wordt aanbevolen, vooral als beeldvorming wordt uitgevoerd tijdens de tweede postnatale week wanneer het TCA-RFP-signaal zwak is en moeilijk te controleren bij stap 2.2.7.

2. Craniale raamchirurgie

  1. Bereid de cortexbuffer met 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgSO4 in ddH2O (pH aangepast tot 7,4 met 1 M NaOH)12 voor op de dag van de operatie. Steriel de buffer met behulp van een vacuümfilter.
    OPMERKING: De buffer kan maximaal 3 maanden op 4 °C worden gehouden. Het benodigde volume is 5-10 ml per pup.
  2. Voer de volgende stappen uit op P3-12. Zie ook de eerdere rapporten waarin deze procedure is beschreven13,14.
    1. Meng 50 mg agarose met 5 ml cortexbuffer en los de agarose volledig op door verhitting te verwarmen. Doe een deel van de oplossing in een tube van 1,5 ml en houd deze op 42 °C.
    2. Doe wat cortexbuffer in een conische buis van 50 ml en bewaar deze op kamertemperatuur. Doe wat zoutoplossing in een bakje (bijvoorbeeld een dop van een conische buis van 50 ml) en bewaar deze op kamertemperatuur.
    3. Bereid een pijnstillende oplossing met 0,01 mg/ml buprenorfine. Bescherm het tegen licht en bewaar het op kamertemperatuur.
    4. Steriliseer alle chirurgische instrumenten door middel van autoclaveren. Desinfecteer de fluorescentie-stereomicroscoop met 70% ethanol.
    5. Gebruik een isofluraanverdamper om anesthesie bij de pup op te wekken met isofluraan (2,0% in lucht). Besteed aandacht aan de pup en haal hem eruit als zijn ademhaling iets vertraagt.
      OPMERKING: Als de anesthesie langer duurt, kan de ademhaling van de pup enkele seconden stoppen. Zelfs als de ademhaling van de pup wordt hervat, kan langdurige anesthesie de cerebrale bloedstroom van de pup verminderen en onomkeerbare hersenbeschadiging veroorzaken.
    6. Desinfecteer de kop van de pup minstens drie keer met afwisselende rondes scrub op basis van jodium en 70% ethanol. Plaats de pup op het verwarmingskussen (35 °C) onder een fluorescentie-stereomicroscoop. Houd de pup altijd verdoofd met isofluraan (1,5%-2,5% in lucht).
    7. Selecteer de pups die TCA-RFP en GCaMP tot expressie brengen door de fluorescentie door de schedel te observeren. Euthanaseer de pups die niet beide uiten.
    8. Verwijder de hoofdhuid boven de hersenhelften zo ver mogelijk en voorzichtig, om geen bloedingen te veroorzaken. Wrijf over de schedel met een steriel wattenstaafje doordrenkt met zoutoplossing om bindweefsel te verwijderen.
    9. Nadat de schedel is opgedroogd, plakt u het ingesneden hoofdhuidoppervlak met een tissuelijm op de schedel.
    10. Leg de pup op een verwarmingskussen van 37 °C om te herstellen van de narcose. Wacht minstens 15 minuten om de lijm te laten stollen.
      NOTITIE: Pauzeer maximaal 1 uur voordat u doorgaat naar de volgende stap. Bereid andere pups op dezelfde manier voor als dat nodig is gedurende deze tijd.
    11. Verdoof de pup met isofluraan. Plaats de pup onder verdoving op het verwarmingskussen (37 °C) onder een fluorescentie-stereomicroscoop (1,5%-2,5% isofluraan in lucht).
      OPMERKING: Als de anesthesie langer duurt dan de tijd voor het eindpunt (60 min), euthanaseer de pup dan door onthoofding tijdens de verdoving met isofluraan.
    12. Markeer de GCaMP-expressieve locatie op de schedel met een steriele permanente marker. Breng cortexbuffer aan op de locatie.
    13. Steek de hoek van een scheermesje in de schedel. Duw langzaam op het mes om de schedel af te scheren en een gat te maken. Knijp de gebarsten schedel af met een pincet en verwijder deze.
    14. Controleer of het schedelgat met succes is gemaakt door bloedvaten in het gat te observeren. Als er een bloeding optreedt, spoel het gat dan snel af met cortexbuffer met behulp van een micropipet. Herhaal het spoelen totdat het bloeden volledig stopt.
    15. Breng een druppel cortexbuffer aan op het schedelgat en plaats het in een steriel rond dekglas met een diameter van 3 mm over het gat. Veeg de overtollige buffer weg met niet-geweven stof. Wacht tot het gebied rond het glas is opgedroogd.
    16. Breng met een micropipet warme agarose-oplossing aan rond de glasrand. Omdat te veel agarose de fluorescerende signalen kan verminderen, verwijdert u de overtollige oplossing onder het glas door het glas voorzichtig van bovenaf te duwen.
    17. Verwijder de agarose op het glas of op afstand van de glasrand met een pincet. Laat agarose alleen rond de buitenste glazen omtrek staan.
    18. Wacht tot de agarose stolt. Als er door agarosekrimp ruimte onder het glas ontstaat, voeg dan agarose-oplossing vanaf de zijkant toe om de hele glasrand te bedekken. Verwijder alle vloeistof van het schedeloppervlak met niet-geweven stof.
    19. Meng acrylharspoeder en vloeistof in een rubberen container. Zuig het mengsel op met een micropipet en giet het om de agarose rond de glasrand met hars te bedekken.
      OPMERKING: Omdat de hars snel stolt na het mengen van het poeder en de vloeistof, moeten ze herhaaldelijk worden gemengd voordat ze worden aangebracht. De hoeveelheden die nodig zijn in elke menging zijn ~500 μL voor vloeistof en ~0,15 g voor poeder.
    20. Bevestig een titanium staaf met hars op de contralaterale hemisfeer. Houd de hoek van de staaf evenwijdig aan het afdekglas. Bevestig het hele schedeloppervlak met hars.
    21. Dien de pijnstillende oplossing toe in een gewicht van 10 μl/g (buprenorfine in een gewicht van 0,1 μg/g) onder de huid achter in de nek. Plaats de pup terug op een verwarmingskussen van 37 °C voor herstel van de anesthesie. Wacht >60 minuten voor het stollen van de hars voordat u de beeldvorming uitvoert.
      NOTITIE: Pauzeer 1-5 uur voordat u de beeldvorming uitvoert. Voer gedurende deze tijd op dezelfde manier een operatie uit op andere pups.

3. Beeldvorming van calciumcalcium met twee fotonen

  1. Bevestig een twee-assige goniometer met een titaniumplaat aan een objectiefplaat met XY-positionering onder de microscoop. Plaats een verwarmingskussen (35 °C) op het podium.
  2. Schakel de scansoftware in met de volgende voorwaarden: Pixels, 512 x 512; Bidirectioneel, AAN; Gemiddelde, geen; beeldgebied, 600 x 600 μm met een 20x objectief. Stel de instellingen zo in dat de scansnelheid sneller is dan 1 Hz.
  3. Plaats de pup op het verwarmingskussen en bevestig de titanium staaf voor hoofdbevestiging met schroeven aan de titaniumplaat. Houd de pup verdoofd door een buisopening voor isofluraan te plaatsen (1,5-2,0% in lucht).
  4. Pas de vensterhoek horizontaal aan met de goniometer. Schakel de achtergrondverlichting in en observeer het hersenoppervlak met een 5x objectieflens en selecteer het beeldvormingsgebied op XY-positionering.
  5. Doe oogdruppels op het schedelvenster. Schakel het objectief over naar een 20x wateronderdompelingslens. Observeer het corticale oppervlak om te bevestigen dat er bloedstroom op het hersenoppervlak wordt gezien.
  6. Schakel de achtergrondverlichting uit en scan het hersenoppervlak met behulp van de één-fotonmodus. Verhoog het laservermogen om de groene autofluorescentie van het glas en het hersenoppervlak zichtbaar te maken.
  7. Verlaag de isofluraanconcentratie tot 1,0%-1,5%. Dek de microscoop af om lichtlekken te voorkomen. Schakel de scansoftware over naar de twee-fotonmodus.
  8. Pas het laservermogen en de detectorversterking aan die geschikt zijn voor het scannen van GCaMP- en RFP-signalen. Zoek de diepte waar TCA-RFP-signalen worden gezien. Zorg ervoor dat de diepte laag 4, ~300 μm lager is dan het hersenoppervlak bij P6. Selecteer het beeldvormingsgebied waar veel neuronen die GCaMP tot expressie brengen, worden gezien.
  9. Start timelapse-beeldvorming van GCaMP- en RFP-signalen. Als gelijktijdig scannen met twee kanalen niet van toepassing is, legt u GCaMP- en TCA-RFP-beelden vast vóór de beeldvorming.
  10. Stop isofluraan om de anesthesie te verzwakken en observeer spontane activiteiten gedurende ~20 minuten. Bewaak de bewegingen van de pup tijdens het maken van beeldvorming met behulp van een infraroodcamera. Hervat de isofluraan-anesthesie (2% in de lucht) onmiddellijk als er een reactie wordt waargenomen die wijst op angst.
  11. Nadat de pup stopt met bewegen, herhaalt u de beeldvorming uit stap 3.9. Verander indien nodig het beeldvormingsgebied.
  12. Euthanaseer de pup met een overdosis isofluraan. Fixeer de hersenen door transcardiale perfusie van zoutoplossing en 4% PFA, gevolgd door postfixatie in 4% PFA 's nachts om tangentiële plakjes te bereiden en immunohistochemie uit te voeren. Anders euthanaseert u de pup met een overdosis verdoving gevolgd door onthoofding.
  13. Als de moeder geen andere pups heeft, euthanaseer de moedermuis dan met een overdosis verdoving gevolgd door cervicale dislocatie.

4. Beoordeling

  1. Start MATLAB en voer EZcalcium toolbox15 uit om een grafische gebruikersinterface (GUI) 'Initial GUI' te openen.
  2. Compenseer voor het afwijken van het afbeeldingsframe als gevolg van muisbewegingen of andere oorzaken.
    1. Klik op Bewegingscorrectie in de initiële GUI om de GUI voor bewegingscorrectie te openen. Klik op 'Bestanden toevoegen...' om een TIF-bestand met de beeldgegevens te laden.
    2. Stel de instellingen als volgt in: Niet-stijve bewegingscorrectie, leeg; Upsampling-factor, 50; Max Shift, 15; Initiële batchgrootte, 200; Breedte opvangbak, 200. Klik op 'Bewegingscorrectie uitvoeren' om de correctie uit te voeren. Bewegingsgecorrigeerde beeldvormingsgegevens worden automatisch opgeslagen.
      OPMERKING: De instellingen moeten worden aangepast aan de eigenschappen van de beeldgegevens. Als de afwijkingen van sommige frames niet worden gecompenseerd vanwege niet-lineaire framevervormingen of beweging van de cortex in de diepterichting, opent u de originele beeldvormingsgegevens zonder correctie in ImageJ Fiji en verwijdert u de frames en start u stap 4.2 opnieuw.
  3. Detecteer neuronen en teken interessegebieden (ROI's).
    1. Klik op Geautomatiseerde ROI-detectie in de initiële GUI om de ROI-detectie-GUI te openen. Klik op Bestanden toevoegen... om de bewegingsgecorrigeerde beeldgegevens te laden.
    2. Stel de instellingen als volgt in: Initialisatie, Hebzuchtig; zoekmethode, ellips; Deconvolutie, beperkt FOOPSI-SPGL1; autoregressie, verval; Geschat # ROI's, 60 (meer dan het dubbele van het visueel gedetecteerde aantal wordt aanbevolen); Geschatte ROI-breedte, 17 (~20 μm); Drempel voor samenvoegen, 0,95; Fudge-factor, 0,95; Ruimtelijke downsampling, 1; Temp. Downsampling, 1; Temp. iteraties, 5.
      OPMERKING: De instellingen moeten worden aangepast aan de eigenschappen van de beeldgegevens.
    3. Klik op ROI-detectie uitvoeren om de detectie uit te voeren. ROI-gegevens worden automatisch opgeslagen.
    4. Klik op ROI-verfijning in de initiële GUI om de ROI-verfijningsGUI te openen. Klik op Gegevens laden om de ROI-gegevens te laden. Selecteer de ROI's met een lage activiteitsfrequentie (<1 Hz), die zich onder de schedel bevinden of die de neurieten van andere neuronen bevatten. Klik op ROI uitsluiten om de ROI's uit te sluiten van de analyse.
    5. Selecteer het formaat voor gegevensexport naar XLSX en klik op Gegevens exporteren om een Excel-bestand met onbewerkte dF/F-waarden te verkrijgen. De dF/F maakt gebruik van vergelijking (1), waarbij F de gemiddelde intensiteit van pixels in elk frame is, F0 de basissignaalintensiteit en Fb de achtergrondfluorescentie.
      figure-protocol-1(1)
  4. Bereken de Pearson's correlatiecoëfficiënt van dF/F tussen ROI's en maak een correlatiecoëfficiëntenmatrix. Gebruik dF/F alleen nadat de anesthesie is verzwakt en spontane activiteit is begonnen (~10 minuten na het stoppen met isofluraan).
  5. Definieer de loopranden van de TCA-RFP-afbeelding met behulp van Fiji. Categoriseer de ROI's naar hun respectievelijke vaten of septa. Vergelijk de paarsgewijze correlatie binnen hetzelfde vat en die tussen verschillende vaten.
  6. Genereer 1.000 tot 10.000 surrogaatgegevens door de correspondentie tussen ROI en Ca2+- sporen willekeurig te schudden. Bereken de gemiddelde correlatiecoëfficiënt binnen individuele vaten in elke surrogaatgegevens en evalueer de statistische significantie van de correlatie in de echte gegevens.
    OPMERKING: Als een van de 10,000 surrogaten een waarde heeft die hoger is dan de werkelijke waarde, is de statistische significantie 0.0001. De in de stappen 4.5 en 4.6 beschreven analyses kunnen worden uitgevoerd voor samengevoegde gegevens van meerdere dieren, zoals elders is uitgevoerd 7,16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont de representatieve resultaten van laag 4 neuronactiviteiten in de vatcortex van een P6-pup, gevisualiseerd met behulp van het huidige protocol. Twee-fotonbeelden van het groene kanaal (GCaMP) en het rode kanaal (TCA-RFP) werden tijdelijk gemiddeld en weergegeven in figuur 1A. Omdat TCA-RFP-fluorescentie veel zwakker was dan GCaMP-fluorescentie, lekte het GCaMP-signaal in het rode kanaal (Figuu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Aangezien de spontane activiteiten voortkomen uit het sensorische orgaan of het lagere zenuwstelsel en naar het primaire sensorische gebied reizen via een pad dat gelijk is aan dat van een volwassen zenuwstelsel3, is het van cruciaal belang om het primaire sensorische gebied en de locatie van afgebeelde neuronen in het gebied te definiëren. In dit protocol hebben we aan deze eis voldaan door transgene muizen te gebruiken die thalamocorticale axonen visualiseren en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (B) (22H05092, 22H05094) en voor Scientific Research Grants 20K06876, AMED onder subsidienummer 21wm0525015, de Takeda Science Foundation, de Naito Foundation, de Kato Memorial Bioscience Foundation, de Kowa Life Science Foundation, NIG-JOINT (24A2021) (aan H.M.); en Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grants 19K06887 en 22K06446, het Kodama Memorial Fund for Medical Research, de Uehara Memorial Foundation, de Kato Memorial Bioscience Foundation en de Takeda Science Foundation (naar N.N-T.). We danken Dr. Takuji Iwasato voor de TCA-RFP muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20× objectieflens (water-immersie)
250 mL vacuümfilter/opslagsysteemCorning431096
4%-paraformaldehyde fosfaatbufferoplossing (4% PFA)Nacalai09154-85
Acryolhars (UNIFAST II)GCN/A
AgaroseSigmaA9793
AspiratiebuismontageDrummond2-040-000
CaCl2•2H2ONacalai06731-05
ElektroporatorBEXGEB14
Ogendeogge (Scopisol)Senju PharmaceuticalN/A
Fluorescentie stereomicroscoopLeicaM165FC
GlucoseNacalai16806-25
VerwarmingspadMuromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
IsofluranPfizerN/A
KClNacalai28514-75
MgSO4•7H2OWako131-00405
MicropipettrekkerNarishigePC-100
MultifotonlaserSpectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
MultifotonmicroscoopZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
Niet-geweven stof (Kimwipe)Kimberly ClarkS-200
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Nacalai27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
Plasmid: TRE-nCreAddgenepK031
Precisie gekalibreerd micropipetDrummond2-000-050
VleesmesFeatherFA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)Zoetis JPN/A
Ronde dekglas, 3-mm-diameterMatsunamiCS01078
ZoutoplossingOtsuka035175315
Natrium pentobarbitalNacalai26427-72
Platform voor beeldvorming van levende pup (twee enkele as-translatieplatform voor XY-positionering, twee-as goniometer, basisplaat, verstelbare pilaar voor z-positionering)ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP muisN/AN/AMizuno et al., 2018a
Weefselkleefstof (Vetbond)3M1469SB
TitaniumstaafEndo Scientific InstrumentN/AOp maat gemaakt (Mizuno et al., 2018b)
TitaniumstaafbevestigingsplaatN/AOp maat gemaakt (Mizuno et al., 2018b)
TrypanblauwSigmaT8154
Pincet met platina plaat elektrode, 5 mm diameterBEXCUY650P5
Wild-type ICR muisNihon SLCSlc:ICR

Referenties

  1. Rao, M. S., Mizuno, H. Elucidating mechanisms of neuronal circuit formation in layer 4 of the somatosensory cortex via intravital imaging. Neuroscience Research. 167, 47-53 (2021).
  2. Iwasato, T., Erzurumlu, R. S. Development of tactile sensory circuits in the CNS. Current Opinion in Neurobiology. 53, 66-75 (2018).
  3. Martini, F. J., Guillamón-Vivancos, T., Moreno-Juan, V., Valdeolmillos, M., López-Bendito, G. Spontaneous activity in developing thalamic and cortical sensory networks. Neuron. 109 (16), 2519-2534 (2021).
  4. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  5. Tritsch, N. X., Yi, E., Gale, J. E., Glowatzki, E., Bergles, D. E. The origin of spontaneous activity in the developing auditory system. Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).
  6. Babola, T. A., et al. Homeostatic control of spontaneous activity in the developing auditory system. Neuron. 99 (3), 511-524.e5 (2018).
  7. Mizuno, H., et al. Patchwork-type spontaneous activity in neonatal barrel cortex layer 4 transmitted via thalamocortical projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  8. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  11. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. 140, e58340(2018).
  14. Egashira, T., et al. In vivo two-photon calcium imaging of cortical neurons in neonatal mice. STAR Protocols. 4 (2), 102245(2023).
  15. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  16. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  17. Antón-Bolaños, N., et al. Prenatal activity from thalamic neurons governs the emergence of functional cortical maps in mice. Science. 364 (6444), 987-990 (2019).
  18. Guillamón-Vivancos, T., et al. Input-dependent segregation of visual and somatosensory circuits in the mouse superior colliculus. Science. 377 (6608), 845-850 (2022).
  19. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  20. Chen, J. L., Voigt, F. F., Javadzadeh, M., Krueppel, R., Helmchen, F. Long-range population dynamics of anatomically defined neocortical networks. eLife. 5, e14679(2016).
  21. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  22. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. The Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  23. Murakami, T., Matsui, T., Uemura, M., Ohki, K. Modular strategy for development of the hierarchical visual network in mice. Nature. 608 (7923), 578-585 (2022).
  24. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of Calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  25. Shemesh, O. A., et al. Precision calcium imaging of dense neural populations via a cell-body-targeted calcium indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  26. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, e38173(2019).
  27. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv. , (2017).
  28. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2014).
  29. Marques-Smith, A., et al. A Transient translaminar GABAergic interneuron circuit connects thalamocortical recipient layers in neonatal somatosensory cortex. Neuron. 89 (3), 536-549 (2016).
  30. Tuncdemir, S. N., et al. Early somatostatin interneuron connectivity mediates the maturation of deep layer cortical circuits. Neuron. 89 (3), 521-535 (2016).
  31. Nakazawa, S., Yoshimura, Y., Takagi, M., Mizuno, H., Iwasato, T. Developmental phase transitions in spatial organization of spontaneous activity in postnatal barrel cortex layer 4. The Journal of Neuroscience. 40 (40), 7637-7650 (2020).
  32. Yu, Y. -C., et al. Preferential electrical coupling regulates neocortical lineage-dependent microcircuit assembly. Nature. 486 (7401), 113-117 (2012).
  33. Siegel, F., Heimel, J. A., Peters, J., Lohmann, C. Peripheral and central inputs shape network dynamics in the developing visual cortex in vivo. Current Biology. 22 (3), 253-258 (2012).
  34. Nakagawa, N., Hosoya, T. Slow dynamics in microcolumnar gap junction network of developing neocortical pyramidal neurons. Neuroscience. 406, 554-554 (2019).
  35. Valiullina, F., et al. Developmental changes in electrophysiological properties and a transition from electrical to chemical coupling between excitatory layer 4 neurons in the rat barrel cortex. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1(2016).
  36. Avitan, L., et al. Spontaneous and evoked activity patterns diverge over development. Elife. 10, e61942(2021).
  37. Mölter, J., Avitan, L., Goodhill, G. J. Detecting neural assemblies in calcium imaging data. BMC Biology. 16 (1), 143(2018).
  38. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cortex van neonatale muizentweefotonmicroscopieimaging van individuele neuronenactiviteit van de sensorische cortexGCaMP imagingbarrelcortexcrani le vensterchirurgiebewegingscorrectieROI detectieanalyse van calciumsignalen

Gerelateerde artikelen