Generatie van een rundvee primair enteroïde-afgeleid tweedimensionaal monolaagkweeksysteem voor toepassingen in translationeel biomedisch onderzoek

Samenvatting

Enteroïden zijn in opkomst als een nieuw model voor het bestuderen van weefselfysiologie en pathofysiologie, medicijnontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Hier beschrijven we een 2D-enteroïde-afgeleid kweeksysteem van rundercellen dat co-kweek met relevante weefselceltypen mogelijk maakt. Dit model biedt een translationeel voordeel voor modellering van gastro-intestinaal onderzoek.

Samenvatting

Organoïde celkweeksystemen kunnen de complexiteit die in weefsels wordt waargenomen recapituleren, waardoor ze nuttig zijn bij het bestuderen van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker, het evalueren van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen en weefselbio-engineering. Het toepassen van deze modellen om de beschreven redenen kan echter beperkt zijn vanwege het driedimensionale (3D) karakter van deze modellen. Het gebruik van 3D-enteroïde kweeksystemen om spijsverteringsziekten te bestuderen is bijvoorbeeld een uitdaging vanwege de ontoegankelijkheid van het darmlumen en de uitgescheiden stoffen. Stimulatie van 3D-organoïden met ziekteverwekkers vereist inderdaad luminale micro-injectie, mechanische verstoring van de 3D-structuur of het genereren van apicale enteroïden. Bovendien kunnen deze organoïden niet samen met immuun- en stromale cellen worden gekweekt, waardoor diepgaande mechanistische analyse van pathofysiologische dynamiek wordt beperkt. Om dit te omzeilen, optimaliseerden we een tweedimensionaal (2D) enteroïde-afgeleid monolaagkweeksysteem voor runderen, waardoor co-cultuur met andere relevante celtypen mogelijk is. Ileale crypten geïsoleerd uit gezond volwassen vee werden gekweekt om 3D-organoïden te genereren die werden ingevroren voor toekomstig gebruik. Een 2D-monolaag werd gecreëerd met behulp van nieuw leven ingeblazen 3D-enteroïden die werden gepasseerd en verstoord om enkele cellen op te leveren, die werden gezaaid op met basaalmembraanextract gecoate transwell-celcultuurinserts, waardoor hun apicale oppervlak bloot kwam te liggen. De polariteit van de intestinale monolaag, cellulaire differentiatie en barrièrefunctie werden gekarakteriseerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie en het meten van transepitheliale elektrische weerstand. Stimulatie van het apicale oppervlak van de monolaag onthulde de verwachte functionaliteit van de monolaag, zoals aangetoond door cytokinesecretie uit zowel apicale als basale compartimenten. Het beschreven 2D-enteroïde-afgeleide monolaagmodel is veelbelovend bij het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties en darmfysiologie, medicijnontwikkeling en regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

Diermodellen in onderzoek spelen een cruciale rol bij het vergroten van ons begrip van de pathofysiologie van ziekten en de dynamiek van de immuunrespons van de gastheer tijdens infectie en ondersteunen de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische strategieën 1,2,3,4. Deze modellen ondersteunen onderzoek, ontdekking en vooruitgang bij dieren en zijn de sleutel tot de vooruitgang van het onderzoek naar de menselijke gezondheid. Decennialang hebben knaagdiermodellen de vooruitgang in immuunmechanismen en fundamenteel biologisch onderzoek voor menselijke ziekten ondersteund 3,5,6,7. Hoewel knaagdiermodellen van cruciaal belang zijn bij screening en onderzoek naar vroege ontwikkeling, bieden grote diermodellen een relevantere vergelijking bij het onderzoeken van ziekten bij de mens in zowel vroege ontdekkings- als latere ontwikkelingsstudies, waaronder therapeutische werkzaamheids- en veiligheidstests 1,3,4,5. Vee biedt duidelijke voordelen in vergelijking met knaagdiermodellen voor een efficiëntere vertaling voor menselijke toepassingen voor sommige ziekten, waaronder cryptosporidiose, salmonellose, tuberculose, respiratoir syncytieel virus en brucellose ^1,7,8. Inderdaad, deze en andere ziekten ontwikkelen zich spontaan bij runderen, die verschillende analoge ziektepathogenese en immuunprocessen delen voor mensen, en als een uitgeteelde populatie bootsen runderen de genetische en omgevingsheterogeniteit na die de menselijke immuunresponsen beïnvloedt 5,8,9,10 . De voordelen van rundermodellen voor onderzoek naar infectieziekten kunnen worden gemaximaliseerd door eerst een geavanceerd kweeksysteem toe te passen en vervolgens stapsgewijs in-vivostudies uit te voeren. Het eerste gebruik van een zeer complex kweeksysteem van runderen kan het aantal studies met levende dieren aanzienlijk verminderen en tegelijkertijd de kans op succesvol translationeel en toegepast onderzoek vergroten. Kweekmodellen moeten de ziekteprocessen op orgaanniveau samenvatten voor een optimale voorspellende validiteit, waarbij de oorspronkelijke micro-omgeving van het weefsel ruimtelijk en functioneel behouden blijft.

De mucosale immuunrespons is een veelzijdig systeem dat bestaat uit een zeer efficiënte barrière gevormd door gastro-intestinale enterocyten en diverse populaties immuuncellen die zich onder het slijmvliesoppervlak^bevinden11. Dit zeer complexe systeem is van cruciaal belang tijdens infectie bij het handhaven van de GI-homeostase en het initiëren van immuunafweer tegen darmpathogenen¹¹. Communicatie tussen enterocyten en onderliggende aangeboren immuuncellen initieert de ontwikkeling van beschermende immuunresponsen tegen pathogene micro-organismen. Als zodanig zijn kweeksystemen die vergelijkbaar zijn in hun mate van complexiteit noodzakelijk voor een optimaal onderzoek naar interacties tussen gastheer en enterische pathogenen en zijn ze zeer effectief in het begrijpen van de enterische fysiologie en de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen^12,13. Organoïden zijn een robuust kweeksysteem dat lijkt op de architectuur en functie van het weefsel van oorsprong^14,15. De meercelligheid van deze modellen maakt onderzoek mogelijk naar de rol van diverse celpopulaties en de cellulaire interacties die betrokken zijn bij darmgezondheid en -ziekte^12,14. Van mensen afgeleide organoïdemodellen in onderzoek worden momenteel echter beperkt door de moeilijkheid om een voldoende kwantiteit en consistente kwaliteit van menselijke darmepitheelcellen te verkrijgen en de beperkte levensvatbaarheid van cellen in kweek. Onsterfelijke cellijnen kunnen worden gebruikt om consistent hoge opbrengsten van homologe culturen in deze modellen te verkrijgen; Getransformeerde cellen missen echter inherent de diversiteit en functionele complexiteit van niet-getransformeerde epitheelcellen^16,17. De voordelen van het gebruik van culturen afgeleid van runderweefsel als model voor het onderzoeken van gastro-intestinale ziekten en fysiologie zijn onder meer het gemak waarmee weefselmonsters consequent kunnen worden verkregen van gezonde donoren, verbeterde cellevensvatbaarheid en een grotere cellulaire diversiteit die alleen kan worden bereikt met niet-onsterfelijk weefsel. Vergelijkende weefseltranscriptomics en karakterisering van darmorganoïden onthullen overeenkomsten in geconserveerde orthologe genen en cellulaire potentialen tussen mensen en runderen¹⁸. Daarom kan een van runderorganoïden afgeleid kweeksysteem voordelig zijn bij het onderzoeken van darmziekten bij de mens, met bevindingen die gemakkelijk kunnen worden vertaald naar de menselijke geneeskunde.

Het hierin beschreven protocol beschrijft een effectief platform om de reacties van de gastheer op enterische pathogenen of verbindingen en de darmfysiologie te evalueren met behulp van een van runderenteroïden afgeleid 2D primair celkweeksysteem. In tegenstelling tot 3D-organoïden, maken 2D-kweeksystemen die worden gegenereerd op transwell-inserts een dubbele kweek van darmcellen met immuun- of stromale cellen mogelijk, waardoor onderzoek naar de dynamiek op weefselniveau mogelijk is. Met toepassingen in biomedisch onderzoek, farmaceutische ontwikkeling en werkzaamheidstesten, kan dit fysiologisch relevante model de gezondheid en vooruitgang van zowel vee als mensen ten goede komen.

Protocol

Alle protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met institutionele en nationale richtlijnen en voorschriften voor dierenwelzijn.

1. Bereiding van reagens

OPMERKING: De voorraad en de uiteindelijke concentraties van de in dit onderzoek gebruikte reagentia zijn vermeld in tabel 1.

1. Bereid de monsterafnamebuffer voor: Meng 1 L ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met penicilline (100 E/ml), streptomycine (100 μg/ml), gentamicine (25 μg/ml) en caspofungine (2,5 μg/ml). Bewaar de voorraadoplossing bij 4 °C.
2. Bereid dissociatiereagens #1 voor: Meng 18,55 ml monsterafnamebuffer (zoals beschreven in stap 1.1), 1,422 ml ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,422 M/pH 7,4), 20 μL 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT)-oplossing, 4 μL Y-27632-oplossing (5000x/50 mM). Bewaar de oplossing bij 4 °C.
3. Bereid dissociatiereagens #2 voor: Meng 18,57 ml verzamelbuffer (zoals beschreven in stap 1.1), 1,422 ml EDTA (0,422 M/pH 7,4), 4 μL Y-27632-oplossing (5000x/50 mM). Bewaar de oplossing bij 37 °C.
4. Bereid enteroïde groeimediabouillon voor: Meng 9,875 ml organoïde groeimedium plus supplement, 100 μL penicilline (100 E/ml), streptomycine (100 μg/ml), 5 μl gentamicine (25 μg/ml) en 20 μl caspofungine (2,5 μg/ml). Bewaar de oplossing bij 4 °C.
5. Bereid enteroïde differentiatiemediabouillon voor: Meng 10 ml organoïdedifferentiatiemedium plus supplement, 100 μL penicilline (100 E/ml), streptomycine (100 μg/ml), 5 μl gentamicine (25 μg/ml) en 20 μl caspofungine (2,5 μg/ml). Bewaar de oplossing bij -20 °C.
6. Wasmedia voorbereiden: Meng 48,45 ml DMEM/F-12 1.1 medium (met L-glutamine, zonder HEPES), 1 ml B-27-supplement zonder vitamine A (50x bouillon), 500 μL penicilline (100 E/ml), streptomycine (100 μg/ml), 25 μl gentamicine (50 mg/ml bouillon) en 25 μl caspofungine (5 mg/ml bouillon). Bewaar de oplossing bij 4 °C.
7. Coatingbuffer voorbereiden: Meng 25 ml DMEM: F12 complete media zonder remmers en 25 mg runderserumalbumine (BSA). Bewaar de oplossing bij 4 °C.

2. Isolatie van darmcrypten uit heel weefsel (figuur 1)

OPMERKING: Enteroïden in de dunne darm van runderen werden gegenereerd uit ileumweefsel verkregen van gezonde volwassen Holsteinossen (>2 jaar oud) van een plaatselijk rundvleesverwerkingsbedrijf. Voor deze reeks experimenten werd één donor gebruikt.

1. Bereiding van darmweefselmonsters
   1. Plaats de geoogste darmweefselmonsters van ~10 inch (25 cm) in ~400 ml ijskoude verzamelbuffer (PBS+ antibiotica/antimycotica) en op ijs voor transport naar het laboratorium.
   2. Gebruik een chirurgische schaar (bijv. mayoschaar) en een pincet (bijv. adson-pincet) om het overtollige vet en mesenterium uit het darmweefselmonster te verwijderen.
   3. Snijd het weefsel in twee gelijke stukken.
   4. Open het weefsel in de lengterichting met een chirurgische schaar en spoel het weefsel in steriele PBS.
   5. Verwijder voorzichtig de slijmlaag van het darmmonster met behulp van de zijkant van een steriel glazen microscoopglaasje en spoel het weefsel af met verse PBS.
      OPMERKING: Deze stap helpt bij het verwijderen van de villi en helpt de zuiverheid van de cryptefracties in de volgende stappen te vergroten.
   6. Snijd voor elk stuk van 5 inch (13 cm) het weefsel in twee 2,5 inch (6,5 cm) en snijd vervolgens elk stuk in 4 ongeveer gelijke kleine stukjes om weefseldissociatie te vergemakkelijken.
2. Dissociatie van darmweefsel
   1. Bereid een volume van 20 ml van het weefseldissociatiereagens #1 voor in een steriele conische buis van 50 ml en deponeer de kleine weefselmonsters in de conische buis totdat de volumeverplaatsing de meniscus verplaatst van de 20 ml-markering naar de 35 ml-markering op de conische buis.
   2. Herhaal de bovenstaande stap voor de resterende stukjes dunne darmweefsel.
   3. Sluit de conische buizen af met parafilm en schud de conische buis 10 keer handmatig.
      NOTITIE: Gedurende het hele protocol moet handmatig schudden op een opzettelijke maar zachte manier worden gedaan.
   4. Plaats de conische buizen horizontaal op ijs in een bak op een orbitaal schudplatform.
   5. Schud de conische buizen op ijs in de container gedurende 30 minuten bij 80 omwentelingen per minuut (rpm). Schud de conische buis elke 10 minuten handmatig.
   6. Bereid een volume van 20 ml voorverwarmd (37 °C) weefseldissociatiereagens #2 (geformuleerd zoals hierboven, maar zonder DTT) in een conische buis van 50 ml. Deponeer de weefselmonsters uit de conische buizen met het dissociatiereagens #1 in de conische buizen met het dissociatiereagens #2.
   7. Sluit de conische buizen af met parafilm en schud de conische buizen 10 keer handmatig.
   8. Plaats de conische buizen in een voorverwarmd (37 °C) schudwaterbad, gekanteld in een hoek van ongeveer 60 °C, en schud gedurende 10 minuten met 150 tpm, met handmatig schudden na 5 minuten en opnieuw na de totale incubatie van 10 minuten.
3. Isolatie van cryptefragmenten
   1. Label 10 steriele conische buisjes #1 - #10. Voeg 20 ml steriele ijskoude PBS toe aan elke gelabelde conische buis.
   2. Breng de weefselstukjes van de conische buisjes met het dissociatiereagens #2 over in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml met ijskoud PBS #1.
   3. Schud de conische buizen 10 keer handmatig.
   4. Sluit de conische buizen af met parafilm en plaats ze horizontaal op ijs. Schud conische buizen op een orbitale schudder gedurende 10 minuten bij 80 tpm. Schud na 10 minuten handmatig de conische buis #1 10 keer. Dit wordt beschouwd als Wash #1.
   5. Breng weefselmonsters voorzichtig over met behulp van een chirurgische pincet naar de conische buis #2.
   6. Herhaal stap 2.3.2 - 2.3.4, dit wordt beschouwd als Wash #2.
   7. Herhaal wasbeurten tot wasbeurt #10.
   8. De supernatanten van elke wasbeurt bevatten de crypten die zullen worden gebruikt voor het genereren van enteroïden. Houd de tubes met de supernatanten op 4 °C totdat alle 10 wasbeurten zijn voltooid.
   9. Nadat de 10e^wasbeurt is voltooid en het weefselgedeelte is weggegooid, centrifugeert u de supernatanten van conische buizen #6-#10 bij 400 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de geïsoleerde crypten te pelleteren.
      OPMERKING: Wasbeurten 6-10 bevatten de schoonste fracties van intacte crypten met beperkt puin en enkele cellen. Als zodanig wordt aanbevolen om alleen deze fracties te gebruiken voor het genereren van enteroïden en de eerdere wasbeurten (#2-#5) worden weggegooid)
   10. Gooi het supernatans weg en voeg 4 ml verse, ijskoude PBS toe aan crypten zonder opnieuw te suspenderen (dit helpt om de fragmenten intact te houden tot microscopie).
   11. Beoordeel de zuiverheid van de gedissocieerde crypten voor elke conische buis #6-#10 door middel van microscopie.
       1. Voeg 50 μL PBS toe aan een plaat met 384 putjes.
       2. Voeg 10 μL cryptsuspensie toe aan de PBS en gebruik een objectieflens met een vergroting van 40x om de zuiverheid, integriteit en het aantal crypten te bepalen.
          OPMERKING: Het tekenen van een kruis op de onderkant van het plaatvak maakt het tellen gemakkelijker.

3. Ex vivo generatie en passage van runderileumenteroïden (figuur 2)

OPMERKING: De crypten uit de conische buizen met de meest zuivere, intacte darmcrypten zullen worden gebruikt voor stroomafwaartse tests. Voor alle stappen waarbij crypten en enteroïden betrokken zijn, moeten pipetpunten, celschrapers en buizen vooraf worden gecoat met de coatingbuffer en moeten luchtbellen worden vermeden om het verlies van crypten te voorkomen. Tenzij anders vermeld, moet een pipetpunt van 1000 μL worden gebruikt om te voorkomen dat cryptefragmenten worden verbroken.

1. Enteroïden genereren uit cryptefragmenten
   1. Combineer de zuiverste cryptefracties (meestal #6-#10) in één conische buis.
   2. Centrifugeer de conische buis met de crypten bij 400 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
   3. Gooi het supernatans weg door het op te zuigen met een pipet en suspendeer de cryptepellet opnieuw in Wash Media.
   4. Centrifugeer zoals beschreven in stap 3.1.2. Decanteer het supernatans en voeg 2 ml wasmedia toe aan de cryptekorrel.
   5. Tel het aantal crypten zoals beschreven in stap 2.3.11.1.
   6. Centrifugeer zoals in stap 3.1.2 om de crypten te pelleteren, gooi het supernatant weg en resuspendeer in ijskoude 100% gereduceerde groeifactor basale membraan extracellulaire matrix (BME) om een concentratie van ongeveer 400 crypten/100 μl te bereiken.
      OPMERKING: het is belangrijk om BME goed te ontdooien bij 4 °C, aangezien temperatuurveranderingen de consistentie veranderen. Met behulp van een koelblok en voorgekoelde pipetpunten kan worden voorkomen dat de BME voortijdig stolt.
      1. Het gebruik van een andere formulering van de basaalmembraanmatrix kan verdunning van de BME vereisen bij het maken van koepels. Raadpleeg de instructies van de fabrikant die specifiek zijn voor de BME die wordt gebruikt.
   7. Pipetten op en neer om de crypten in de BME grondig op te hangen.
   8. Maak crypt-BME-domes door langzaam 50 μL crypt-BME-suspensie te pipetteren op een weefselkweekplaat met 6 putjes op een warmhoudplaat die is ingesteld op 37 °C met maximaal 8 koepels/putje.
      NOTITIE: De plaat met 6 putjes moet een nacht worden voorverwarmd in een incubator bij 37 °C voordat de koepels worden beplat.
   9. Houd de plaat met 6 putjes 1 minuut op de warmhoudplaat voordat u de plaat voorzichtig naar een incubator van 37 °C, 5% CO₂ -ketel verplaatst.
   10. Draai na 2 minuten de plaat met 6 putjes om zodat het deksel naar beneden is gericht en incubeer nog eens 30 minuten om de koepels te laten polymeriseren.
   11. Voeg na 30 minuten voorzichtig 3 ml enteroïde groeimedia op kamertemperatuur (RT) toe, aangevuld met 10 μM SB202190, 0,5 μM LY2157299 en 10 μM Y-27632 aan de putjes met koepels.
   12. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
   13. Verwijder media en vervang ze om de 2-3 dagen door nieuwe Enteroid Growth media aangevuld met remmers.
2. Passeren van enteroïden
   1. Zorg er na 7-10 dagen voor dat de crypten 3D-enteroïden hebben gevormd met veel ontluikende structuren, zoals in figuur 2E, en klaar zijn om te worden gepasseerd.
   2. Gooi de media weg uit de putten met koepels.
   3. Voeg voor elke 4 koepels per putje 1 ml ijskoude niet-enzymatische celdissociatieoplossing aangevuld met 10 μM Y-27632 toe aan elk putje met koepels.
   4. Gebruik een voorgecoate celschraper om de koepel voorzichtig los te maken van de weefselkweekplaat.
   5. Verzamel enteroïden in een conische buis van 15 ml en driestem door 10 keer op en neer te pipetteren.
   6. Incubeer de conische buis met de gefragmenteerde enteroïden bij RT op een orbitale schudder bij 80 tpm gedurende 10 minuten.
   7. Voeg 10 ml ijskoud wasmiddel met 10 μM Y-27632 toe aan de enteroïden.
   8. Centrifugeer de conische buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   9. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 10 ml vers wasmiddel en breng over naar een nieuwe conische buis van 15 ml.
   10. Centrifugeer de conische buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   11. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 1 ml Enteroid Growth Media in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
   12. Centrifugeer de microcentrifugebuis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
   13. Resuspendeer de enteroïde pellet in ijskoude 100% BME en volg de stappen 3.1.6-3.1.13.
   14. Repassage enteroïden om de 7 dagen. Expansietijden kunnen variëren als gevolg van de dichtheid, levensvatbaarheid en mate van ontluiking. Meerdere ontluikende structuren die grote enteroïde structuren creëren, zijn indicatief voor de enteroïden die moeten worden gepasseerd.
3. Cryopreservatie van enteroïden
   1. Voor cryopreservatie, Zorg ervoor dat de enteroïden niet meer dan vijf keer in cultuur worden gepasseerd.
      OPMERKING: Dit is niet experimenteel getest en is gebaseerd op de observatie van de auteurs dat latere passages de levensvatbaarheid hebben verminderd en wisselende resultaten opleveren.
   2. Gebruik voor het oogsten van de enteroïden de dissociatiebuffer zoals beschreven in de stappen 3.2.2-3.2.9.
      OPMERKING: Dissocieer de enteroïden mechanisch met behulp van een pipet van 5 ml.
   3. Tel het aantal enteroïde fragmenten zoals beschreven in stap 2.3.11.1.
   4. Centrifugeer de conische buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   5. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de enteroïde fragmenten in cryopreservatiemedia aangevuld met 10 μM Y-27632 om een concentratie van ~2000 enteroïde fragmenten/ml en aliquot 1 ml te bereiken in vooraf gelabelde cryovials.
   6. Plaats de cryovials in een gecontroleerde vriescontainer en bewaar ze een nacht bij -80 °C.
   7. Breng de cryovials over naar vloeibare stikstof in dampfase voor langdurige opslag.
4. Reanimatie van fragmenten van darmcrypten
   1. Plaats een bord met 6 putjes een nacht in de couveuse.
   2. Smeer een tube van 5 ml voor met 5 ml coatingmedia.
   3. Verwijder de cryovials uit de opslag van vloeibare stikstof.
   4. Breng onmiddellijk, eenmaal ontdooid, crypten over van de cryovial naar de voorgecoate buis van 5 ml. Spoel de cryovial uit met Wash Media en voeg toe aan de tube van 5 ml. Vermijd luchtbellen.
   5. Breng het volume op 5 ml met wasmiddel en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C .
   6. Smeer tijdens het centrifugeren een tube van 1,5 ml voor met coatingmedia.
   7. Giet na het centrifugeren het supernatant af, resuspendeer de pellet in het medium dat in de buis achterblijft en breng over naar de voorgecoate buis van 1,5 ml. Was de slang van 5 ml met wasmedia en breng deze over in een slang van 1.5 ml. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   8. Breng het volume op 1,5 ml met Enteroid Growth Media.
   9. Centrifugeer zoals hierboven beschreven (stap 3.4.7) en zuig voorzichtig op.
   10. Neem BME van 4 °C en leg op ijs/ijsblok.
   11. Resuspendeer de enteroïde pellet in ijskoude 100% BME en volg de stappen 3.1.6 - 3.1.12.
   12. Vervang de media elke 2-3 dagen.

4. Genereren en beoordelen van 2D-monolagen uit 3D-enteroïden

OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, moeten voor alle stappen waarbij crypten en enteroïden betrokken zijn, pipetpunten, celschrapers en buizen vooraf worden gecoat met de coatingbuffer en moeten luchtbellen worden vermeden om het verlies van crypten te voorkomen.

1. Voorbereiding van transwell-inserts voor 2D-monolaagvorming
   1. Plaats de inserts in een adapterplaat voor weefselkweek met 24 putjes en smeer de apicale zijde van 1 μm PET 24-well celkweekinserts voor met 100 μL 1:15 verdunning van BME in enteroïde groeimedia. Smeer altijd een extra inzetstuk in dat als controle zal worden gebruikt bij het uitvoeren van barrière-integriteitsmetingen.
   2. Plaats het gecoate inzetstuk in een weefselkweekadapterplaat met 24 putjes in de incubator.
      OPMERKING: Bij de transwell-inserts moet een specifieke adapter of begeleidende weefselkweekplaat worden gebruikt.
   3. Incubeer de kweekinserts bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 1 uur om polymerisatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: BME-gecoate transwells kunnen worden verzegeld met parafilm en maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden gebruikt.
   4. Aan het einde van de incubatie zuigt u het 3D-enteroïde kweekmedium op.
2. Dissociatie van 3D-enteroïden
   1. Genereer 2D-enteroïde monolagen uit gecryopreserveerde enteroïdefragmenten die zijn gereanimeerd, geplateerd en gekweekt zoals hierboven beschreven in paragraaf 3.1 om 3D-enteroïden te vormen. Passage de ontdooide enteroïden ten minste twee keer, waarbij de laatste passage minimaal 5 dagen wordt gekweekt voordat ze worden verwerkt om 2D-monolaagculturen te genereren.
   2. Oogst de enteroïden door ijskoude wasmedia aangevuld met 10 μM Y-27632 toe te voegen aan enteroïde koepels (gebruik ongeveer 1 ml dissociatiebuffer voor 4 koepels)
   3. Maak de koepels los met een celschraper en vang ze op in een conische buis van 15 ml.
   4. Tritureer 30 keer met een pipetpunt van 1 ml om enteroïde fragmenten te genereren.
   5. Tritureer 40 keer met een pipetpunt van 200 μl om de enteroïde fragmenten verder te breken.
   6. Breng het volume van de 15 ml conische buis met enteroïde fragmenten naar 10 ml met ijskoud wasmedium.
   7. Centrifugeer de conische buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   8. Zuig het supernatant op, inclusief de BME-laag, en zorg ervoor dat u de enteroïde pellet niet verstoort.
      OPMERKING: De BME-laag verschijnt als een troebele gelatinelaag net boven de pellet.
   9. Resuspendeer voor elke 4 koepels de pellet in 1 ml voorverwarmd TrypLE-express-enzym aangevuld met 10 μM Y-27632.
   10. Voeg het enteroïde-trypLE-mengsel toe aan een bord met 24 putjes en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C, 5% CO₂ .
   11. Pipetteer na 10 minuten het enteroïde-TrypLE-mengsel 40 keer met een pipet van 1 ml om de enteroïden verder te fragmenteren.
   12. Vervolgens pipettert u 40 keer met een pipet van 200 μL om de fragmenten in afzonderlijke cellen te breken.
   13. Gebruik een spuit van 3 ml of 5 ml met een steriele naald van 22 G eraan, zuig de celsuspensie op en doseer deze 4 keer om eencellige suspensie te bereiken.
   14. Bewaak de celdissociatie door middel van microscopie zoals beschreven in stap 2.3.11.1, totdat 80% van de enteroïden is afgebroken tot afzonderlijke cellen.
   15. Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 ml en blus de enzymatische reactie door 4x het volume wasmedia toe te voegen, aangevuld met 10% FBS.
   16. Filtreer de enteroïden tweemaal door een vooraf gecoate celzeef van 40 μm in een conische buis van 50 ml.
   17. Pelleteer de afzonderlijke cellen door de conische buis gedurende 5 minuten op 300 x g te centrifugeren.
3. 2D monolayer seeding op transwell inserts.
   1. Decanteer het supernatans en resuspendeer de pellet in een klein volume (~600 μL) organoïde groeimedia aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) bij RT.
   2. Bepaal de dichtheid en levensvatbaarheid van enteroïde cellen met behulp van de Trypan Blue-kleurstofuitsluitingsmethode, hemacytometer of geautomatiseerde celteller. Er wordt een gemiddelde levensvatbaarheid van 75% verwacht.
   3. Verwijder de overtollige coatingoplossing die in stap 1.3 is aangebracht voorzichtig van het celkweekinzetstuk vlak voor het zaaien van de cellen.
   4. Zaai de afzonderlijke cellen in 1 x 10⁵ cellen in een volume van 200 μL per insert op het apicale oppervlak van een vooraf gecoate celkweekinsert.
   5. Voeg 700 μL compleet medium aangevuld met 20% FBS toe aan de basolaterale zijde van het celkweekinzetstuk.
   6. Manoeuvreer de plaat 10 keer in de vorm van het cijfer 8 om de cellen gelijkmatig over het inzetstuk te laten verdelen.
   7. Houd het bord 10 minuten op de bordenwarmer in de bioveiligheidskast.
   8. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO₂ .
   9. Vervang na 48 uur de media op de apicale en basale compartimenten door verse Enteroid Growth Media aangevuld met 20% FBS en remmers.
   10. Verwijder op de derde dag de media uit de apicale en basolaterale compartimenten, was het inzetstuk zorgvuldig met 1x PBS en vervang het door enteroïde differentiatiemedia aangevuld met alleen remmers.
   11. Vervang de media in beide compartimenten elke 2-3 dagen.
4. Kwantitatieve meting van de integriteit van de epitheliale barrière en de samenvloeiing van monolagen
   NOTITIE: De integriteit van de barrière kan worden beoordeeld door een epitheliale voltohmmeter te gebruiken om de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) te meten.
   1. Haal de transwell-kweekplaat uit de incubator en laat deze enkele minuten op RT balanceren in de bioveiligheidskast.
   2. Zorg ervoor dat de STX2-elektroden zijn voorgeconditioneerd en dat de voltohmmeter is gekalibreerd op 1000Ω volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Steek de lange staaf van de sonde in het basolaterale compartiment en het korte uiteinde in het apicale compartiment van de transwell-epitheelcelcultuur. Zorg ervoor dat u de monolaag niet verstoort of het inzetstuk beschadigt.
   4. Eenmaal stabiel, registreer dan 3 TEER-metingen per transwell-inzetstuk, inclusief het inzetstuk zonder cellen. Neem een gemiddelde van de afmetingen voor elke insert.
   5. Bereken de gecorrigeerde TEER-waarde door de gemiddelde meting van de blanco put af te trekken van de gemiddelde afmetingen van de experimentele putjes en deze vervolgens te vermenigvuldigen met het oppervlak van de insert om de weerstand van de epitheelbarrière te bepalen (TEER [Ω.cm²] = [Rcell-laag - Rblank] × Area).

Resultaten

De eerste stap bij het genereren van 2D-enteroïde-afgeleide monolagen is het voorbereiden van het geoogste deel van het darmweefsel (Figuur 1A) op weefseldissociatie. Dit wordt gedaan door het aangehechte vet en het mesenterium uit het weefsel te verwijderen (Figuur 1B), gevolgd door het weefsel in de lengterichting door te snijden om het lumenoppervlak bloot te leggen, zodat de slijmlaag van de darm kan worden verwijderd door voorzichtig te schrapen met behulp van een glasplaatje. Het geoogste darmgedeelte wordt vervolgens in steeds kleinere weefselsecties gesneden (figuur 1C) om het gemak van dissociatie te vergroten. Crypten worden vervolgens losgekoppeld van het onderliggende submucosale weefsel met behulp van een reeks wasbeurten bestaande uit chelatiebuffers (figuur 1D,E) en PBS. De geïsoleerde darmcrypten (Figuur 1F) worden vervolgens ingebed in koepels van de basale membraanmatrix (Figuur 2A) en gedurende enkele dagen gekweekt om 3D-enteroïden te genereren. Uit een 10-inch sectie van runderileum kunnen ongeveer 900.000 crypten worden geïsoleerd en gebruikt voor de vorming van enteroïden. Na slechts een paar uur in cultuur te zijn geweest, beginnen de vergulde crypten zich uit te rekken en zich te ontwikkelen tot enterosferen (Figuur 2B). Na 2 dagen kan een goed gedefinieerd lumen worden waargenomen (Figuur 2C), waarbij al op dag 4 in de kweek ontluikende structuren worden opgemerkt (Figuur 2D). Op dag 7 hebben zich volwassen enteroïden ontwikkeld (Figuur 2E). De immunofluorescentiekleuring van 7 dagen oude 3D-enteroïde toont de aanwezigheid van verschillende cellijnen aan. Confocale microscopie van enteroïden demonstreert lokalisatie van DAPI-nucleaire kleuring, E-cadherine-eiwit op de adherens-overgang, chromogranine-A (Chr-A)-kleuring die de aanwezigheid van entero-endocriene cellen aantoont, lysozym (LYZ) dat Paneth-cellen aantoont, en cytokeratine-18 (CK-18) dat enterocytcellen vertegenwoordigt in figuur 3. Na 7-10 dagen in kweek moeten de enteroïden worden gepasseerd om verdere expansie mogelijk te maken en overbevolking te voorkomen. De optimale tijd om enteroïden te passeren werd vastgesteld op 7-10 dagen na de eerste isolatie van de primaire crypte en is uiteindelijk afhankelijk van de gezondheid en groeisnelheid van enteroïden in cultuur. De optimale zaaidichtheid om de gewenste enteroïde morfologie en levensvatbaarheid te bereiken, zoals weergegeven in figuur 2E, is 400 crypten per koepel. Enteroïden kunnen gemakkelijk worden gecryopreserveerd en de ontdooide enteroïde fragmenten herstellen volledig voor experimenteel gebruik na twee passages na het ontdooien. Met name worden ten minste twee passages van de primaire cryptecultuur aanbevolen voordat cryopreservatie plaatsvindt.

Om een 2D-enteroïde-afgeleide monolaag te produceren, worden de 3D-enteroïden geoogst en in een reeks stappen mechanisch getritureerd in aanwezigheid van een dissociatieoplossing (Figuur 4A) in afzonderlijke cellen. Deze afzonderlijke cellen kunnen vervolgens worden gezaaid op een transwell-wisselplaat die vooraf is gecoat met een matrix-kweekmedia-oplossing van het basaalmembraan. Gemiddeld kunnen vier transwells worden gezaaid uit vier 3D-enteroïde koepels. Het aantal verwerkte 3D-enteroïden is dus afhankelijk van het aantal transwells dat nodig is voor het experiment. Het plateren van afzonderlijke cellen met een zaaidichtheid van 1 x 10⁵ en ze aanvankelijk kweken in aanwezigheid van 20% FBS (Figuur 4B-D) kan in minder dan 1 week een confluente monolaag genereren. De progressieve samenvloeiing van de 2D-monolaag in cultuur kan in de loop van de tijd worden gevolgd met behulp van lichtmicroscopie (Figuur 4E,F). Transepitheliale elektrische weerstand (TEER)-metingen kunnen confluentie bevestigen en de integriteit van de epitheliale barrière in de loop van de tijd en als reactie op experimentele stimulatie karakteriseren (Figuur 5A). Gemiddeld zal een ongeveer 100% confluente monolaag na zeven dagen in cultuur een overeenkomstige TEER-waarde hebben van ~1500 Ω·cm². Een longitudinale beoordeling van de TEER-waarden van 2D-enteroïde monolagen toont een gestage stijging van de TEER-waarden gedurende zeven dagen, waarbij een maximale gemiddelde waarde van 1546 Ω·^cm2 werd bereikt alvorens af te nemen met de laagste waarde van 11,5 Ω·^cm2 verkregen op dag twaalf (figuur 5B). Immunofluorescerende etikettering van gedifferentieerde monolagen geeft aan dat intacte, georganiseerde, gepolariseerde darmepitheelvellen worden gevormd met behulp van dit protocol (Figuur 6). Confocale microscopie van de gekleurde 2D-monolaag toont lokalisatie van DAPI-nucleaire kleuring, E-cadherine en F-actinekleuring (Figuur 6A-D). Fluorescentiemicroscopie van de 2D-monolaag vertoont kenmerken van gedifferentieerde darmepitheelcellen met chromogranine-A (Chr-A)-kleuring die de aanwezigheid van entero-endocriene cellen aantoont, lysozym (LYZ) die Paneth-cellen aantoont en cytokeratine-18 (CK-18) die enterocytcellijnen aangeeft (Figuur 6E-L). Z-stack-modellering toont de verwachte polarisatie van de 2D-monolaagcultuur met karakteristieke afzetting van F-actine die wordt aangetroffen in de microvilli die het apicale aspect van de gedifferentieerde enterocyten bedekken en E-cadherine, een eiwit dat zich bevindt op de adherens-juncties tussen epitheelcellen (Figuur 6M).

De functionaliteit van de monolaag kan worden beoordeeld door apicale stimulatie met verschillende componenten, waaronder Toll-like receptor (TLR) liganden of pathogenen, gevolgd door cytokinekwantificering van supernatanten van celculturen die worden geoogst uit de apicale en basale compartimenten. Inderdaad, wanneer het apicale aspect van de monolaag gedurende 24 uur wordt gestimuleerd met de TLR 1/2-agonist Pam3csk4 op dag 4 van de kweek, wordt een verhoogde cytokineproductie in beide compartimenten waargenomen in vergelijking met de onbehandelde monolagen (Figuur 7A,B).

Figuur 1: Isolatie van de darmcrypte van runderen van gezonde volwassen runderen. Afbeeldingen die de weefselverwerking illustreren van (A) ileum van hele volwassen runderen, (B) ontvet ileum, (C) ileum verdeeld in stukjes van 2,5 inch (6,3 cm) in PBS op ijs, (D) delen van ileumweefsel in dissociatiebuffer #1 bij 4 °C, en (E) in dissociatiebuffer 2 in een schudwaterbad bij 37 °C, en (F) geïsoleerde ileale cryptefragmenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Ontwikkeling van boviene primaire 3D ileale enteroïden in de basale membraanmatrix. Representatieve beelden van (A) 3D-enteroïde koepels gemaakt in een weefselkweekplaat met 6 putjes en (B-E) 3D-enteroïde-ontwikkeling vanaf dag 0, 2, 4 en 7 in kweek. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Driedimensionale darmenteroïden vertonen kleuring van epitheelcellen. Representatieve beelden van 3D-enteroïden na 7 dagen in kweek tonen de aanwezigheid aan van nucleaire kleuring, F-actine, cytokeratine-18 (CK-18), Chromogranine-A (Chr-A), Ecadherine (E-cad), Lysozym (Lyz) en overlay van afbeeldingen (Merge). Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vaststelling van een 2D-enteroïde-afgeleide monolaag uit ileale enteroïden. Representatieve beelden van (A) 3D-enteroïde fragmenten in dissociatieoplossing ter voorbereiding op het zaaien van monolagen, enkelvoudige cellen geplateerd op een transwell-insert met een seeding-dichtheid van 1 x 10⁵ afgebeeld op dag 0 met behulp van (B) licht, (C) fasecontrast, en (D) helderveldmicroscopie, en monolaagontwikkeling op transwell-inserts afgebeeld op dag vijf met behulp van (E) fasecontrast en (F) helderveldmicroscopie. 40x vergroting en schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen van de 2D enteroïde-afgeleide monolaag op transwell inserts. (A) Schematisch diagram van de wijze waarop TEER-metingen van de 2D-monolaag van de intestinale epitheelcellen (IEC) worden verkregen met behulp van de STX2-eetstokje-elektroden van een voltohmmeter, (B) Longitudinale monitoring van 2D monolayer TEER-metingen gedurende 12 dagen in celkweek. Elk datapunt vertegenwoordigt een gemiddelde TEER-waarde en een standaardfout van het gemiddelde (SEM) verkregen uit twee technische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Gedifferentieerde 2D-enteroïde-afgeleide monolagen op transwell-inserts ontwikkelen zich tot gepolariseerde darmepitheelvellen. (A-M) Representatieve immunofluorescerende beelden van een 2D-enteroïde-afgeleide monolaag op transwell-insert na 5 dagen in kweek met de (A) kern (blauw), (B) E-cadherine (rood), (C) F-actine (groen) en (D) overlay van de 3 afbeeldingen (samenvoegen), (E,I) Nucleaire kleuring, (F) Chromogranine-A, (J) Cytokeratine-18, (G,K) Lysozym en (H,L) Samenvoegen van afbeeldingen. (M) Z-stack-modellering die de verdeling van dezelfde epitheelcelmarkereiwitten van de 2D-monolaagplaat laat zien. Beelden werden verkregen van 2 biologische replicaten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Primaire 2D-enteroïde-afgeleide monolagen van runderen op transwell-inserts zijn functioneel actief. Apicale en basale celkweek supernatante cytokinesecretie van (A) IL-1α en (B) IL-8 door 2D-monolagen op transwell-inserts na 5 dagen in kweek die gedurende 24 uur onbehandeld of gestimuleerd waren met Pam3csk4. De gegevens zijn representatief voor de gemiddelde cytokineniveaus en SEM van monolagen die zijn afgeleid van bevroren voorraden crypten van één dier en drie onafhankelijke experimenten. Cytokinen werden gekwantificeerd met behulp van de op kralen gebaseerde multiplextest (Table of Materials) volgens de instructies van de fabrikant en geanalyseerd op een compacte multiplexing-eenheid (Table of Materials) en immunoassay-curve-aanpassingssoftware (Table of Materials). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: De voorraad en de eindconcentraties van de reagentia. Klik hier om de tabel te downloaden.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een fysiologisch relevant model voor het onderzoeken van darmfysiologie en darmaandoeningen. Verschillende onderzoeksgroepen hebben het ontstaan van runderenteroïdeculturen beschreven, waaronder 2D-monolagen 16,19,20,21,22,23,24. Hoewel het genereren van monolagen technisch niet al te uitdagend is, zijn stappen van enkele minuten van cruciaal belang om consequent succesvolle culturen te ontwikkelen. Als zodanig kan de reproduceerbaarheid van 2D-monolagen met behulp van de kort beschreven methoden in de gepubliceerde literatuur een uitdaging zijn voor een beginnende onderzoeker op het gebied van organoïden. Het hierin beschreven protocol is aangepast van deze protocollen en de protocollen die bij andere soorten zijn gepubliceerd, en biedt een stapsgewijze handleiding voor het genereren van monolagen op transwell-inserts die zeer reproduceerbaar is.

Het hierin beschreven protocol kan eenvoudig worden aangepast aan de specifieke doelen van het experimentele ontwerp of de beschikbaarheid van reagentia. Volgens dit protocol kunnen succesvolle culturen inderdaad worden bereikt door monolagen te zaaien met een lagere celdichtheid (bijv. 2,5 x 10⁴) of in afwezigheid van FBS, zoals beschreven in andere publicaties²⁴. Het wijzigen van deze parameters kan echter een verhoogde cultuur vereisen om een confluente monolaag tot stand te brengen. Als andere factoren die integraal deel uitmaken van het onderzoeksontwerp, waaronder co-cultuur met immuuncellen, een specifiek tijdsverloop voor het experiment dicteren, kan de zaaidichtheid indien nodig worden gewijzigd. Hoewel andere basaalmembraanformuleringen kunnen worden vervangen in plaats van degene die in dit protocol wordt gebruikt om 3D-enteroïden en 2D-monolagen te genereren, zullen deze enige optimalisatie vereisen om de optimale verhouding tussen basaalmembraan en media te bepalen.

De toepassing van transwell-inserts in de beschreven methodologie heeft veel voordelen ten opzichte van monolaaggroei op conventioneel plastic en 3D-enteroïde culturen. Vergeleken met standaard weefselkweekplaten, bevordert het gebruik van transwells voor monolaagculturen cellulaire differentiatie en organisatie op een manier die gelijkenis met darmcrypten behoudt^14,25. De darmepitheelbarrière is van vitaal belang om de translocatie van gifstoffen en micro-organismen in het lichaam te voorkomen en tegelijkertijd de opname van voedingsstoffen te vergemakkelijken. Als zodanig is het van cruciaal belang om te begrijpen hoe de barrière-integriteit van de darm functioneert in gezonde en wordt veranderd tijdens darmstoornissen of als reactie op verbindingen. In tegenstelling tot 3D-enteroïde culturen is een objectieve beoordeling van de integriteit van de darmbarrière mogelijk bij het combineren van monolagen op transwells en het meten van TEER, zoals hierin wordt aangetoond^14,25. Het genereren van 2D-monolagen op transwells maakt ook dubbele kweek mogelijk met relevante celtypen zoals immuun- of stromale cellen. Hierdoor kan kritisch belangrijke overspraak tussen darmcellen en cellen van de weefselmicro-omgeving worden gekarakteriseerd, wat niet kan worden bereikt met 3D-culturen. Blootstelling aan het apicale oppervlak van de monolaag maakt niet alleen experimentele blootstelling aan ziekteverwekkers en verbindingen en het verzamelen van luminale producten mogelijk, maar maakt ook onderzoek mogelijk naar andere aspecten van darmfysiologie en -ziekte, waaronder het onderzoek naar de darmmicrobiota en de moleculaire absorptie- of transportfysiologie¹³. Onafhankelijke controle over de apicale en basale darmoppervlakken is een duidelijk voordeel ten opzichte van 3D-enteroïde modellen.

Door middel van verschillende proefexperimenten hebben we de belangrijkste stappen geïdentificeerd die hebben bijgedragen aan het succes van het protocol. Hoewel weefselmonsters van de hele darm 's nachts kunnen worden gekoeld en de volgende dag kunnen worden verwerkt, moeten de weefseldissociatie en isolatie van cryptefragmenten onmiddellijk worden uitgevoerd om het uiteenvallen van de geïsoleerde cryptefracties te voorkomen. Na het voltooien van de PBS-wasbeurten kan het centrifugeren van de crypten in wasmedia helpen om het afbreken van de crypte te voorkomen, zoals beschreven in stap 2.3.10. Bij het passeren van de enteroïden of het oogsten ervan voor monolaagvorming, is het essentieel om de enteroïden te scheiden van de BME-koepels. Het wasmedium moet ijskoud zijn om te helpen bij het oplossen van de BME. Daarentegen kan het gebruik van voorverwarmde TrypLE en het tweemaal filteren van de celsuspensie helpen bij het vormen van de afzonderlijke cellen die nodig zijn voor het genereren van monolagen. Ten slotte kan het handmatig manoeuvreren van de plaat in de vorm van het cijfer 8 helpen om de afzonderlijke cellen gelijkmatig over het transwell-inzetstuk te verspreiden.

Een belangrijke beperking van dit protocol is dat de 2D-monolagen zijn geproduceerd uit enteroïde voorraden die zijn gegenereerd uit een volwassen Holstein-os (>2 jaar oud). Het rijpende maagdarmkanaal bij kalveren kan kleine aanpassingen in het beschreven protocol noodzakelijk maken om optimale resultaten te verkrijgen. In de literatuur zijn rasspecifieke verschillen in de darmfysiologie van runderrassen beschreven²⁶. Hoewel het niet bekend is of deze verschillen van invloed kunnen zijn op enteroïde en de daaropvolgende monolaaggeneratie, vermoeden we dat eventuele verschillen zouden resulteren in slechts kleine wijzigingen in ons protocol. Bovendien heeft het 2D-cultuurmodel enkele inherente nadelen. In vergelijking met 3D-enteroïde modellen kunnen 2D-culturen sommige aspecten van de darmweefselarchitectuur en cellulaire diversiteit missen en beperkingen en uitdagingen creëren die verband houden met de verspreiding van 2D-cultuur¹³. Toch tonen studies aan dat sommige monolagen de verwachte crypte-organisatie kunnen nabootsen²⁷, en sommige van deze beperkingen kunnen zelfs worden overwonnen door 2D-culturen tot stand te brengen met een lucht-vloeistofinterface. Niettemin moeten de beperkingen van dit model volledig in overweging worden genomen om te bepalen of de toepassing ervan geschikt is voor de experimentele vraag die wordt gesteld.

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd kweeksysteem dat het maagdarmkanaal van het rund modelleert met behulp van enteroïden die zijn afgeleid van het runderileum om monolagen te vormen op transwell-inserts. Met een breed scala aan toepassingen, van onderzoek naar infectieziekten tot het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde, zou dit high-throughput kweeksysteem kunnen leiden tot de ongekende ontwikkeling van preventieve en therapeutische strategieën die voor beide partijen voordelig kunnen zijn voor de gezondheid van mens en dier.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 mL pipette tip	MidSci	PR-200RK-S
1 µm PET 24-well cell culture inserts	Corning	353104
1000 mL pipette tip	MidSci	PR-1250RK-S
22 G naald	Becton, Dickinson and Company	305156
24-well kweekvat	Corning	353504
40 μm celzeef	Corning	431750
50 mL centrifugebuis	Fisher scientific	14-955-240
5-mL pipet tip	Fisher scientific	30075307
5 mL spuit	Becton, Dickinson and Company	309647
5 mL buis	Eppendorf	30119401
Anti-Cytokeratin -18 (C-04)	Abcam	AB668-1001
B-27 supplement zonder vitamine A	Gibco	12-587-010
Belysa software	Luminex	40-122	Immunoassay curve fitting software
Bovine serum albumine (BSA)	Fisher bioreagents	BP9704-100
Caspofungine acetaat	Selleckchem	S3073
Cellifter	Fisher Scientific	08-100-241
Chromogranin-A (E-5)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271738
Dekglasjes	Fisher scientific	12-540-C
Cryovials	Neptune scientific	3471.X
Cultrex Ultimatrix RGF BME	R&D Systems	BME001-05
DAPI	MilliporeSigma	D9542-5MG
Dissectie schaar	VWR	82027-588
Dithiothreitol (DTT) oplossing	Thermo Scientific	FERR0861
DMEM/ F-12 1.1 medium (met L-glutamine, zonder HEPES)	Cytiva	SH30271.01
E-cadherin	Cell Signaling Technology	#3195
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Fisher Scientific	BP2482500
FBS	Corning	MT35070CV
Gentamicine	Gibco	15710064
Glijplaatje voor microscoop	Fisher scientific	12-550-07
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Hemacytometer	Bio-Rad	1450015
IntestiCult organoïd differentiatiemedium (Mens)	StemCell Technologies	100-0214
IntestiCult organoïd groeimedium (Mens)	StemCell Technologies	0-6010
Keyence BZ-X700	Keyence	BZ-X700
LY2157299 (Galunisertib)	Selleckchem	S2230
MAGPIX systeem	Luminex	Magpix systeem	Compact multiplexing unit
Microscoop	Keyence	BZ-X700
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel	MilliporeSigma	BCYT1-33K	Bead-based multiplex assay
Mr. Frosty container	Nalgene	5100-0001
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution	ATCC	30-2103
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media	Biological Industries	05-713-1B
Orbitaal schudden platform	Thermo Fisher	88880021
Pam3Csk4	invivogen	tlrl-pms
Parafilm sealing film	dot scientific inc.	#HS234526C
Paraformaldehyde 16% oplossing	Electron Microscopy Sciences	15710
Phalloidin-FITC	R&D Systems	5782/12U
Fosfaat buffer oplossing	Fisher Scientific	BP399-20
Prolong Glass Antifade	Invitrogen	P36982
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17)	Agilent technologies	A009902-2
SB202190 (FHPI)	Selleckchem	S1077
Schudden waterbad	Thermo Fisher	MaxQ 7000
Natriumazid	VWR	BDH7465-2
Streptomycine	Teknova	S6525
Trypan Blauw kleurstof	Gibco	15250-061
TrypLE express enzym	Life technologies	12604013
Tween 20	Fisher Scientific	BP337
Voltohmmeter	MilliporeSigma	Millicell ERS-2
Y-27632	Selleckchem	S1049