Methodenartikel

Optimalisatie van het ligatuur-geïnduceerde parodontitis-muismodel voor preklinisch onderzoek

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het door ligatuur veroorzaakte parodontitis-muismodel is een effectief en steeds populairder hulpmiddel voor het bestuderen van parodontale ziekten. Gedetailleerde richtlijnen worden gepresenteerd voor het implementeren van een vereenvoudigde versie van het model, gericht op interproximale alveolaire botvernietiging, inclusief laboratoriumstudieontwerp, productie van 3D-geprinte tools en botkwantificatie met behulp van μCT-analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het experimentele model van ligatuur-geïnduceerde parodontitis bij muizen heeft een fundamentele rol gespeeld in het begrijpen van parodontitis pathogenese; Toch is het niet volledig benut voor translationele en therapeutische toepassingen. Net als bij menselijke ziekten ontwikkelt ligatuur-geïnduceerde parodontitis zich bij muizen via een reeks verschillende microbiële, inflammatoire en osteo-immunologische gebeurtenissen. De door ligatuur veroorzaakte alveolaire botvernietiging verloopt in een relatief korte periode en is gemakkelijk te kwantificeren, waardoor het een kosteneffectief ziektemodel is voor preklinische studies.

Om de technische uitdaging van het klassieke ligatuurmodel te overwinnen, werd het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel gecureerd. In plaats van ziekte te veroorzaken in de gehele omtrek van twee aangrenzende tanden, richt het vereenvoudigde ziektemodel zich op inflammatoire botafbraak alleen in het interproximale gebied van twee achterste tanden, wat ook het gebied is dat veelvoorkomende parodontale ziekte bij mensen initieert. Omdat het gebruik maakt van driedimensionale (3D)-geprinte tools voor het plaatsen van ligatuur, is de aanpak snel en effectief, wat leidt tot een procedurele tijd van 5-10 minuten per muis. Hoewel osteoklastogene signalering wordt vastgesteld na 3 dagen ligatuurplaatsing, ontwikkelt botdestructie consequent 9 dagen na ligaturen.

Hier wordt het vereenvoudigde ligatuurmodelprotocol uitgewerkt door belangrijke elementen te benadrukken die specifiek zijn voor het onderzoeksontwerp (d.w.z. vermogensberekening, procedurestandaardisatie, kalibratie), ontwikkeling van de 3D-geprinte tools (d.w.z. het "muizentandbed" en "ligatuurhouder"), en kwantificatie van alveolair bot met behulp van μCT-analyse. Gingivale genexpressie van Rank, Rankl en Opg, een master regulatieve triade van osteoclastogenese, wordt gebruikt als indirect bewijs van therapeutische effectiviteit. De in dit artikel gepresenteerde methoden zullen de onderzoekers begeleiden bij de implementatie van het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel om innovatieve parodontale therapieën te testen in de preklinische setting.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parodontale ziekte is een complex ontstekingsproces dat leidt tot de vernietiging van tandondersteunende structuren, waaronder het gingiva, het parodontale ligament, het cement en het alveolair bot. Om parodontale botverlies te laten ontstaan, moeten de tandvleesbarrière breken en bacteriële invasie plaatsvinden, naast de rekrutering van ontstekingscellen en de overgang van een aangeboren gedomineerde naar een verworven gedomineerde immuunrespons1. De uiteindelijke disbalans tussen osteoblasten en osteoclasten zal resulteren in verlies van alveolair bot door de vernietigingervan. De kenmerkende fenotypische bevinding die de diagnose van parodontale aandoening onderscheidt van reversibele gingivale ontsteking (gingivitis) is het verlies van alveolair bot. Daarom is de hoeveelheid tandondersteunend alveolair bot een belangrijk therapeutisch resultaat in de preklinische setting.

Geen enkel diermodel kan alle biologische aspecten repliceren die nodig zijn voor de ontwikkeling van verschillende therapieën 3,4,5. Het door ligatuur geïnduceerde parodontitis muismodel ontwikkelt kwantificeerbare botafbraak in een redelijk korte tijd (3-9 dagen)5, waardoor dit een kosteneffectief model is om nieuwe therapeutische interventies voor parodontitispreventie en -modulatie te testen. Ondanks het succes in het ondersteunen van de ontwikkeling van fase II-III klinische studies bij mensen 6,7,8,9,10, wordt ligatuur-geïnduceerde parodontitis bij muizen niet vaak gebruikt als preklinisch model. Om de technische uitdagingen van het klassieke model waarbij de ligatuur de tand omringt te overwinnen, werd het vereenvoudigde door ligatuur veroorzaakte parodontitis muismodel11,12 opgezet. De eenvoudige aanpassing van het klassieke model is gericht op een gerichte botvernietigingsplaats, tussen in plaats van rond de tanden. De voordelen van deze aanpassing zijn veelzijdig, waaronder een kortere tijd die nodig is voor 1) personeelstraining, 2) technische eenvoud van de experimentele procedure, en 3) reproduceerbaarheid van botkwantificatie. Daarnaast werd ontdekt dat verschillende microbiologische en immunologische gebeurtenissen die zich ontwikkelen en manifesteren onder dit vereenvoudigde model, overeenkomen met het huidige begrip van veelvoorkomende menselijke parodontitis 2,11,12,13. Ten slotte ondersteunt de effectieve preventie van door medicijnen veroorzaakt botverlies zoals eerder gerapporteerd door US 2,14 het gebruik van het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel als in vivo hulpmiddel om belangrijke aspecten van nieuwe parodontale therapieën te evalueren.

Een innovatief aspect van het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel is de ontwikkeling van 3D-geprinte tools om het ziekte-inductieproces gemakkelijker te vergemakkelijken11,12. Hoewel het voor sommigen intuïtief is, hebben onderzoekers gemeld dat het niet lukte om de 3D-geprinte tools15 samen te stellen, wat de start van dierstudies verder kan belemmeren of vertragen. De huidige studie bouwt voort op de informatie uit onze eerdere protocolstudie11en biedt gedetailleerde informatie om de succesvolle implementatie van het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel in een laboratoriumomgeving mogelijk te maken. Details die in dit huidige protocol zijn opgenomen, maken deel uit van een complex scala aan factoren die kunnen bijdragen aan het ontbreken van reproduceerbaarheid van wetenschappelijke resultaten 15,16,17. Het consistente modelgebruik en de betrouwbare botresorptie die in de meerdere studies 2,11,12,14,18 en door samenwerkende onderzoeksgroepen 13,19,20,21 in de afgelopen 10 jaar zijn geïdentificeerd, ondersteunen het belang van het verspreiden van gedetailleerde informatie om reproduceerbaarheid in de wetenschappelijke gemeenschap te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgde de richtlijnen22,23 van Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Alle experimentele procedures die in dit protocol zijn beschreven, zijn goedgekeurd door de IACUC van de University of North Carolina at Chapel Hill.

1. Experimenteel ontwerp

  1. Berekening van steekproefgrootte
    OPMERKING: Vanwege het translationele karakter van het onderzoeksprogramma is de hier gepresenteerde vermogensberekening gebaseerd op alveolaire botmetingen van 8-12 weken oude wildtype C57Bl6 muizen.
    1. Analyseer bot op basis van lineaire metingen tussen de cement-emaille overgang en de alveolaire botkam (CEJ-ABC).
      1. Gezonde muizen hebben een gemiddelde hechtingsniveau (of CEJ-ABC-meting) van 0,2 mm, terwijl muizen met parodontitis op het 9-dagen post-ligatietijdperk het dubbele hebben (CEJ-ABC afstand van 0,4 mm). Het verlies van alveolair bot neemt niet significant toe van 9 tot 18 dagen na het plaatsenvan ligatuur 11.
      2. Voer een vermogensanalyse uit op basis van deze effectgrootte om het aantal muizen te identificeren dat nodig is om deze verschillen tussen gezondheid en ziekte te onthullen (hier in totaal 8-10 muizen [Figuur 1A]).
        OPMERKING: Het vermogen werd berekend om een macht tussen 0,8 en 0,95 te bereiken, α = 0,05, met behulp van een twee-steekproef gemiddelde macht. Groepsgemiddelden en standaarddeviaties worden weergegeven in Figuur 1B.
    2. Om een therapeutisch effect op botverlies te bepalen, voer je een andere vermogensberekening uit. In plaats van gezonde muizen te vergelijken met zieke muizen, aangezien zowel experimentele als controlegroepen parodontitis ontwikkelen in dit protocol, reserveer tussen de 19 en 31 muizen/groep om reproduceerbaarheid van het resultaat te waarborgen bij het testen van botverliesmodulatie met het vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel (zie representatieve resultaten en Figuur 1C).
      OPMERKING: Het vermogen werd berekend met dezelfde hierboven beschreven test. Groepsgemiddelden en standaarddeviaties worden weergegeven in Figuur 1D.
  2. Standaardisatie van procedures en kalibratie van personeel
    1. Train en kalibriseer al het personeel dat betrokken is bij ziekte-inductie en kwantificering vóór het starten van de studie (interkalibratie en intrakalibratie; r2 ≥ 0,90).
      OPMERKING: Er wordt geschat dat de training voor ligatuurplaatsing en kwantificatie van botverlies een periode van 2-3 maanden vereist (tijdlijn weergegeven in Tabel 1). Andere vereiste stappen worden weergegeven als tijdlijn in Tabel 1.
    2. Voor de ligatuurplaatsingsprocedure moeten twee getrainde onderzoekers samenwerken in de procedureruimte. De hoofdonderzoeker (intra- en interkalibratie) blijft de operator die de ligaturen plaatst.
    3. Laat de tweede onderzoeker als procedureassistent werken en de onderstaande stappen uitvoeren:
      1. Registreer het gewicht van de muis.
      2. Plaats de muis in de verdovingsbox.
      3. Breng oogzalf op de muis voordat je de muis aan de operator geeft om deze in het "muizentandbed" te plaatsen.
      4. Zorg ervoor dat ≥3 "ligatuurhouders" correct geladen zijn met de ligaturen en klaar voor gebruik.
        OPMERKING: Om de efficiëntie te verbeteren is het ideaal om ≥3 "ligatuurhouders" passend geladen te hebben voor gebruik door de operator. Spoed wordt aanbevolen (d.w.z. een proceduretijd van 5-10 minuten per muis), waarbij het aantal uitgevoerde experimenten per dag wordt verhoogd en de potentiële batcheffecten worden verminderd.
      5. Voer muismonitoring uit (voor en na de ingreep).
        OPMERKING: De door ligatuur veroorzaakte parodontitis is een niet-invasieve niet-invasieve, niet-chirurgische procedure die vergelijkbaar is met het flossen van een menselijke tand. Het plaatsen van de ligatuur zal naar verwachting zeer milde ongemakken veroorzaken voor de muizen (voornamelijk door ophoping van bacteriën tussen twee tanden), maar zou geen pijnstillers nodig moeten zijn. Er worden geen complicaties verwacht na het plaatsen van de ligatuur door een getrainde persoon. Alle dieren worden elke 2-3 dagen gecontroleerd na het plaatsen van de ligatuur. Humane eindpunten (bijv. het niet verzorgen of voeden, onvermogen om op te staan of te lopen, zware ademhaling, necrotische of geïnfecteerde wonden) moeten worden opgenomen in het goedgekeurde dierenprotocol, maar bij complicaties moet het dierkundig personeel worden geraadpleegd over passende maatregelen.

2. Creatie van gedrukte hulpmiddelen om ligatuurparodontitis bij muizen op te wekken

OPMERKING: Om de ligatuurplaatsing te optimaliseren, zijn 3D-geprinte tools ontwikkeld genaamd Mouse Dental Bed en Ligature Holder , bestaande uit verschillende afzonderlijke 3D-geprinte onderdelen die afzonderlijk worden geprint en handmatig worden samengesteld. De blauwdrukspecificaties voor deze apparaten werden eerderin 11 gepubliceerd en kunnen door ervaren onderzoekers worden gebruikt om individuele STL-bestanden te maken. De nieuwe apparaten in de huidige studie zijn ontwikkeld in samenwerking met het BeAM Design Center van de University of North Carolina at Chapel Hill. Materialen kunnen worden verkregen via de betreffende kernfaciliteit of 3D-geprint worden met behulp van de STL-bestanden in Supplemental File 1.

  1. Muizen-tandbed
    1. Print het muistandbedje (Figuur 2A) en de Ligatuurhouder (Figuur 2B) met standaard printkwaliteit op een 3D-printer met 3,0 mm polylactinzuur (PLA) filament. Print het tandheelkundig bed in de ontworpen oriëntatie en de andere onderdelen met de uniforme vlakke oppervlakken naar beneden gericht op het printbed. Activeer de optie voor ondersteunend materiaal door de instelling Ondersteuningsplaatsing in te schakelen. Zorg ervoor dat het ondersteuningsmateriaal eerst de bouwplaat raakt door de optie Touching Buildplate te selecteren.
      OPMERKING: Gebruik de vijf STL-bestanden in Supplemental File 1 om alle benodigde elementen te printen, waaronder de losgekoppelde buis, ligatuur (met inkeping), muistandbed (met inkepingen), deksel en ligatuurhouderslot. Zie de Materiaaltabel voor de afmetingen van elk item (eerder gepresenteerde blauwdrukspecificaties10).
    2. Na het drukken knip je alle bedrukte ondersteunende materialen van modellen af met behulp van een draadknipper, een naaldtang of een ander instrument.
      OPMERKING: Draag tijdens deze procedure een veiligheidsbril.
  2. Muis tandbedassemblage
    1. Om het muizentandbed voor te bereiden, leg je alle onderdelen uit zoals getoond (Figuur 3A) en bereid je de lijm voor (Figuur 3B).
    2. Plaats een paar druppels lijm (Figuur 3C) en bevestig de schroeven zoals getoond (Figuur 3D). Bereid opnieuw voor om lijm (Figuur 3E) over te brengen op de gebieden waar het wordt aangebracht. Schuif de gleuf van de geprinte buis (Figuur 3F) op zijn plaats met het weerhaakvormige uiteinde naar het Mouse Dental Bed (hier zal de slang voor het afvoeren van isofluraan vastzitten).
    3. Zet hoofdstabiliserende stukken vast met lijm (Figuur 3F).
    4. Veeg overtollige lijm weg en houd lichte druk op alle ingevoegde stukken voor stevige bevestiging (Figuur 3F).
  3. Aanpassingen van ligatuurhouders
    1. Om het ongemak bij het vergrendelen/ontgrendelen van het mechanisme te verminderen, zorg ervoor dat alle vierkante/scherpe randen aan het buitenste deel van het Ligature Holder Slot (Figuur 4A) licht afgeschuind zijn onder een hoek van 45° met een 15C scalpelhandvat, nr. 3 met 15C mes.
    2. Om een strakke pasvorm van het vergrendelingsmechanisme op de ligatuurhouder te garanderen, maak je alle interne afgeronde hoeken van het ligatuurhouderslot (Figuur 4B-F) vierkantig met een 15C scalpelblad.
      OPMERKING: Hierdoor kan het slot volledig tegen de ligatuurhouder zitten en zijn er slechts kleine aanpassingen nodig.
      1. Gebruik een 3D-printafkniptool of een 15C scalpelblad om de achtergebleven "flits" op de boven- en onderranden te verwijderen, zelfs nadat het grootste deel van de steun is verwijderd, en schuin de randen licht 45° (vergelijkbaar met de afschuining bij de Ligature Holder Lock in stap 1) om een strak passend slot te garanderen.
        OPMERKING: Verwijder niet te veel materiaal, maar net genoeg zodat het slot zonder weerstand kan worden opgeschuivd.
    3. Als het te dun is, snoei dan de lengte van elke punt af tot een dikkere doorsnede [minstens 0,5 mm dik] is bereikt, waarbij er voldoende ruimte tussen de punten blijft om te voorkomen dat het gehemelte wordt aangetast bij het plaatsen van ligaturen. Zorg ervoor dat de punten na het snijden minstens 3 mm lang zijn (Figuur 5A, weergegeven door "CUT").
    4. Verwijder op de punten van de Ligature Holder elke flits van de "steun" waarop het gereedschap is geprint om ervoor te zorgen dat de zijkant van de punten vlak is (Figuur 5B, pijl).
    5. Neem een "snee" van de zijkant van elke punt onder een hoek van 45° om het lasten van de ligatuur te verzachten en de randen te verzachten om traumatische schade aan het zachte weefsel te voorkomen (Figuur 5C, aangegeven door pijlen).
    6. Zorg ervoor dat elke punt op de ligatuurhouder een "V"-vormige inkeping bevat waarin de zijden naaddraadligaturen kunnen rusten. Als dit in stap 2.3.6 is verwijderd omdat de oorspronkelijk geprinte tip te dun was, verfijn deze dan op de print of reproduceer het.
      1. Als deze "V"-vormige inkeping zichtbaar is, leg dan de Ligature Holder op een vlak oppervlak met beide uiteinden parallel aan het tafelblad, plaats een 15C scalpelblad voorzichtig in de basis van de inkeping en wieg het lemmet zachtjes van links naar rechts zodat de bladrand aan de basis van de "V" blijft en de zijkant van het blad de bovenwanden van de "V" raakt. Met het lemmet aan de basis van de inkeping, draai je het blad heel voorzichtig naar het buitenste oppervlak van de punt en herhaal je deze beweging om de basis van de "V"-vormige inkeping aan de buitenrand te verfijnen, zodat de hechtdraad gemakkelijker op zijn plaats kan worden geleid.
        OPMERKING: Deze wiegbeweging zorgt voor net genoeg beweging in het filament om het uit de weg te bewegen en de inkeping te verfijnen zonder te veel materiaal te verwijderen.
      2. Als deze "V"-vormige inkeping niet zichtbaar is, leg dan de Ligature Holder op een vlak oppervlak met beide uiteinden loodrecht op het tafelblad. Terwijl je recht naar beneden kijkt langs beide uiteinden van de Ligature Holder, plaats je een 15C scalpelblad in het midden van de punten en maak je in één bewuste beweging een ondiepe snede om het begin te creëren van wat uiteindelijk de "V"-vormige inkeping wordt.
        OPMERKING: Het is vaak makkelijker om deze actie op elke punt afzonderlijk uit te voeren dan te proberen het lemmet op de juiste plek op beide punten tegelijk te positioneren.
      3. Herhaal stap 2.3.7.2 indien nodig, waarbij je ervoor zorgt dat de rand van het scalpelblad altijd terugloopt naar dezelfde plek in het midden van de punt.
        OPMERKING: Als de rand van het blad niet terugloopt naar dezelfde plek, worden er meerdere sneden gemaakt, waardoor de filamentlagen in die gebieden beginnen te scheiden en mogelijk de prestaties van het gereedschap verminderen.
        OPMERKING: De diepte van de "V"-vormige inkeping moet periodiek worden getest met een gebonden hecht-seiden ligatuur om te bepalen of de ligatuur vasthoudt of steeds losschuift (kan erop wijzen dat verdere verfijning nodig is). De houder moet zo worden geprint dat de inkeping naar beneden op de bouwplaat wijst en de Ligature Holder-slot zo georiënteerd is dat de bredere opening naar beneden de bouwplaat raakt. Ook hier kan ondersteuningsmateriaal worden gebruikt met Support Placement ingesteld op alleen Touching Buildplate.
  4. Ligatuurhouder gemonteerd
    OPMERKING: Nadat de aanpassingen zijn gedaan, zet je de Ligature Holder in elkaar, en controleer je het volgende:
    1. Wanneer een ligatuur op zijn plaats wordt vergrendeld, zorg er dan voor dat het slot de draad aan de ligatuurhouder knijpt (niet te zien in Figuur 6A zoals aangeduid door de pijl, maar wel in Figuur 6B) aan de boven- of onderkant van de vergrendeling (beide indien mogelijk, maar dit kan moeilijk te realiseren zijn).
      OPMERKING: Deze wrijving zorgt ervoor dat de ligatuur niet uit positie glijdt.
    2. Als de ligatuur in de groeven van de ligatuurhouder wordt gedraaid, als deze steeds uit de punten glijdt, verdiep je de groeven of verleng je ze verder naar de buitenkant van de punt om een "spoor" te creëren waarin de draad zal zitten.
    3. Controleer of de twee knopen gecentreerd zijn (Figuur 6C) en waterpas (rechte lijn in Figuur 6D) wanneer je het van voren van de Ligatuurhouder bekijkt; Zo niet, dan is de ene groeve dieper dan de andere.
    4. Controleer of de ligatuur net binnen de inkepingen zit en niet te diep zit; anders is er een verhoogd risico dat de punt van de ligatuurhouder contact maakt met het zachte weefsel en trauma veroorzaakt tijdens het plaatsen van de ligatuur.
    5. Met een tandheelkundige explorer (Figuur 6E) bevestig je dat de ligatuur terugveert op zijn plaats zonder te slippen wanneer er zachte kracht tussen de knopen wordt uitgeoefend (dit simuleert de kracht die hij zal ervaren tijdens het plaatsen van de ligatuur).

3. Ligatuurplaatsing

OPMERKING: Het is mogelijk om de ligaturen tussen muistanden te plaatsen, met of zonder toevoeging van menselijke parodontale ziekteverwekkers11. Een tijdsafhankelijke analyse van de microbiële samenstelling van de ligatuur (zonder supplementatie met menselijke bacteriesoorten) toonde een verschuiving in de microbiomegemeenschap (dysbiose) tijdens de ontwikkeling van parodontitis12. Om deze reden wordt een ligatuurvervanging niet aanbevolen, omdat dit de reproduceerbaarheid van het resultaat kan veranderen. De opname van bacteriesoorten in combinatie met de ligatuur hangt af van de vraag die in een specifieke studie wordt behandeld. Vanwege het verwachte ligatuurverliesvan 10-15% worden ligaturen bierdig in één muis geplaatst. Deze aanpak minimaliseert het verlies van muizen tijdens het experiment.

  1. Nadat de muis is verdoofd met ingeademde isoflurane, plaats je de verdoofde muis in het Mouse Dental Bed met zijn rug tegen het bed en de neus dicht bij de neuskegel.
    OPMERKING: Muizen moeten worden verdoofd met 4% (vol/vol) isoflurane. Isoflurane verdamper en zuurstof worden gefilterd door een luchtfilter van 0,2 μm. Zodra de muis volledig is verdoofd en in het Mouse Dental Bed is geplaatst, moet de muis worden onderhouden met een doorstroming van 1,5-2,5% door de neuskegel. Muizen worden gemonitord op basis van onwillekeurige lichaamsbewegingen en ademhalingsfrequentie (~55-65 ademhalingen per minuut). Er hoeft geen pijnstillend middel te worden toegediend aan muizen die zijn opgevoed met ligatuurparodontitis, aangezien dit een niet-invasieve en niet-chirurgische procedure is die vergelijkbaar is met het flossen van een menselijke tand. Het plaatsen van de ligatuur zal naar verwachting zeer milde ongemakken veroorzaken bij de muizen (voornamelijk door de ophoping van bacteriën tussen twee tanden), maar zou geen pijnstillers moeten vereisen. Er worden geen complicaties verwacht na het plaatsen van de ligatuur door een getrainde persoon.
  2. Gebruik de elastiekjes om de kop van de muis te stabiliseren en open de mond.
    OPMERKING: De band rond de mandibulaire snijtanden trekt ook de tong terug, en de spanning is passief om de kaak te openen zonder eraan te trekken. Het visualiseren van de kiezen wordt eenvoudiger wanneer de lichtbron onder een hoek wordt gericht om te voorkomen dat schaduwen het gezichtsveld belemmeren. Het muizendentjebed is specifiek ontworpen voor het vereenvoudigde, door ligatuur geïnduceerde parodontitis-muismodel. De afstand tussen de neus van de muis en de kegel is nodig om de muis kleine lichaamsbewegingen te laten uitvoeren tijdens de experimentele procedure. Deze beweging van de muis maakt het mogelijk om de handbeweging van de gebruiker op passende wijze te monitoren tijdens het gebruik van de ligatuurhouder en regelt de hoeveelheid kracht die wordt gebruikt tijdens het plaatsen van de ligatuur. Het plaatsen van de ligatuur zou 5-10 minuten per muis moeten duren. Procedures moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde kap voor het uitvoeren van dierproeven
  3. Om een ligatuur aan de rechterkant te plaatsen, houd je de Ligature Holder in je rechterhand en de explorer in de linkerhand.
    OPMERKING: Als de knopen op de ligatuur niet gecentreerd zijn tussen de punten, maar dichter bij één punt, dan is de ligatuur mogelijk beter geschikt om aan een specifieke zijde te plaatsen. Als de knopen bijvoorbeeld dichter bij de rechterpunt van de ligatuurhouder worden geplaatst, kan deze ligatuur gemakkelijker aan de rechterkant te plaatsen zijn.
  4. Plaats voorzichtig de punt van de explorer onder het interproximale contact van de eerste en tweede kiezen aan de palatale zijde.
    1. Laat de explorer-tip eerst de tanden aanraken en daarna naar beneden glijden en tegen het gingiva rusten om traumatisering van het zachte weefsel te voorkomen; Laat het explorer-handvat horizontaal in een horizontale hoek staan zodra het correct is gepositioneerd.
    2. Let op welk uiteinde van de explorer aan de rechterkant wordt geplaatst en welk aan de linkerkant. Zorg ervoor dat de punt van de explorer in een opwaartse richting in het proximale contactgebied haakt, terwijl de buiging van de schacht over de contralaterale zijde kan liggen om het hoofd te stabiliseren tegen reactiekrachten tijdens plaatsing.
  5. Gebruik de ligatuurhouder in een horizontale hoek, trek de wang terug door de ligatuurhouder eerst boven het interproximale contact tussen de tweede en derde kies te plaatsen, de rand van de ligatuurhouder tegen de wang te duwen om deze te bewegen, en vervolgens de ligatuurhouder in positie te brengen bij het interproximale contact van de eerste en tweede kiezen.
    OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat er geen buccale slijmvlies vast komt te zitten tussen de ligatuur en de tanden, wat de plaatsing kan verstoren.
  6. Zodra de ligatuur over het interproximale contact tussen de eerste en tweede kies is geplaatst, draai je het handvat van de ligatuurhouder tot 45° en duw je met een combinatie van zacht wiebelen en glijden de ligatuur door het contact.
  7. Het overtollige garen doorknippen:
    1. Gebruik een fijne pincet om het overtollige garen dat aan de knoop aan de rechterkant vastzit vast te klemmen, trek de draad over de tanden naar links, en schuif met een schaar die net iets open is naar beneden tot hij ~1,5 mm van de knoop af is voordat je het doorknipt.
      OPMERKING: Dit helpt de kans op onbedoeld slijmvliezertrauma te verkleinen bij het schrappen van het overtollige slijmvlies.
    2. Herhaal bovenstaande met omgekeerde richtingen voor de andere knoop.
  8. Spiegel de bovenstaande stappen uit 3.3. naar 3.7.2. bij het plaatsen van een ligatuur aan de andere kant van de mond.
    OPMERKING: Ligatuurverzameling bij het offeren wordt aanbevolen, omdat de dysbiotische verschuiving kan worden beïnvloed door verschillende experimentele omstandigheden die worden getest12. Om de verzameling te vergemakkelijken, worden muizen in het Murine Dental Bed geplaatst en wordt een van de knopen van de ligatuur verwijderd, gevolgd door een voorzichtige interproximale verwijdering met een tang. Het gebruik van het Mouse Dental Bed tijdens de ligatuurverzameling zorgt voor een passende stabiliteit van de muis en gemakkelijke toegang tot de ligatuurplaats.

4. Kwantificatie van botvernietiging

  1. μCT-analyse
    1. Open de software en klik op Bestand | Afbeelding importeren...
    2. Klik op Bladeren in het pop-upmenu, ga naar de map met Dicom-bestanden voor één scan en selecteer het eerste bestand.
    3. Klik op Examine om andere bestanden in de map te vinden en te selecteren die deel uitmaken van hetzelfde gescande voorbeeld. Klik OK.
    4. Nadat de afbeelding begint te laden, klik je op Visualize en Isosurface.
    5. Verander de beelddrempel naar 5.000 en de Surface Quality Factor (%) naar 55.
    6. Vink vakjes aan met de markering Beeld gladstrijken en Clip Surface met Huidige ROI en klik op Update.
    7. Pas de Level-eigenschappen aan door met de rechtermuisknop op Venster/Niveau onderaan te klikken (Figuur 7A) en te klikken op Venster-/Niveau-eigenschappen bewerken. Selecteer een botdichtheidswaarde die standaard is voor alle monsters. Om dit protocol te volgen, gebruik je 2.000 maar pas je het aan op basis van de botdichtheid van de monsters en houd je het constant voor alle metingen.
    8. Om vlakken te manipuleren:
      1. Gebruik sneltoetsen I/J/K verbergen/tonen voor de drie verschillende vlakken.
      2. Klik met de rechtermuisknop en beweeg de cursor om in en uit te zoomen.
      3. Druk op Shift en klik dan met de linkermuisknop om te pannen.
      4. Klik op Slice om de vlakken te verplaatsen en te roteren.
      5. Klik op het midden van het vlak om het vlak vooruit/achteruit te bewegen of plaats de cursor in het midden van het gewenste vlak en gebruik de pijltjestoetsen omhoog en omlaag om het vlak stuk voor stuk te verplaatsen.
      6. Klik op de rand van het vlak om rond een lijn te draaien die parallel aan deze rand in het midden van het vlak loopt.
      7. Klik op de hoek van een vlak om rond het vlak te draaien.
    9. Oriënteer de z-as (blauw paneel bovenaan het scherm - de z-snee) zodat de oppervlakken/vormen van alle drie de tanden tegelijkertijd zichtbaar worden (of zo dicht mogelijk bij elkaar liggen) (Figuur 7B).
    10. Scroll door hetzelfde vlak (blauw paneel bovenaan de scherm-z-snee) zodat de wortels van de1e en2e molaren zichtbaar zijn (Figuur 7C). Probeer een punt te kiezen dat ver genoeg naar beneden bij de wortels ligt zodat alle omliggende anatomie zichtbaar is, maar ook waar de kanalen goed gedefinieerd en in een rechte lijn lijken.
      OPMERKING: Het vlak moet mogelijk worden gedraaid om de kanalen verticaal te oriënteren.
    11. Oriënteer de x-as (verticale groene lijn in het z-snede paneel) zodat deze uitlijnt met de buccale wortels van de1e en2e molaar (probeer indien mogelijk door het centrale deel van elke wortel/kanaal uit te lijnen; anders uitlijnen via de buccale wortel van de1e molaar en de distobuccale wortel van de2e molaar) (Figuur 7D).
    12. Gebruik de oriëntatie van de x-snede als referentie voor de uitlijning van de y-snede (verticale blauwe lijn in het x-snede paneel).
      1. Lijn de y-snede zo uit dat deze verticaal parallel is aan de wortel van de eerste molaar in het x-slice-paneel (Figuur 7E). Draai het vlak om de wortel verticaal te oriënteren. Let op dat de blauwe lijn door het midden van de wortel loopt.
        OPMERKING: In gebieden met botverlies (zoals verwacht bij dit model) kan de alveolaire richel een defect hebben; Daarom moet de middellijn van de wortel worden geschat omdat het omringende bot mogelijk niet aanwezig is om idealiter het midden van de kom te definiëren.
    13. In het y-slice paneel meet je de afstand van de cementoemaille overgang (CEJ) tot de alveolaire botkam (ABC) door de cursor in het diepste punt van de groef bij de CEJ te plaatsen en 1 in te drukken, en vervolgens door de cursor op het dichtstbijzijnde punt van de ABC te plaatsen en 2 in te drukken zoals getoond (Figuur 7F). Heteerste punt wordt aangeduid met een blauwe pijl en het tweede punt met een groene pijl.
      1. Als de pijlen pas verschijnen nadat beide punten zijn geselecteerd, selecteer ze dan door met de pijl over de gewenste gebieden te bewegen en de cijfertoetsen op het toetsenbord in te drukken, want alleen klikken met de muis werkt niet.
      2. Als de CEJ moeilijk te bepalen is, gebruik dan de pijltjestoetsen omhoog en omlaag om door aangrenzende sneden te scrollen om de locatie te bevestigen.
      3. Meet meerdere punten van de ABC als het "dichtstbijzijnde punt" moeilijk te bepalen is, om te bevestigen dat er weinig tot geen variatie in de meting is.
        OPMERKING: Om te bevestigen dat de juiste meting is verricht, moet men de x- en z-sneden zien die zich snijden over de gewenste wortel en kan men de meting visueel bevestigen in het 3D-beeld door de vlakken te verbergen (Figuur 7F).
  2. Gingivale expressiekwantificatie van Rankl/Opg en Rankl/Rank
    1. Verzamel gingivous weefsel zoals eerder beschreven9.
      OPMERKING: De beste RNA-extractieresultaten worden verkregen met verse weefselmonsters en RNA-zuivering moet zo snel mogelijk worden verwerkt.
    2. Extraheren van gingivale weefsel-RNA door kraalbeats met behulp van de referentiekit en keramische kralen. Volg de instructies op de kit en bewaar het monster bij -80 °C tot analyse door qRT-PCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aRepresentatieve data-analyse van lineaire alveolaire botmetingen van WT vrouwelijke en mannelijke muizen bij de uitgangslijn (gezondheid) en 9 dagen na ligatie wordt weergegeven in Figuur 1A. De vermogensberekening geeft aan dat er in totaal 10 muizen nodig zijn (4-5 muizen per groep) om verschillen tussen deze groepen te detecteren als het primaire resultaat lineaire botwaarden zijn, gemeten met μCT (Figuur 1B). Een powerberek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie biedt inzichtelijke informatie en gedetailleerde, stapsgewijze richtlijnen over het eerder gepresenteerde vereenvoudigde ligatuur-geïnduceerde parodontitis-muismodelprotocol10. De details in het huidige artikel kunnen de reproduceerbaarheid aanzienlijk beïnvloeden en worden ondersteund door de ervaring van de groep met dit specifieke ligatuur-geïnduceerde parodontitismodel 11,12,13,18,19,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De STL-bestanden die in eerdere publicatie9 zijn gebruikt om de 3D-geprinte apparaten te maken, vallen onder een auteursrechtovereenkomst met de University of North Carolina at Chapel Hill ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Dental & Craniofacial Research van de National Institutes of Health onder Award Numbers K01DE027087 (JTM) en R01DE032830 (JTM). Het werk werd ook ondersteund door het National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R01-AI153265 (KVS). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Daarnaast wordt het hier gerapporteerde onderzoek ook ondersteund door de Fulbright/CAPES-programma-financieringscode 001 (TA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BladeIntegra4-315C15C blade
Ceramic beadsVWR10158-6080.5 mL x 1.4 mm Keramische kralen
Lijm/hars materiaalThe Gorilla Glue Company8401519
Ligatuurhouder (met inkeping)UNC at Chapel Hill BeAM Design Center facility coreniet van toepassing118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
LigatuurhouderslotUNC at Chapel Hill BeAM Design Center facility coreniet van toepassing17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 3D printer Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)niet van toepassingAleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 model
MicroView SoftwareParallax Innovations2.5.0-3139Software gebruikt voor botmetingen
Muis tandenborstel (met uitsparingen)UNC at Chapel Hill BeAM Design Center facility coreniet van toepassing103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Muis tandenborstel bovenkantUNC at Chapel Hill BeAM Design Center facility coreniet van toepassing99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Polymelkzuur (PLA) filamentVerbatim552593,0 mm PLA
Rapidpure RNA weefselkitMP Biomedicals112721050
MeshandgreepBard-Parker37103015C meshandgreep
Sutuur-zijdeRoboz Surgical InstrumentSUT-15-1
Taqman qPCR primersThermo FisherRank (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765 InvivoGen, San Diego, USA#inh-vx765-1Caspase-1 remmer gebruikt voor hostmodulatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Alveolair botverlies3D geprinte instrumentenmuizen tandbedligatuurhoudermicro CT analysegingivale genexpressieosteoclastogene signaleringinflammatoire botdestructie

Gerelateerde artikelen