Methodenartikel

Real-time analyse van neurale communicatie tussen darmen en hersenen: cortexbrede calciumdynamiek als reactie op intestinale glucosestimulatie

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65902

⸱

29 december 2023

 , 
1Department of Biology, Faculty of Science, Ochanomizu University

In dit artikel

Samenvatting

Communicatie tussen darmen en hersenen, gefaciliteerd door de nervus vagus, is cruciaal voor de communicatie tussen het gastro-intestinale endocriene systeem en de hersenen. Het is echter nog steeds niet duidelijk of intragastrische glucose-injectie de corticale activiteit kan veranderen. Hier bieden we een uitgebreid protocol om veranderingen in corticale activiteit te observeren na glucose-injectie in de twaalfvingerige darm.

Samenvatting

Communicatie tussen het maagdarmkanaal en de hersenen na opname van voedingsstoffen speelt een essentiële rol bij voedselvoorkeur, metabolisme en voedingsgedrag. Vooral met betrekking tot specifieke voedingsstoffen hebben veel onderzoeken opgehelderd dat de assimilatie van glucose in darmepitheelcellen de activering van veel signaalmoleculen op gang brengt. Hormonen zoals glucagon-achtig peptide-1 staan bekend als typische signaalmediatoren. Omdat hormonen de hersenen voornamelijk beïnvloeden via de bloedsomloop, moduleren ze langzaam de hersenactiviteit.

Recente studies hebben echter twee snelle darm-hersenroutes aangetoond die worden gefaciliteerd door het autonome zenuwstelsel. De ene werkt via de spinale afferente neurale route, terwijl de nervus vagus de andere bemiddelt. Bijgevolg zijn de hersenreacties na glucose-assimilatie in het maagdarmkanaal gecompliceerd. Bovendien, aangezien darmstimulatie uiteindelijk diverse corticale activiteiten induceert, waaronder sensorische, nociceptieve, belonings- en motorische reacties, is het noodzakelijk om methodologieën te gebruiken die de visualisatie van gelokaliseerde hersencircuits en pan-corticale activiteiten vergemakkelijken om de neurale overdracht van de darmhersenen volledig te begrijpen. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat de concentraties van calciumionen (Ca 2+) in de hypothalamus en het ventrale tegmentale gebied onafhankelijk van elkaar via verschillende routes na darmstimulatie voorkomen. Of er veranderingen zijn in de activiteit van de hersenschors is echter niet bekend.

Om de activiteit van de cerebrale cortex na intragastrische glucose-injectie te observeren, hebben we een beeldvormingstechniek ontwikkeld voor real-time visualisatie van de cortexbredeCa 2+ -dynamiek door een volledig intacte schedel, met behulp van transgene muizen die genetisch gecodeerdeCa 2+- indicatoren tot expressie brengen. Deze studie presenteert een uitgebreid protocol voor een techniek die is ontworpen om door darmstimulatie geïnduceerde transcraniële cortexbrede Ca2+ -beeldvorming te monitoren na intragastrische glucose-injectie via een geïmplanteerde katheter. De voorlopige gegevens suggereren dat het toedienen van glucoseoplossing in de darm de frontale cortex activeert, die niet meer reageert op watertoediening.

Inleiding

In de eerste plaats vindt darmdetectie van glucose plaats via de zoete smaakreceptoren (Tas1r2, Tas1r3) en de natrium-glucose-cotransporter 1 (SGLT-1) die zich in entero-endocriene cellen in het darmlumen 1,2,3,4,5,6 bevinden. Het gevoel van glucose in de hersenen is een proces dat zich doorgaans uitstrekt van minuten tot uren na opname uit de darm, een gebeurtenis die voornamelijk gebaseerd is op verhoogde plasmabloedsuikerspiegels en de afgifte van hormonen 7,8,9,10,11 (bijv. glucagon-achtig peptide-1 [GLP-1], Peptide YY (PYY) en glucose-afhankelijk insulinotroop polypeptide [GIP]). Ze bereiken de boogvormige kern van de hypothalamus (ARC), waar ze pro-opiomelanocortine (POMC) neuronen en agouti-gerelateerde proteïne (AgRP) neuronen binden via de bloedstroom en de nervus vagus (parasympathische zenuw)12,13,14. De verandering in de activiteit van deze neuronen leidt tot controle van het metabolisme en het voedingsgedrag15,16.

Recente literatuur benadrukt steeds meer het belang van neurale signalering van de darmhersenen na glucoseabsorptie. Deze complexe route kan grofweg worden onderverdeeld in twee primaire mechanismen. De eerste betreft de activering van spinale afferenten, die uiteindelijk de neuronale activiteit van AgRP in de ARC beïnvloeden. Het tweede mechanisme omvat stimulatie van de nervus vagus door verbindingen met epitheelcellen. Gezien de veelzijdige manieren waarop darmepitheelcellen de nervus vagus13 kunnen activeren, wordt zijn rol als veelzijdig beschouwd.

Een aanzienlijk deel van de activiteiten van de darm-, vagus- en spinale afferente zenuw wordt in verband gebracht met voedingsgedrag 17,18,19. Er zijn echter opkomend bewijs dat bepaalde vezels van de nervus vagus, die uitsteken op "neuropod-cellen", betrokken zijn bij de voorkeur voor glucose. Neuropod-cellen, een subset van entero-endocriene cellen, brengen SGLT-1 tot expressie aan hun luminale kant en brengen sensorische prikkels over naar een nervus vagus via glutamaterge synapsen 2,20,21,22. Activering van de nervus vagus activeert dopaminerge neuronen in het ventrale tegmentale gebied (VTA) binnen enkele seconden19. Met name het remmen van vagale activering, met name in de twaalfvingerige darm, met behulp van een glutamaatantagonist, vermindert de voorkeur voor sucrose bij muizen1. Dit onderstreept de cruciale rol van neuropod-celactivering bij het moduleren van voedselkeuzegedrag na glucose-inname2.

Ondanks deze vooruitgang blijft een grondig begrip van de snelle intestinale glucosedetectiemechanismen en hun effect op corticale activiteiten een complex raadsel. Hoewel de hersenactivatie die wordt gecontroleerd door AgRP-neuronen de hersenschorsniet omvat 23, is het bekend dat dopaminerge neuronen in het VTA-project naar de hersenschors leiden. Het is echter onbekend of snelle VTA dopaminerge neuronale activering na glucosedetectie de hersenschors echt activeert. Om dit mechanisme op te helderen, onderzochten we het potentieel voor intragastrische glucosetoediening om de corticaleCa 2+- dynamiek snel te beïnvloeden bij transgene muizen die een genetisch gecodeerde calciumindicator tot expressie brengen.

Dit artikel presenteert een goedkope en minder invasieve methode om de veranderingen in corticale activiteit na intragastrische toediening van glucose volledig te begrijpen met behulp van cortexbrede Ca2+- beeldvorming bij muizen Onlangs heeft de transcraniële cortexbrede Ca2+ -beeldvormingstechniek door middel van een intacte schedel, met behulp van transgene muizen die genetisch gecodeerde calciumindicatoren tot expressie brengen, aan populariteit gewonnen24. Met name de BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 transgene muislijn (ook bekend als G7NG817 muis) die in deze studie wordt gebruikt, brengt de Ca2+ -sensor, G-CaMP7, tot expressie in neuronen en astrocyten25. Vanwege de hoge expressiedichtheid in de hersenschors is deze transgene muislijn bijzonder geschikt voor transcraniële cortexbredeCa 2+- beeldvorming met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop.

Protocol

Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Ochanomizu University, Japan (protocollen voor dierstudies 22017). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor dierproeven van de Ochanomizu Universiteit die voldoen aan de Fundamentele Richtlijnen voor het Correct Uitvoeren van Dierproeven en Aanverwante Activiteiten in Academische Onderzoeksinstellingen (Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan). Er werden inspanningen geleverd om het aantal gebruikte dieren tot een minimum te beperken. Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen.

1. Bereiding van transgene muizen

  1. Om dit experiment te volgen, gebruikt u de volwassen mannelijke en vrouwelijke BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 transgene muizenlijn, namelijk G7NG817 muizen24,25 (ouder dan 8 weken). De achtergrondstam van G7NG817 muizen25 is C57BL/6J.
  2. Huisvest de muizen onder een licht/donkercyclus van 12 uur / 12 uur en voed ze op in groepen van maximaal vijf muizen.

2. Aanmaak van een katheter

  1. Gebruik een schaar om de siliconenbuis (binnendiameter 0,5 mm, buitendiameter 1,0 mm) op een precieze lengte van 7 cm af te stellen (Figuur 1A-a).
    OPMERKING: Voorafgaand aan de procedures werden de schaar en de siliconenbuis gesteriliseerd.
  2. Plak kleine plastic korrels (binnendiameter 3 mm, buitendiameter 5 mm) op de op maat gemaakte buis en zorg ervoor dat ze zich op 3 mm van het eindpunt bevinden (Figuur 1A-b). Bevestig de kralen stevig met cyanoacrylaatlijm (medische of standaardvarianten zijn acceptabel).
  3. Snijd de top van een naald van 23 G weg en snijd vervolgens 1,5 cm van de naaldpunt af (figuur 1A-c).
  4. Steek de doorgesneden naald van 23 G uit stap 2.3 in het uiteinde van de siliconenbuis, tegenover de plaats waar de kralen waren bevestigd (Figuur 1A-d).

3. Creatie van injectoren

  1. Gebruik een steriele tang om 1 cm van de naaldpunt weg te snijden (Figuur 1B-a).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de opening aan het afgesneden uiteinde zijn integriteit behoudt en niet vervormd raakt, aangezien elke vervorming de stroom van de injectieoplossing kan belemmeren.
  2. Koppel de aangepaste injectienaald van 23 G uit stap 3.1.1 aan een spuit van 2,5 ml (Figuur 1B-b).
  3. Segmenteer een siliciumbuisje op de vereiste lengte (een siliciumbuisje van 15 cm in dit experiment) en verdeel het over de injectienaald van 23 G (figuur 1B-c).
    NOTITIE: Het volume van de afgegeven oplossing fluctueert op basis van de lengte van de slang. Met een buis van 15 cm bijvoorbeeld, zal ongeveer 50 μL oplossing na het experiment blijven hangen.
  4. Snijd de injectienaald van 23 G 1,5 cm van de naaldpunt af.
  5. Verbind het gesegmenteerde gedeelte uit stap 3.4 met de siliconenkatheter die in stap 3.3 is gemaakt (Figuur 1B-d).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de openingen die in stap 3.1 en 3.4 zijn gemaakt, na de incisie onvervormd blijven. Als rectificatie nodig is, gebruik dan een tang om de cirkelvormige configuratie te herstellen.

4. Lokalisatie van de maag

  1. Dien anesthesie toe aan de muis via inhalatie van 3,0% isofluraan in een gespecificeerde kamer. Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen.
  2. Breng de verdoofde muis voorzichtig over van de inhalatiekamer naar de operatietafel nadat u de verdoofde toestand van de muis hebt gecontroleerd. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens de procedure.
  3. Leg de muis op de rug, lijn zijn mond uit in de buurt van het inhalatieapparaat en moduleer de isofluraanconcentratie van 3,0% tot 2,0%.
    NOTITIE: Maak het onderste segment van het isofluraanmasker los van zijn superieure tegenhanger en veranker het gescheiden masker (bovenste segment) met plakband aan de operatietafel.
  4. Vul de mondholte, voorpoten en achterpoten van de muis aan op de operatietafel met plakband.
    OPMERKING: Door de muis aan de tafel te bevestigen, kunnen chirurgische fouten als gevolg van beweging worden voorkomen, zelfs als de muis onder narcose is.
  5. Verwijder het haar van de muis van de linkerbovenbuik (150% van het gebied rond de operatieplaats) met behulp van ontharingscrème. Breng plaatselijk een lokale pijnstiller aan op de plaats van de operatie en wacht 5 minuten voordat u verder gaat.
  6. Breng een plaatselijke verdovingsgel aan op de buikhuid en wacht 5 tot 10 minuten. Desinfecteer vervolgens het operatiegebied 3 keer met afwisselende rondes jodofoor en 70% ethanol. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen en bedek het dier met steriele operatiedoeken. Maak een incisie in de huid van ongeveer 1,5 cm lang (Figuur 1C-b), 1 cm rechts van de mediaan van de buik en 5 mm onder de processus xiphoid (Figuur 1C-c). Maak vervolgens een incisie van 1,5 cm in de buikwand op dezelfde plaats als de eerste incisie in de huid.
    OPMERKING: Wees voorzichtig om schade aan de onderliggende lever te voorkomen.
  7. Verplaats de linker leverkwab voorzichtig zijwaarts met behulp van een stompe pincet, zodat de maag eronder zichtbaar wordt.

5. Inbrengen van de katheter

  1. Til de maag op en haal deze voorzichtig los via de incisie.
    OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig om de integriteit van aangrenzende organen, met name de lever, te behouden en oefen geen onnodige kracht uit op de maag.
  2. Gebruik een schaar om een kleine perforatie (ongeveer 1,5 mm in diameter) in het pylorische antrum te maken.
  3. Breng het eindpunt van de katheter in de perforatie en zorg ervoor dat de kraal in direct contact staat met het pylorische antrum.
    OPMERKING: De katheter wordt vóór het inbrengen gedesinfecteerd met een 0,1 tot 0,5% chloorhexidinegluconaatoplossing.
  4. Plak de kraal van de katheter op de maag met behulp van cyanoacrylaatlijm van medische kwaliteit.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de maag losstaat van de omliggende organen.
  5. Controleer of de katheter stevig aan de maag is bevestigd en plaats de maag vervolgens voorzichtig terug op zijn aangeboren plaats onder de linker leverkwab.
  6. Hecht de buikwand en laat de katheter uitwendig strekken met behulp van een polydioxanon (PDS) hechtdraad. Sluit daarna de huidincisie op een manier die analoog is aan de sluiting van de buik.
  7. Plaats de muis voorzichtig terug in een ontsmette kooi.
    OPMERKING: Postoperatieve muizen moeten afzonderlijk worden gehuisvest. Breng plaatselijk een lokale pijnstiller aan op de wondsluiting en volg de pijnstillende plannen zoals aanbevolen door de lokale institutionele richtlijnen.
  8. Houd rekening met een minimale herstelperiode van 48 uur in een standaardomgeving.
    OPMERKING: Het ene uiteinde van de katheter die in de maag van de muis wordt ingebracht, wordt afgesloten met een 23G-naald met een verzegelde punt om het binnendringen van vreemde stoffen te voorkomen en om bijten te voorkomen. Omdat de katheter die uit de buik steekt kort is, voorkomt deze dat de muis deze door het beddengoed sleept, waardoor deze open kan gaan of verstrikt kan raken.

6. Voorbereiding op in vivo transcraniële Ca2+ beeldvorming

  1. Anesthesie toedienen aan de muis met behulp van isofluraan (inductie bij 2%; onderhoud tussen 0,8% en 1,0%).
  2. Zet de muis vast op een stereotaxisch platform met behulp van extra oorbalken om de effecten van pulsatie en ademhaling te verminderen. Plaats de muis vervolgens onder een fluorescentie-stereomicroscoop.
  3. Gebruik een breedband blauwe fluorescentiefilterset (met excitatie bij 460-490 nm en emissie bij 520 nm) in combinatie met een kwiklichtbron.
  4. Leg de beelden vast met een camera en verwerk ze met behulp van de daarvoor bestemde beeldvormingssoftware.
  5. Verwijder het haar voorzichtig van de hoofdhuid met behulp van een elektrisch scheerapparaat of ontharingscrème.
    NOTITIE: Als u een scheermes gebruikt, zorg er dan voor dat het grondig wordt gedesinfecteerd en pas op dat u niet in de huid snijdt.
  6. Desinfecteer het oppervlak van de hoofdhuid met een wattenstaafje of iets dergelijks met een oplossing van chloorhexidinegluconaat verdund tot 0,1-0,5%. Vervolgens desinfecteer je met alcohol en herhaal je dit afwisselende rondes 3x.
  7. Breng een plaatselijke verdovende gel aan en wacht 5-10 minuten.
  8. Bereid je voor om tandheelkundig acrylcement aan te brengen.
    1. Gebruik een steriel scalpelmesje om de hoofdhuid te snijden. Verwijder de hoofdhuid volledig of maak een rechte snede van de achterkant van het hoofd naar het voorhoofd.
    2. Gebruik clips om de schedel bloot te leggen door overtollige huid uit te rekken.
    3. Gebruik een wattenstaafje om het bindweefsel van het botvlies te verwijderen.
    4. Breng het acrylcement onmiddellijk aan na het verwijderen van het periosteum. Handel snel om te voorkomen dat het schedeloppervlak ondoorzichtig wordt door verdamping van het blootgestelde bot.
    5. Wacht ongeveer 5 minuten totdat het cement is opgedroogd.

7. Transcraniële Ca2+ beeldvorming met intraduodenale glucosetoediening

  1. Breng zowel de experimentele oplossing als de zoutoplossing in evenwicht met de omgevingstemperatuur. Onderwerp de muizen aan een dieetbeperking voor een bepaalde duur (bijv. 2 uur).
  2. Verwijder eventuele restinhoud in de katheter aan de muiszijde met ~0,03 ml zoutoplossing voordat u met de injectie begint.
  3. Zuig de experimentele oplossing (bijvoorbeeld een 10% glucoseoplossing bereid in 300 μL water, aangevuld met een extra 300 μL water) in de spuit en sluit deze vervolgens aan op de katheter. Bepaal de optimale dosering van de oplossing die is afgestemd op het specifieke experimentele doel.
    OPMERKING: Wees tijdens deze fase voorzichtig om onnodige belasting van de katheter te voorkomen, die de interne anatomie van de muis in gevaar kan brengen. Probeer de slang aan de muiszijde met de grootste zachtheid te manipuleren. Zorg er bovendien voor dat de spuit vrij blijft van aspiratie na de oplossing, aangezien ingesloten lucht en bellen gastro-intestinale uitzetting kunnen veroorzaken.
  4. Beoordeel de fysiologische toestand van de muis en activeer de opnamefunctie van de beeldvormingssoftware door op de opnameprocesknop van de softwaretoepassing te klikken.
  5. Leg beelden vast met een resolutie van 512 x 512 pixels, 16 bit diepte en een framerate van 10 Hz.
    OPMERKING: De opnameparameters kunnen worden aangepast om af te stemmen op specifieke experimentele vereisten.
  6. Verkrijg spontane gegevens (bijv. gedurende 50 s), gevolgd door de geleidelijke infusie van de experimentele oplossing met een snelheid die is afgestemd op het experiment (hier 0,035 ml/s).
    OPMERKING: Aan het einde van het experiment zal de muis onmiddellijk worden geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder isofluraananesthesie.

8. Verwerking en analyse van beeldgegevens

  1. Sla afbeeldingsgegevens op in 64 x 64 pixels.
  2. Bepaal met de hand getekende interessegebieden (ROI's) met behulp van ImageJ. Raadpleeg de hersenatlas van muizen om ROI's aan te duiden als het frontale gebied (M2), het somatosensorische gebied inclusief het vat (Somato), het occipitale gebied (visueel) en het retrospleniale gebied (RSC).
  3. Gebruik de MATLAB-functie ReadImageJROI om de coördinaten te extraheren die overeenkomen met de ROI's. Toegang tot de MATLAB-functie via de verstrekte link: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi
  4. Bereken de gemiddelde snelheid van verandering van fluorescentie-intensiteit binnen de ROI met behulp van MATLAB.
    1. Definieer de veranderingssnelheid van de fluorescentie-intensiteit (ΔF/F) met vergelijking (1):
      figure-protocol-1(1)
      Waarbij Ft de fluorescentie-intensiteitswaarde op een bepaald tijdstip vertegenwoordigt en de gemiddelde intensiteitswaarde vanaf het begin van de registratie tot 50 s na de injectie wordt aangeduid als F0.
  5. Houd rekening met de vertraging waarmee de injectieoplossing het orgaan bereikt. Gebruik de gemiddelde intensiteitswaarde van drie seconden na injectie als basislijn. Doelgolfvormen die de basisintensiteitswaarde + 1 SD overschrijden voor analyse als ze 3 s of later na injectie optreden.

Resultaten

Transcraniële cortex brede Ca2+ beeldvorming met een isofluraan-verdoofd G7NG817 muis
We hebben de katheter gemaakt volgens de procedure die wordt geïllustreerd in figuur 1. Nadat we de positie van de maag zorgvuldig hadden bepaald, bevestigden we de katheter op die locatie (Figuur 1). Nadat we voldoende hersteltijd hadden toegestaan na het inbrengen van de katheter (ongeveer 48 uur), maten we spontane neurale activiteit onder milde isofluraananesthesie (0,8-1,0%) om de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit bij aanvang vast te stellen voor daaropvolgende observaties van darmstimulatie. Als gevolg hiervan bevestigden we de willekeurige Ca2+ oscillatiepatronen die de hele cortex overspanden (Figuur 2A). Figuur 2 geeft representatieve voorbeelden van spontane hersenactiviteit, waarbij de katheters vooraf worden ingebracht. We hebben de tijd van de eerste waarneembare Ca2+ transiënte piek in het M2-gebied na de injectie gedefinieerd als 0,0 s. De pseudo-kleurweergave gaf de piek van deze Ca2+- transiënt weer als de maximale waarde, met de gemiddelde waarde plus één standaarddeviatie (1 SD) als de minimumwaarde. Het was duidelijk dat de linker- en rechterhersenhelft in alle regio's synchrone activiteit vertoonden.

Vervolgens hebben we ROI's vastgesteld om de golven binnen elk functioneel gebied te karakteriseren. Zoals te zien is in figuur 2B, presenteerden we de temporele veranderingen in de fluorescentie-intensiteit voor elke ROI (figuur 2B). Deze waargenomen Ca2+- oscillaties aan het oppervlak volgden een burst-onderdrukkingspatroon, afwisselend tussen perioden van lage activiteit en fluorescentieveranderingen met hoge amplitude. Dit activiteitspatroon komt overeen met eerdere bevindingen die tegelijkertijd corticale oppervlakte-EEG en Ca2+- dynamiek maten26.

Ondanks wereldwijde of regionaleoppervlakte-Ca 2+-fluctuaties tussen onderdrukking en burst-toestanden, kan het specifieke corticale gebied dat de calciumpiek initieert, verschillen. Zoals eerder gemeld, wordt verwacht dat wanneer een signaal een lokale corticale regio stimuleert, het gebied wordt geactiveerd, waardoor een wereldwijde verschuiving in de corticale toestand 27,28 wordt veroorzaakt.

Veranderingen in de dynamiek van cortex Ca2+ na intragastrische glucose-injectie
Om op te helderen hoe toediening van glucose of water de corticale activiteit beïnvloedt, hebben we vervolgens de cortexbrede Ca2+-dynamiek tijdens en na de injectie gevolgd. Als gevolg hiervan vonden we veranderingen in de corticale Ca2+-dynamiek na intragastrische glucose-injectie. In tegenstelling tot de spontane activiteit die wordt geïllustreerd in verschillende regio's van corticale activering, zagen we onmiddellijke activering in het prefrontale gebied of de secundaire motorische cortex (M2) bij directe darminjectie van glucose via de katheter, een effect dat niet werd geïnduceerd door intragastrische waterinjectie (Figuur 3A-C). Bovendien zagen we dat deze voorbijgaande, prominente Ca2+-gebeurtenissen de neiging hadden om continu op te treden gedurende ongeveer 10 s na intragastrische glucose-injectie. Dergelijke aanhoudende verschijnselen waren niet zichtbaar wanneer water werd toegediend (Figuur 3D-F).

De Ca2+- gebeurtenissen in elke ROI werden gekenmerkt door het berekenen van de verhouding van de fluorescentie-intensiteitsveranderingsratio, met behulp van de auditieve cortex (referentie) als referentie, bij de eerste piek die plaatsvond binnen 4-8 s na voltooiing van de glucosetoediening. Als gevolg hiervan werd een significante verandering waargenomen wanneer glucose werd geïnjecteerd na vergelijking van de respons in het M2-gebied met behulp van de auditieve cortex als referentie voor en na injectie.

Daarentegen werd een dergelijke verandering niet waargenomen bij injectie met water (Figuur 3G, water N = 7: voor vs. injectie, 2,38 ± 2,53 vs. 2,05 ± 1,84, p > 0,05; glucose N = 7: voor vs. injectie, 2,48 ± 0,97 vs. 3,76 ± 2,76, p < 0,01, Wilcoxon signed-rank test). Vervolgens, waarbij de activeringsniveaus in elk cortical gebied werden gedefinieerd door de verhouding tussen de waarde van na injectie en vóór injectie, werd alleen een significant verschil waargenomen in het M2-gebied (Figuur 3H, M2: 0,92 ± 0,89 vs. 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Somato: 0,95 ± 0,076 vs. 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Visueel: 0,92 ± 0,3 vs. 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 vs. 1,10 ± 0,27, p = 0,60, t-toets).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de methode. (A) Aanmaken van de katheter: (a) Snijd de siliconenbuis door. (b) Plak een plastic kraal op de siliconenbuis met behulp van medische cyanoacrylaatlijm. c) Knip de naald van 23 G op 1,5 cm van de punt af. (d) Bevestig het afgeknipte uiteinde van de naald aan de siliconenbuis. (B) Injector: (a) Knip een injectienaald van 23 G 1 cm af. (b) Sluit de afgeknipte injectienaald aan op een spuit van 2,5 ml. c) Omhul het afgesneden gedeelte van de injectienaald met een siliconenbuisje. d) Snijd de naald van 23 G op 1,5 cm van de punt af. (e) Bevestig het afgeknipte uiteinde van de naald aan de siliconenbuis. (C) Chirurgische ingreep: (a) Ontharen van het operatiegebied. (b) Snijd de huid en de buikwand in tot een lengte van ongeveer 1,5 cm. c) Maak met een schaar een kleine perforatie (diameter van ongeveer 1,5 mm) in het pylorische antrum en breng de katheter (siliconenbuis) in. Bevestig de katheter aan het pylorische antrum met behulp van medische cyanoacrylaatlijm. (d) Hecht de buikwand en de huid met behulp van 5/0 zijden hechtmateriaal en naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Spontane cortexbredeCa 2+ oscillaties bij G7NG817 muizen met een aangehechte katheter. (A) Een representatief voorbeeld van cortex brede Ca2+ oscillaties weergegeven met intervallen van 0,2 s. Veranderingen in fluorescentie-intensiteit worden weergegeven met een pseudo-kleuroverlay. Het tijdvenster omcirkeld door de stippellijn in B toont de eerste verschijning van de Ca2+ voorbijgaand, met de piek ingesteld op tijd 0. De pseudo-kleurweergave gebruikt de piek van die Ca2+ transiënt als de maximale waarde en de gemiddelde +1 SD als de minimale waarde. (B) Veranderingen in tijdreeksen in fluorescentie-intensiteit voor elke ROI in het voorbeeld. Lijnkleuren komen overeen met verschillende corticale gebieden: rood staat voor M2; magenta vertegenwoordigt het somatosensorische gebied (Somato); blauw staat voor het visuele gebied (Visueel); En groen staat voor de retro spleniale regio. Zalmkleurige strip geeft de injectietijd aan. (C) Een enkele piek binnen de gestippelde omtrek wordt geïsoleerd en weergegeven in een vergrote weergave. Afkortingen: SD = standaarddeviatie; ROI = regio van belang; RSC = retro spleniale regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Cortexbrede Ca2+ respons tijdens/na glucose- of waterinjectie. (A) Een representatief voorbeeld van glucosetoediening weergegeven met tussenpozen van 0,2 s. Veranderingen in fluorescentie-intensiteit worden weergegeven met een pseudo-kleuroverlay. Het tijdvenster omcirkeld door de stippellijn in B toont de eerste verschijning van Ca2+ van voorbijgaande aard na de injectie, met de piek ingesteld op tijd 0. De pseudo-kleurweergave is gebaseerd op de piek van de eerste Ca2+ transiënt na injectie als de maximale waarde en de gemiddelde +1 SD als de minimale waarde. (B) Tijdreeksveranderingen van fluorescentie-intensiteit voor elke ROI in het voorbeeld. Lijnkleuren komen overeen met verschillende corticale gebieden: rood staat voor M2, magenta staat voor het somatosensorische gebied (Somato), blauw staat voor het visuele gebied (Visueel) en groen staat voor het retro spleniale gebied. (C) Een enkele piek binnen de gestippelde omtrek wordt geïsoleerd en weergegeven in een vergrote weergave. Analyseer de doelcalciumgolf is de vroegste golf die binnen 4-8 s na injectie verscheen. (D) Een representatief voorbeeld van waterinjectie als glucoseregulatiegegevens. (E) Veranderingen in tijdreeksen in fluorescentie-intensiteit voor elke ROI in het voorbeeld. De kleuren van de lijnen zijn zoals in B. (F) Een enkele piek binnen de gestippelde omtrek wordt geïsoleerd en weergegeven in een vergrote weergave. Analyseer de doelcalciumgolf is de vroegste golf die binnen 4-8 s na injectie verscheen. (G) Vergelijking van de spontane activiteit van M2 (vóór) en de respons na injectie (geïnjecteerd). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit verandert meer dan 50 s vóór injectie en de piekrespons in het M2-gebied tussen 4 s en 8 s na injectie werd berekend, met behulp van de auditieve cortex als referentie. (H) Vergelijking van activeringsniveaus in elk corticaal gebied wanneer water of glucose werd toegediend. De verhouding tussen de waarde van na injectie en vóór injectie, zoals bepaald in G, werd voor elke regio berekend. N.S. vertegenwoordigt niet-significant (p > 0,05). ** <0,01. Foutbalken worden gedefinieerd als de standaardfout van het gemiddelde. Afkortingen: SD = standaarddeviatie; ROI = regio van belang; RSC = retro spleniale regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel laat zien hoe je een katheter aan de darm bevestigt en transcraniële cortexbrede Ca2+- signalen observeert met transgene muizen die een genetisch gecodeerdeCa 2+- indicator tot expressie brengen. In dit experiment kregen we niet de beeldvormingsgegevens die een secundaire golflengte van de lichtbron gebruiken. Dit komt omdat de transgene muizen die we in deze studie hebben gebruikt, een zeer hoge fluorescentie-intensiteitsveranderingssnelheid vertonen (~enkele tientallen procenten) als reactie op sensorische stimuli vanwege de eigenschappen van het gebruikte Ca2+ -indicatoreiwit (G-CaMP7). Daarom dachten we dat contaminatie door hemodynamica verwaarloosbaar was. Bovendien traden de neurale reacties waarop we ons richtten snel op binnen een paar seconden, dus we vonden het niet nodig om rekening te houden met vervolgens gegenereerde lokale functionele hyperemie. Deze katheterimplantatiemethode kan worden gecombineerd met andere genetisch gemodificeerde muizen om neuronale activiteit in andere hersengebieden en op verschillende tijdschalen te observeren. Als echter andere genetisch gemodificeerde muizen worden gebruikt, moet het hierboven beschreven controle-experiment worden uitgevoerd.

Deze methode om de katheter aan de darm te bevestigen, is geschikt voor injectie met een enkelvoudige dosis tegen lage kosten en is eenvoudig en minder invasief dan de eerder voorgestelde methode29. Traditioneel wordt absorberend katoen op het spijsverteringsorgaan aangebracht en gehecht. Hechten kan echter het postoperatieve herstel bij muizen belemmeren. Daarom hebben we de methode van bevestigen aangenomen. De reden dat we voor plastic kralen hebben gekozen, is dat ze beter hechten aan de siliconen met de cyanoacrylaatlijm die we gebruiken.

Traditioneel wordt verondersteld dat de hersenen glucose waarnemen op basis van de escalatie van de plasmabloedglucosespiegels en de daarmee gepaard gaande hormoonafgifte. Bijgevolg hebben de hersenen enkele minuten tot uren nodig om glucose te detecteren na opname uit de darm4. Sommige onderzoeken hebben gesuggereerd dat darmdetectie de smaakvoorkeur van muizen regelt, naast de orale zoete smaakontvangst 1,3,17,22. Als illustratief voorbeeld hebben onderzoekers bewijs geleverd dat intragastrische (IG) glucose-gepaarde gearomatiseerde niet-voedende oplossing en IG niet-metaboliseerbare α-methyl-d-glucopyranoside (MDG)-gepaarde gearomatiseerde niet-voedende oplossing de voorkeur kunnen wekken voor elke gearomatiseerde niet-voedende oplossing in vergelijking met de IG-watergepaarde groep. Aangezien intraperitoneale glucose-injectie de inname van niet-voedzame oplossingen niet stimuleerde30, werd verwacht dat het waarnemen van voedingsstoffen in de darm een cruciale rol zou spelen bij de voedselkeuzes van de muizen 1,19,22.

Een recente studie heeft de aanwezigheid aangetoond van een elektrisch prikkelbare cel in de darm, aangeduid als een "Neuropod-cel", die moleculaire receptoren gebruikt om sensorische prikkels te detecteren en over te brengen naar een nervus vagus via een glutamaterge synaps. Terwijl eerdere studies zich voornamelijk richtten op de rol van GLP-1 bij het beheersen van de voedselvoeding van muizen, hebben recente onderzoeken aangetoond dat activering van de nervus vagus door neuropod-cellen de eetlust van muizen moduleert. De nervus vagus activeert vervolgens de Nucleus Tractus Solitarius, wat leidt tot de daaropvolgende activering van dopaminerge neuronen19. Het is echter niet bekend of dopaminerge neuronactivering ook de cortex activeert. Om cerebrale responsen na intragastrische glucose-infusie te categoriseren, hebben we de techniek voor het bevestigen van de katheter verfijnd voor beeldvormingsdoeleinden. Bij het gebruik van deze technologie is het absoluut noodzakelijk om voorzichtig te zijn om orgaanschade te voorkomen, met name met betrekking tot de lever, die vatbaar is voor letsel tijdens de manipulatie die nodig is om de locatie van de maag vast te stellen.

Onze bevindingen geven aan dat intragastrische glucose-injectie de prefrontale cortex binnen enkele seconden activeert. Intragastrische toediening van glucose initieert echter meerdere signaalroutes tegelijkertijd, zoals hormonale routes, de nervus vagus en de spinale afferente zenuw. Deze signalen worden op verschillende tijdschalen in de hersenstam verwerkt. Daarom moeten toekomstige studies onderzoeken hoe deze ingewikkelde signalen worden verwerkt en geïntegreerd in de hersenen.

Bovendien brengt de BAC GLT-1-G-CaMP7 transgene muislijn die we in de huidige studie hebben gebruikt, de Ca2+ -sensor, G-CaMP7, tot expressie in zowel neuronen als astrocyten. In principe wordt de prefrontaleCa 2+- elevatie die wordt verkregen door transcraniale cortexbrede Ca2+- beeldvorming afgeleid van neuronen en/of astrocyten. Aangezien astrocyten echter dopaminereceptoren tot expressie brengen als er dopamine-signalering bij betrokken is, suggereert dit de mogelijke activering van astrocytische IP3/Ca2+- signalering. Aangezien astrocytische IP3/Ca2+- signalering de synaptische plasticiteit reguleert, kan het ook een belangrijke rol spelen bij veranderingen in sucrosevoorkeur en veranderingen in het voedingsgedrag na glucoseontvangst. Bijgevolg zou beeldvorming met cellulaire resolutie met behulp van twee-fotonmicroscopie nodig zijn om vast te stellen of de respons die in de prefrontale cortex wordt waargenomen na toediening van glucose afkomstig is van neuronen of astrocyten in toekomstige studies. Een andere effectieve methode is het observeren van celspecifieke Ca2+ -indicatorexpressie bij muizen met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) door middel van vezelfotometrie. Bovendien is het noodzakelijk om met behulp van elektrofysiologische technieken na te gaan of de glucoseprikkel naar de darm de nervus vagus echt heeft gestimuleerd. Als neuropod-cellen signalen doorgeven aan de nervus vagus door glucose te ontvangen, verwachten we geen reactie van de nervus vagus wanneer een SGLT-1-remmer wordt toegediend. Ten slotte zou validatie met behulp van verschillende dopaminereceptorantagonisten nodig zijn om te bevestigen of de uitsteeksels van de nervus vagus naar de Nucleus Tractus Solitarii (NTS) dopaminerge neuronen activeerden, waardoor de prefrontale cortex Ca2+- signalen toenemen. Over het algemeen maakt dit systeem een uitgebreid onderzoek mogelijk naar de effecten van snelle neurale overdracht van de darmen naar de hersenen. Het presenteert een veelbelovende methodologie die mogelijk mechanismen zou kunnen ophelderen, zoals hoe stress de voorkeur van sucrose verandert met betrekking tot darm-herseninteracties.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Ochanomizu University, KAKENHI-beurzen (18K14859, 20K15895), JST FOREST-programma, subsidienummer JPMJFR204G, Research Foundation for Opto-Science and Technology, Kao Research Council for the Study of Healthcare Science, The Japan Association for Chemical Innovation en TERUMO life science foundation. De auteur bedankt Dr. Takashi Tsuboi, Kazuki Harada en Akiyo Natsubori voor hun toezicht op de experimenten. De auteur bedankt ook de leden van het laboratorium voor hun steun.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2.5 mL TERUMO spuitTERUMOss-02Sz
23 G injectienaaldTERUMO4987350390691
Anesthetisch middel (ISOFLURANE Inhalatieoplossing)viatris871119
Wattenstaafjelokale bedrijf
Cyanoacrylaatlijm (AronArufa A)TOAGOSEI7990700Q1022
Tandheelkundige acrylcement C&B Sun Medical 221AABZX00115000
OntharingscrèmeKracielokale bedrijf
Digitale CMOS-camera Hamamatsu Photonics ORCA-Spark
OorbalkNARISHIGEEB-5N
Filterset (U-MWB2)EvidentU-MWB2 
Fijne schaarFine Dcience Tools14040-10
G7NG817 muizenRIKEN BRCRBRC09650
BeeldsoftwareHamamatsu Photonics HC Image software
Isofluraan verdampershinanoseisakusyoSN-487-0T
Lichtbron (U-HGLGPS)EvidentU-HGLGPS
Microscoop (MVX10)Evident
Kunststof kralen (binnendiameter 3 mm, buitendiameter 5 mm)lokale bedrijf
Tanglokale bedrijf
Polydioxanoon naald, monodioxAlfresa PharmaHR1305MV45-KF2RDeze absorberbare, monofilament PDS naald wordt gebruikt om de chirurgische incisie te sluiten
Rond eindtangF.S.T. 11617-12
ZoutoplossingOtsuka Pharmaceutical Factory35061311
Siliconen buis (binnendiameter 0,5 mm, buitendiameter 1,0 mm)AS ONE CORPORATIO33151413lokale bedrijf
Kleine chirurgische naaldNatsume Seisakusho Co., Ltd.AC03DNT
Stereotactische tafelNARISHIGEMA-6N
Xylocaine-gel 2%Sandoz K.K.614429303Deze gel wordt gebruikt als lokaal pijnstillend middel om chirurgische pijn te verlichten

Referenties

  1. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  2. Reimann, F. Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells. International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).
  3. Kreuch, D., et al. Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control. Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).
  4. Gorboulev, V., et al. Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion. Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).
  5. Harada, N., Inagaki, N. Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney. Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).
  6. Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P., Bohórquez, D. V. Neuropod cells: The emerging biology of gut-brain sensory transduction. Annual Review of Neuroscience. 43, 337-353 (2020).
  7. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
  8. Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat. Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).
  9. Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake. Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).
  10. Raybould, H. E. Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).
  11. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant. Physiology & Behavior. 76 (3), 403-413 (2002).
  12. Secher, A., et al. The arcuate nucleus mediates GLP-1 receptor agonist liraglutide-dependent weight loss. The Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4473-4488 (2014).
  13. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  14. Borgmann, D., et al. Gut-brain communication by distinct sensory neurons differently controls feeding and glucose metabolism. Cell Metabolism. 33 (7), 1466-1482.e7 (2021).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Aponte, Y., Atasoy, D., Sternson, S. M. AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training. Nature Neuroscience. 14 (3), 351-355 (2011).
  17. Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing. Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).
  18. Goldstein,, et al. Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways. Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).
  19. Fernandes, A. B., et al. Postingestive modulation of food seeking depends on vagus-mediated dopamine neuron activity. Neuron. 106 (5), 778-788.e6 (2020).
  20. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. 361 (6408), Science. New York, N.Y. eaat5236(2018).
  21. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 782-786 (2015).
  22. Tan, H. -E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  23. Wang, D., et al. Whole-brain mapping of the direct inputs and axonal projections of POMC and AgRP neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 40(2015).
  24. Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics. Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).
  25. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).
  26. Ferron, J. -F., Kroeger, D., Chever, O., Amzica, F. Cortical Inhibition during Burst Suppression Induced with Isoflurane Anesthesia. The Journal of Neuroscience. 29 (31), 9850-9860 (2009).
  27. Ming, Q., et al. Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats. Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).
  28. Schwalm, M., et al. Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex. Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).
  29. Ueno, A., et al. Mouse intragastric infusion (iG) model. Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).
  30. Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study. Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Communicatie tussen darm en breincortex brede beeldvormingnervus vagustransgene muizenintragastrische katheterfluorescentiemicroscopieneurale activiteitsecundaire motorische cortex

Gerelateerde artikelen