Methodenartikel

Translationeel 3D-celcultuurmodel om de effecten van hyperoxie op menselijke neonatale luchtwegepitheelcellen te beoordelen

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om een lucht-vloeistofinterface (ALI) kweekmodel op te zetten dat gebruikmaakt van neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC) en om fysiologisch relevante blootstelling aan hyperoxie uit te voeren om het effect van atmosferisch geïnduceerde oxidatieve stress op cellen afgeleid van het zich ontwikkelende neonatale luchtwegoppervlakepitheel te bestuderen.

Samenvatting

Het premature neonatale luchtwegepitheel wordt voortdurend blootgesteld aan omgevingsstressoren. Een van deze stressoren bij pasgeborenen met een longziekte is onder meer zuurstofspanning (O2) die hoger is dan die van de omgevingsatmosfeer - hyperoxie genoemd (>21% O2). Het effect van hyperoxie op de luchtwegen hangt af van verschillende factoren, waaronder het ontwikkelingsstadium van de luchtwegen, de mate van hyperoxie en de duur van de blootstelling, waarbij variabele blootstellingen mogelijk leiden tot unieke fenotypes. Hoewel er uitgebreid onderzoek is gedaan naar het effect van hyperoxie op neonatale longalveolisatie en hyperreactiviteit van de luchtwegen, is er weinig bekend over het onderliggende effect van hyperoxie op korte en lange termijn op menselijke neonatale luchtwegepitheelcellen. Een belangrijke reden hiervoor is de schaarste aan een effectief in vitro model om de ontwikkeling en functie van het epitheel van de menselijke neonatale luchtwegen te bestuderen. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren en uitbreiden van menselijke neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC's) met behulp van menselijke neonatale tracheale aspiraten en het kweken van deze cellen in lucht-vloeistofinterface (ALI) cultuur. We tonen aan dat nTAEC's een volwassen gepolariseerde cel-monolaag vormen in ALI-cultuur en mucociliaire differentiatie ondergaan. We presenteren ook een methode voor matige blootstelling aan hyperoxie van de celmonolaag in ALI-cultuur met behulp van een gespecialiseerde incubator. Daarnaast beschrijven we een test om cellulaire oxidatieve stress te meten na blootstelling aan hyperoxie in ALI-cultuur met behulp van fluorescerende kwantificering, die bevestigt dat matige blootstelling aan hyperoxie cellulaire oxidatieve stress induceert, maar geen significante celmembraanbeschadiging of apoptose veroorzaakt. Dit model kan mogelijk worden gebruikt om klinisch relevante blootstelling aan hyperoxie te simuleren die wordt aangetroffen door neonatale luchtwegen op de Neonatale Intensive Care Unit (NICU) en kan worden gebruikt om de korte- en langdurige effecten van O2 op de epitheliale programmering van de neonatale luchtwegen te bestuderen. Studies met behulp van dit model kunnen worden gebruikt om manieren te onderzoeken om oxidatieve schade aan zich ontwikkelende luchtwegen in het vroege leven te verminderen, die betrokken is bij de ontwikkeling van langdurige luchtwegaandoeningen bij voormalige premature baby's.

Inleiding

Therapeutische zuurstof (O2) is een van de meest gebruikte therapieën op de neonatale intensive care (NICU)1. Bijgevolg is blootstelling aan hyperoxie (>21% O2) een veel voorkomende atmosferische stressfactor die neonaten met en zonder significante longziekte tegenkomen. Longreacties op hyperoxie kunnen variëren, afhankelijk van de intensiteit en/of duur van de blootstelling en de anatomische locatie, het celtype en het stadium van longontwikkeling 2,3,4,5,6. Het grootste deel van het onderzoek naar longbeschadiging door neonatale hyperoxie is gericht op het effect van blootstelling aan hyperoxie in de context van postnatale alveolarisatie om bronchopulmonale dysplasie (BPS) te modelleren - de meest voorkomende chronische longziekte die te vroeg geboren baby's treft 6,7,8,9,10,11. De ernst van BPS wordt geclassificeerd aan de hand van de hoeveelheid ademhalingsondersteuning en O2 die nodig is 36 weken na de menstruatie9. De meeste baby's met BPS verbeteren in de loop van de tijd klinisch naarmate de longen blijven groeien, waarbij de meerderheid vóór hun eerste verjaardag afbouwt van ademhalingsondersteuning12,13. Ongeacht de ernst van BPS na de geboorte, omvatten significante morbiditeiten die voormalige premature baby's treffen, een 5-voudig verhoogd risico op voorschoolse piepende ademhaling, astma, terugkerende luchtweginfecties tijdens de kindertijd en chronische obstructieve longziekte met vroege aanvang 12,14,15,16,17,18,19. Het effect van hyperoxie op langdurige luchtwegaandoeningen en longinfecties bij te vroeg geboren zuigelingen is onderzocht met behulp van in vitro en in vivo diermodellen 20,21,22,23,24. De meeste van deze modellen waren echter gericht op de rol van mesenchymaal weefsel, alveolair epitheel en gladde spieren van de luchtwegen 25,26,27,28.

Het epitheel van het luchtwegoppervlak bekleedt het hele pad van het ademhalingssysteem, dat zich uitstrekt van de luchtpijp tot aan de terminale bronchiole en eindigt net voor het niveau van de longblaasjes29. Basale cellen van de luchtwegen zijn de primaire stamcellen in het luchtwegepitheel, met het vermogen om te differentiëren tot het volledige repertoire van volwassen luchtwegepitheellijnen, waaronder trilhaarcellen en secretoire cellen (clubcellen: niet-slijmproducerend en slijmbekercellen: slijmproducerend)29,30,31,32. Celkweekstudies in de context van neonatale hyperoxische longbeschadiging hebben meestal gebruik gemaakt van volwassen menselijke of muizen kankercellijnen33,34. Bovendien hebben de meeste in vitro-experimenten ondergedompelde kweeksystemen gebruikt, die geen differentiatie van de cellen in een mucociliair luchtwegepitheel mogelijk maken dat lijkt op het in vivo luchtwegepitheel bij mensen35. Bijgevolg is er een lacune in de kennis over de effecten van door hyperoxie geïnduceerde longbeschadiging bij het ontwikkelen van luchtwegepitheelcellen van menselijke pasgeborenen. Een van de redenen is de schaarste aan translationele modellen om de effecten van atmosferische blootstelling op het epitheel van de menselijke neonatale luchtwegen te bestuderen. Hyperoxische longbeschadiging op jonge leeftijd kan leiden tot langdurige luchtwegaandoeningen en een verhoogd risico op infectie, wat resulteert in levensveranderende gevolgen bij voormalige premature baby's 14,36,37. Bij niet-overlevende zuigelingen met ernstige BPS vertoont het epitheel van het luchtwegoppervlak duidelijke afwijkingen, waaronder hyperplasie van slijmbekercellen en verstoorde ciliaire ontwikkeling, wat duidt op abnormale mucociliaire klaring en verhoogde epitheelhoogte die luchtwegkaliber38 in gevaar brengt. In het afgelopen decennium is er meer belangstelling gekomen voor het kweken van primaire luchtwegepitheelcellen op de lucht-vloeistofinterface (ALI) om de postnatale ontwikkeling van luchtwegepitheel te bestuderen 39,40,41,42. ALI-modellen van neonatale luchtwegepitheelcellen zijn echter niet gebruikt in de context van atmosferische redoxverstoringsmodellen zoals blootstelling aan hyperoxie.

Met behulp van een eerder gepubliceerde methode39 hebben we neonatale tracheale aspiratiemonsters gebruikt die zijn verkregen van geïntubeerde pasgeborenen in de NICU en met succes primaire neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC's) geïsoleerd en geëxpandeerd. We hebben gebruik gemaakt van remmers van Rho, Smad, glycogeensynthasekinase (GSK3) en zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) signalering om de expansiecapaciteit te vergroten en senescentie in deze cellen te vertragen, zoals eerder beschreven39,42, wat een efficiënte en latere passaging van nTAEC's mogelijk maakt. Het protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van 3D ALI-culturen met behulp van nTAEC's en het uitvoeren van blootstelling aan hyperoxie op de nTAEC-monolagen. Rho- en Smad-remming wordt gebruikt gedurende de eerste 7 dagen van de ALI-cultuur (ALI-dagen 0 tot 7), waarna deze remmers voor de rest van de ALI-kweekduur uit de differentiatiemedia worden verwijderd. Het apicale oppervlak van de ALI-gekweekte monolaag van de luchtwegepitheelcel blijft blootgesteld aan de omgeving43, wat atmosferische verstoringsstudies mogelijk maakt en sterk lijkt op de pathobiologie van een zich ontwikkelende neonatale luchtweg die in vivo wordt blootgesteld aan hyperoxie. De concentratie van O2 die in eerdere celkweekstudies werd gebruikt (ongeacht onsterfelijke of primaire cellen) van neonatale hyperoxische longbeschadiging varieert aanzienlijk (variërend van 40% tot 95%), evenals de duur van de blootstelling (variërend van 15 minuten tot 10 dagen)36,44,45,46,47. Voor deze studie werd de ALI-celmonolaag blootgesteld aan 60% O2 gedurende 7 dagen van ALI dag 7 tot 14 (na verwijdering van Rho/Smad-remmers uit de differentiatiemedia). Blootstelling aan hyperoxie werd uitgevoerd tijdens de vroeg-middenfase van mucociliaire differentiatie (ALI dag 7 tot 14) in tegenstelling tot het volledig gedifferentieerde rijpe epitheel en simuleert dus het in vivo ontwikkelende luchtwegepitheel bij te vroeg geboren baby's. Deze blootstellingsstrategie minimaliseert het risico op acute O2-toxiciteit (wat wordt verwacht bij hogere concentraties O2) terwijl er nog steeds oxidatieve stress wordt uitgeoefend binnen een fysiologisch relevant bereik en lijkt op het kritieke overgangsvenster van de relatief hypoxische intra-uteriene omgeving naar een hyperoxische externe omgeving bij te vroeg geboren menselijke pasgeborenen.

Protocol

Neonatale tracheale aspiraatmonsters werden alleen verzameld na geïnformeerde toestemming van de ouders, en het protocol dat wordt gebruikt voor het verzamelen, transporteren en opslaan is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van het Health Sciences Center van de Universiteit van Oklahoma (IRB 14377).

1. Voorbereiding op isolatie, passage en ALI-cultuur van nTAEC

  1. Voorbereiding van de media
    1. Bronchiaal epitheliaal luchtwegmedium (BLEAM) met remmers (BLEAM-I): Bereid 500 ml (1 fles, bewaard bij 4 °C) BLEAM voor door 1,25 ml HLL-supplement (500 μg/ml humaan serumalbumine, 0,6 μM linolzuur, 0,6 μg/ml lecithine), 15 ml L-glutamine (6 mM), 2 ml extract P (0,4%, hypofyse-extract van runderen), 5 ml TM1 (1 μM epinefrine, 5 μg/ml transferrine, 10 nM trijoodthyronine, 0,1 μg/ml hydrocortison, 5 ng/ml epidermale groeifactor (EGF), 5 ng/ml insuline), 1 ml antibiotische oplossing (Normocin, 0,1 mg/ml). Om veroudering van de primaire cellen te voorkomen en de efficiëntie van de expansie te verbeteren, voegt u de volgende groeifactorremmers toe zoals eerder beschreven39: Y-27632 (Rho-geassocieerde proteïnekinase of ROCK-remmer) met een eindconcentratie van 5 μM, A83-01 (remt Smad-signalering) met een eindconcentratie van 1 μM, CHIR 99021 (glycogeensynthasekinase-3 of GSK3-remmer) met een eindconcentratie van 0,4 μM en Rapamycine (remmer van moleculair doelwit van rapamycine of mTOR) met een finale concentratie van 5 nM. Filtreer de media door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm. Raadpleeg Tabel 1 voor een lijst met mediacomponenten.
    2. Humaan bronchiaal/tracheaal epitheelcel (HBTEC) ALI-medium: Maak 500 ml HBTEC-media door de fles te ontdooien bij 37 °C en 1 ml antibiotische oplossing (Normocin, 0,1 mg/ml) toe te voegen. Eenmaal toegevoegd, filtert u de media door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm.
    3. HBTEC-media met remmers (HBTEC-I): Bereid de HBTEC-media voor zoals hierboven. Voeg voor het filtreren de volgende remmers toe: Y-27632 met een eindconcentratie van 5 μM en A83-01 met een eindconcentratie van 0,5 μM. Filtreer de media door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm.
      OPMERKING: Bewaar BLEAM-I-, HBTEC- en HBTEC-I-media bij 4 °C, gedateerd en geëtiketteerd, in het donker (verpakt in folie) en warm alleen aliquots op van wat nodig is (houdbaarheid is 30 dagen).
    4. HEPES/FBS: Voeg 500 ml HEPES-gebufferde zoutoplossing en 88 ml FBS toe (de uiteindelijke concentratie is 15%). Eenmaal toegevoegd, filtreer de oplossing door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar het bij 4 °C, gedateerd en geëtiketteerd.
      OPMERKING: Aliquot en verwarm BLEAM, HEPES-FBS en Trypsin-EDTA tot 37 °C (minstens 30 min) voor gebruik.
  2. Coatingcultuurkolven en ALI-celcultuurinzetstukken met een 804G-geconditioneerd medium
    1. Bereid 804G-cel (epitheelcellijn van rattenblaas) matrixgeconditioneerde media voor zoals eerder beschreven39.
    2. Smeer de celkweekkolf en de celkweekinzetstukken in de broedstoof 37 °C gedurende ten minste 4 uur in met 804G-geconditioneerde media, 5% CO2. Zie tabel 2 voor de hoeveelheden media die nodig zijn om verschillende kweekkolven en celkweekinzetstukken te coaten.

2. Isolatie en uitbreiding van nTAEC's en voorbereiding op daaropvolgende ALI-cultuur

  1. Verkrijg vers tracheaal aspiraat (ongeveer 1 ml) tijdens routinematige afzuiging van de endotracheale tube van geïntubeerde pasgeborenen en verzamel het aspiraat in een slijmvanger. Als het aspiratievolume onvoldoende is om de slijmvanger te bereiken, spoel de afzuigkatheter dan met 1-3 ml steriele zoutoplossing.
  2. Label het monster en bewaar het in een zak met biologisch gevaarlijk materiaal op ijs.
    OPMERKING: De monsters kunnen maximaal 24 uur op ijs bij 4 °C worden bewaard. De opbrengst is echter hoger bij verse monsters.
  3. Vervoer het monster van de NICU naar het laboratorium. Smeer een T25-kolf in met 804G-geconditioneerde media en bereid je voor op inoculatie van het monster op het moment dat het tracheale aspiraat naar het laboratorium wordt vervoerd.
  4. Verwijder de slijmvanger uit de zak met biologisch gevaarlijk water en reinig de buitenoppervlakken grondig met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Open voorzichtig de dop op de slijmvanger onder een steriele celcultuurkap.
  5. Verdun het tracheale aspiratiemonster met steriel PBS tot 5 ml (om het slijm te verdunnen) en breng de hele inhoud over in een conische buis van 50 ml.
  6. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 250 x g, 20 °C-23 °C en gooi het bovenstaande (inclusief slijm) weg.
    OPMERKING: Alle centrifugaties worden hier gedaan bij 250 x g, 20 °C-23 °C gedurende 5 minuten, tenzij anders aangegeven.
  7. Resuspendeer de pellet in 5 ml BLEAM-I.
  8. Haal de T25-kolf uit de broedmachine en gooi de 804G-geconditioneerde media weg voordat u het monster plateert.
  9. Plaats het monster in de T25-kolf en plaats deze in de incubator bij 37 °C, 5 % CO2 (dit wordt Passage 0 of P0 genoemd).
  10. Vervang de media met BLEAM-I 24 uur na het plateren om loszittende cellen uit te wassen en vervolgens elke 48 uur.
    OPMERKING: Na verwerking van het tracheale aspiratiemonster en incubatie in BLEAM-I-media, verschijnen er 7-10 dagen na het uitplateren kubusvormige cellen. Ongeveer 3 weken na het uitplateren zijn de cellen dicht opeengepakt en hebben ze trypsinisatie nodig om vervolgens te passeren, uit te breiden en te bewaren. Cellen met vroege passage (P1 - P2) worden in cryobuizen geplaatst (2,5 x 106 cellen per 500 μL vriesmedia per cryobuis) en opgeslagen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  11. Ontdooi bevroren cellen snel van vloeibare stikstof in een waterbad van 37 °C en breng de celsuspensie over in een steriel buisje van de juiste grootte dat BLEAM-I bevat.
  12. Tel de cellen om het totale aantal en het aantal levende cellen te bepalen met behulp van een trypanblauwe kleuring en een geautomatiseerde of handmatige cellenteller zoals eerder beschreven48. Verdun de celsuspensie met een geschikt volume BLEAM-I, zodat de uiteindelijke concentratie 2,1 x 106 cellen in 15 ml celsuspensie is (voor T75-kolf).
    OPMERKING: Voor een T25-kolf worden over het algemeen 0,7 x 106 cellen in 5 ml celsuspensie gebruikt voor het zaaien.
  13. Breng de celsuspensie van 15 ml over in een T75-kolf en incubeer een nacht bij 37 °C, 5 % CO2 .
  14. Wissel de volgende ochtend de media uit met de nieuwe BLEAM-I. Vervang vervolgens de media elke 2 dagen door een nieuwe BLEAM-I. Zodra de cellen ongeveer 80%-90% zijn, zijn ze klaar om te worden getrypsiniseerd voor ALI-cultuur.
  15. Breng 5 ml trypsine-EDTA (T75) aan op de celmonolaag.
    OPMERKING: Vergeet niet om verse trypsine te gebruiken. Vermijd het gebruik van trypsine die meerdere keren is verwarmd.
  16. Incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C in de broedmachine. Tik vervolgens 8x-10x op de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Controleer onder de microscoop om te bevestigen dat de cellen na trypsinisatie zijn losgeraakt. Als er >50% van de cellen op de kolf achterblijft, was dan 2x met PBS en herhaal de trypsinisatiestap met een verkorte incubatietijd van 2-3 minuten.
  17. Stop de reactie met 15 ml HEPES-FBS en pipetteer 4x-5x op en neer. Breng de cellen over in een steriele buis van de juiste grootte en centrifugeer gedurende 5 minuten op 250 x g om de cellen te pelleteren.
  18. Zuig na het centrifugeren het supernatant voorzichtig op. Los de celpellet op in 1 ml BLEAM-I door voorzichtig 5x-10x op en neer te pipetteren.
  19. Tel de cellen om het totale aantal en het aantal live cellen te bepalen. Verdun de celsuspensie met een geschikt volume BLEAM-I, zodat de uiteindelijke concentratie 1 x 105 levende cellen per 100 μl celsuspensie is.

3. ALI-cultuur van nTAEC's

OPMERKING: Celkweekinserts moeten worden gecoat met 804G-geconditioneerde media en gedurende ten minste 4 uur bij 37 °C, 5% CO2 vóór de volgende stap worden geïncubeerd (zie stap 1.2).

  1. Haal de 24-well celkweekplaat(en) met de celkweekinzetstukken uit de broedmachine en gooi de 804G-geconditioneerde media weg.
  2. Voeg 1 ml BLEAM-I toe aan de basolaterale (onderste) kamer van elke ALI-put. Voeg 100 μl celsuspensie (1 x 105 cellen) toe aan de apicale kamer van de ALI-celcultuurinserts en incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2. Deze fase wordt gedefinieerd als ALI dag -2.
  3. Vervang de volgende dag de media in de basolaterale (1 ml) en apicale (100 μl) kamers door verse BLEAM-I. Zorg er bij het vervangen van de media in de apicale kamer voor dat u de celmonolaag niet verstoort. Deze fase wordt gedefinieerd als ALI dag -1.
  4. Verwijder de volgende dag de media uit zowel de basolaterale als de apicale kamers.
    OPMERKING: Het duurt 2 dagen voordat de cellen op het celkweekmembraan onder ondergedompelde omstandigheden samenvloeien. In dit stadium kan ALI worden vastgesteld.
  5. Voeg 1 ml HBTEC-I-media toe aan de basolaterale kamer, maar laat de media van de apicale kamer vrij en blootgesteld aan lucht. Deze fase wordt gedefinieerd als ALI dag 0.
  6. Blijf de HBTEC-I-media (1 ml) in de basolaterale kamer elke 48 uur verwisselen van ALI dag 0 tot 6. Schakel over op reguliere HBTEC-media (zonder remmers) op ALI dag 7 tot het gewenste tijdstip van de oogst.
    OPMERKING: Tijdens de eerste 7 dagen van de ALI-cultuur kunnen media uit de basolaterale kamer in de apicale kamer lekken. Deze media moeten elke dag zorgvuldig worden opgezogen om de gezondheid van de cellaag te behouden en ze in staat te stellen te differentiëren.
  7. Oogst cellen, celkweekinserts en basolaterale media op verschillende tijdstippen voor moleculaire technieken, assays en analyse.
    1. Voor dit protocol worden op ALI-dagen 0, 7 en 28 cellen geoogst voor qPCR-genexpressieanalyse (standaard fabrikantprotocol) van epitheliale differentiatiemarkers. Oogst op ALI-dagen 0, 7, 14 en 28 celkweekinzetstukken voor het testen van de barrièrefunctie (methoden die hieronder worden beschreven).
    2. Gebruik op ALI-dag 0 en 28 formaline-gefixeerde celkweekinserts voor immunofluorescerende kleuring met epitheliale differentiatiemarkers (gebruikmakend van eerder gepubliceerd protocol)49. Op ALI-dag 14 worden basolaterale media geoogst voor de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) (standaard fabrikantprotocol), cellysaten voor qPCR van oxidatieve stressmarkers en immunoblot met caspase-3 en gesplitste caspase-3-antilichamen (standaard fabrikantprotocol), en celkweekinserts voor oxidatieve stresstest (methode hieronder beschreven).

4. Testen van barrièrefunctie tijdens ALI-differentiatie

  1. Het meten van trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER)
    NOTITIE: Meet TEER met behulp van een epitheliale volt/ohmmeter (EVOM) tijdens ALI-differentiatie om de integriteit van de cellaag te beoordelen50.
    1. Voordat u de weerstandswaarden van het testfilter meet, gebruikt u een 804G-geconditioneerde mediagecoate celcultuur (verstoken van cellen) om de achtergrondweerstandswaarde in Ohm (Ω) te meten
    2. Trek de achtergrondweerstandswaarde af van de weerstandswaarden van het testfilter en vermenigvuldig het verschil met het celgroeioppervlak om de TEER-waarde voor elk testfilter te verkrijgen.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Trans Epitheliale Elektrische Weerstand (Ω.cm2)
      ΩT = Weerstandswaarde van het testfilter (Ω)
      ΩB = Achtergrondweerstandswaarde (Ω)
      C = Celgroeioppervlak (cm2)
      OPMERKING: Celkweekinserts die voor TEER-metingen worden gebruikt, worden vervolgens gefixeerd met 10% gebufferd formaline en onmiddellijk gebruikt voor immunofluorescerende kleuring en fluorescentiemicroscopie (hieronder beschreven methode) of bewaard bij 4 °C om later te kleuren.
  2. Fluoresceïne-isethionaat dextran (FITC-dextran) epitheliale permeabiliteitstest
    OPMERKING: Epitheliale permeabiliteitstest werd uitgevoerd met behulp van twee verschillende molecuulgewichten van FITC-dextran (10 kD en 20 kD) tijdens ALI-differentiatie.
    1. Bereid FITC-dextran werkoplossing (1 mg/ml): meet 5 mg FITC af en meng er 1 ml DMSO (5 mg/ml) door. Resuspendeer 5 mg/ml bouillon in HBTEC-media verwarmd tot 37 °C tot een concentratie van 1 mg/ml. Bescherm de oplossing tegen licht.
    2. Breng testfilters (met cellen) over naar een nieuwe plaat met 12 putjes en voeg 1 ml HBTEC-media toe in het basolaterale compartiment.
    3. Zuig de media van het apicale compartiment op (indien aanwezig) en vervang deze door 250 μl FITC-dextran werkoplossing. Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
    4. Beëindig de FITC-dextran-test door de testfilters (met FITC-dextran-werkoplossing) van de plaat met 12 putjes te verwijderen.
    5. Verzamel de basolaterale media van de plaat met 12 putjes in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en vortex.
    6. Breng 100 μL aliquots van elke buis over op een doorzichtige zwarte polystyreenmicroplaat met 96 putjes aan de onderkant in drievouden. Breng 100 μL HBTEC-media over naar extra putjes in de plaat met 96 putjes als negatieve controle om achtergrondfluorescentie te meten.
    7. Meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van een spectrofotometer met behulp van 490 nm excitatie en emissiemaxima van 520 nm.
    8. Trek de gemiddelde achtergrondfluorescentiewaarde af van de fluorescentiewaarden van het testfilter om gecorrigeerde fluorescentie te verkrijgen en druk de waarden uit als een percentage ten opzichte van de gecorrigeerde fluorescentiewaarden op ALI-dag 0 voor FITC 10 kD en 20 kD.

5. Blootstelling aan hyperoxie met behulp van TriGas-incubator

  1. Bepaal op ALI dag 7 het aantal celkweekinserts dat in hyperoxie moet worden geplaatst op basis van experimentele en oogstbehoeften.
  2. Stel het O2-niveau in de TriGas-incubator in op 60% O2. Het duurt over het algemeen ~30-45 minuten voordat het O2-niveau 60% bereikt.
  3. Zodra het O2-niveau is gestabiliseerd op 60%, plaatst u de celkweekplaat met 24 putjes met de celkweekinzetstukken die zijn toegewezen aan de hyperoxiegroep in de incubator en sluit u de deur van de incubator.
    OPMERKING: Deze stap moet zo efficiënt mogelijk worden uitgevoerd om een aanzienlijke daling van het O2-niveau in de couveuse te voorkomen.
  4. Vervang de media in de aan hyperoxie blootgestelde celkweekinserts volgens hetzelfde schema als de controleputjes (21% O2 blootgesteld). Controleer de celcultuurinzetstukken elke dag op medialekkage en zuig eventuele lekkage voorzichtig op in de celkweekkamer.
  5. Ga door met blootstelling aan hyperoxie gedurende 7 dagen (ALI dagen 7 tot 14). Zodra de blootstelling aan hyperoxie is voltooid, oogst u cellen of voert u tests uit met behulp van celkweekinzetstukken op ALI dag 14.

6. Oxidatieve stresstest om de effecten van hyperoxie te beoordelen

OPMERKING: We gebruikten de CM-H2DCFDA-testkit en maten de fluorescentie-intensiteit op ALI dag 14 als een marker van oxidatieve stress in celkweekinserts na blootstelling aan O2 . H2DCFDA is een chemisch gereduceerde en geacetyleerde vorm van 2′,7′-dichloorfluoresceïne (DCF), een levende celpermese indicator van reactieve zuurstofspecies (ROS). CM-H2DCFDA is het thiol-reactieve chloormethylderivaat van H2DCFDA, dat verdere covalente binding aan intracellulaire componenten bevordert, waardoor de kleurstof langer in de cel kan worden vastgehouden. Deze moleculen zijn niet-fluorescerend totdat de acetaatgroepen worden verwijderd door de werking van intracellulaire esterasen en oxidatie plaatsvindt in de cel51. Na intracellulaire oxidatie kan de resulterende toename van de fluorescentie worden gemeten met een fluorescentiemicroscoop als een surrogaatmaat voor cellulaire oxidatieve stress52. Het reagens is licht en luchtgevoelig en moet daarom zo goed mogelijk tegen licht worden beschermd en luchtdicht worden gehouden.

  1. Bereiding van de CM-H2DCFDA-analyseoplossing: Elke injectieflacon bevat 50 μg reagenskleurstof in poedervorm. Om een stockoplossing van 1 mM te maken, voegt u 80 μL steriele DMSO toe aan de injectieflacon, mengt u goed met een pipet en draait u voorzichtig. Voeg voor de eindconcentratie van 1 μM van de kleurstof in celkweekinserts 0,1 μL van de 1 mM bouillon per 100 μL PBS toe (bijv. voeg 0,6 μL stockoplossing toe aan 600 μL PBS voor 6 celkweekinserts).
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de kleurstof kan variëren tussen 1-5 μM. De dosis moet worden geoptimaliseerd voor elke kweektoestand.
  2. Voeg 100 μL van de 1 μM kleurstofoplossing toe in elke celcultuur voor zowel de aan hyperoxie blootgestelde als aan normoxie blootgestelde groep. Gebruik ten minste 1 celcultuur als negatieve controle van elke behandelingsgroep (100 μL PBS zonder kleurstof). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, beschermd tegen licht. 1x wassen met PBS.
  3. Voorbereiding van de dia: Giet het overtollige PBS af. Houd de celkweekinzetstukken voorzichtig vast en gebruik een mes om het celkweekmembraan langzaam uit te snijden. Giet 1-2 druppels mountantvloeistof op de dia. Houd met een tang met een platte punt voorzichtig de hoek van het membraan vast, plaats deze met de celzijde naar beneden op het dekmiddel en bedek deze met een dekglaasje. Verwijder overtollig intonneervocht en laat 15 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. De dia's zijn nu klaar om te worden afgebeeld.
    OPMERKING: De voorbereiding van het objectglaasje en de fluorescentiemicroscopie moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd, aangezien de fluorescerende intensiteit gedurende 2-3 uur aanzienlijk afneemt.
  4. Fluorescerende microscopie: Leg beelden vast met een fluorescerende microscoop met behulp van het Cy2-kanaal (cyanine-2). Leg beelden vast van drie afzonderlijke, niet-overlappende gebieden per celcultuur.
  5. Fluorescerende detectie van oxidatieve stress
    OPMERKING: Gebruik de afbeeldingen van fluorescentiemicroscopie om gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) te meten met behulp van de ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/) en de hieronder beschreven workflow. CTCF dient als een marker voor oxidatieve stress in de celkweekinserts na blootstelling aan hyperoxie en wordt gemeten door de achtergrondfluorescentie te elimineren met behulp van ImageJ-software.
    1. Open de microscopieafbeelding in ImageJ en selecteer het interessegebied met behulp van de rechthoek. Sla het selectiegebied (α) op door met de rechtermuisknop te klikken en selecteer Toevoegen aan ROI-manager (interesseregio). Gebruik dit selectiegebied voor verschillende afbeeldingen.
    2. Selecteer de parameters voor meting onder Metingen analyseren > instellen en selecteer Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde op het tabblad Instellingen.
    3. Gebruik voor elke afbeelding hetzelfde selectiegebied uit de ROI-manager en selecteer Analyseren > meten. De geïntegreerde dichtheidswaarde vertegenwoordigt de totale fluorescentie (Ft) van het geselecteerde gebied. Noteer de meetwaarden in het pop-upvenster.
    4. Als u de achtergrondfluorescentie (Fb) in elke afbeelding wilt corrigeren, selecteert u een klein gebied met een niet-fluorescerend gebied met de rechthoek. Selecteer > meting analyseren voor deze regio. De gemiddelde intensiteitswaarde vertegenwoordigt Fb. Noteer de meetwaarden in het pop-upvenster.
    5. Bereken de CTCF door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van achtergrondmetingen te vermenigvuldigen met de totale oppervlakte van de ROI en dit getal af te trekken van de geïntegreerde dichtheidswaarde van de ROI. Herhaal deze workflow voor alle beelden voor beide behandelingsgroepen (controle en hyperoxie).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Gecorrigeerde totale celfluorescentie (A.U.)
      Ft = Totale fluorescentie
      Fb = Achtergrond fluorescentie
      α = Selectiegebied

Resultaten

Om nTAEC's te isoleren, verzamelden we tracheale aspiraten van geïntubeerde pasgeborenen in de NICU en transporteerden we de aspiraten op ijs naar het lab voor verdere verwerking (Figuur 1A). Na het zaaien van de tracheale aspiratiemonsters in een epitheel groeimedium van de luchtwegen (BLEAM-I met Rho/Smad-, GSK3- en mTOR-remmers), verschenen kubusvormige cellen binnen 7-10 dagen. Tegen 14 dagen waren de cellen voor 50%-60% samenvloeiend, en ongeveer 21 dagen na het uitplateren waren de cellen dicht opeengepakt en moesten ze worden gepasseerd en geëxploiteerd voor daaropvolgende passatie en expansie. Seriële passages van deze cellen (tot P3) werden gecryopreserveerd in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. De cellen (≤ passage 3) werden vervolgens ontdooid voor ALI-cultuur.

nTAEC's werden gekweekt in ALI zodra ze ongeveer 80%-90% confluentie bereikten in een T75-plaat onder water. We voerden immunofluorescentiekleuring uit van de nTAEC-monolaag op ALI dag 0 met de basale celspecifieke markers - cytokeratine-5 (KRT5)53 en tumoreiwit p63 (TP63)54 (Figuur 1B). Op ALI dag 0 zijn bijna alle cellen KRT5- en TP63-positief, wat wijst op een fenotype van basaalcellen in de luchtwegen met minimale differentiatie. Nadat ALI was vastgesteld, werd TEER gemeten met behulp van EVOM (Figuur 1C) en nam snel toe in de vroege fase van ALI-cultuur (ALI dag 0 tot 7) toen nTAEC's een volwassen gepolariseerde celmonolaag begonnen te vormen, met daaropvolgende plateauing van TEER tussen ALI dag 7 en dag 28 (Figuur 1D). Verder werd FITC-dextran met twee molecuulgewichten (10 kD en 20 kD) gebruikt om de paracellulaire permeabiliteit tijdens ALI-differentiatie te beoordelen en vertoonde het een algehele geleidelijke afname van de fluorescentie in de loop van de tijd (Figuur 1E). Dit correleert met de vorming van een volwassen cel-monolaag tijdens ALI-differentiatie met afnemende permeabiliteit voor opgeloste stoffen. 

Tijdens ALI-cultuur differentiëren basale cellen in volwassen epitheellijnen, waaronder trilhaarcellen, niet-slijmafscheidende clubcellen en slijmafscheidende slijmbekercellen39. Genexpressieanalyse van rijpe epitheelcelspecifieke markers op ALI dag 0 toonde minimale tot geen expressie van forkhead box-eiwit J155 (FOXJ1, ciliated cell marker), uteroglobine56 (SCGB1A1, clubcelmarker) en mucine-5AC57 (MUC5AC, bekercelmarker; Figuur 2A), met daaropvolgende toename (ALI dag 7 en 28) wat differentiatie suggereert in deze volwassen luchtwegepitheliale subtypes tijdens ALI-cultuur. Daarnaast voerden we immunofluorescerende kleuring uit op ALI dag 28 met behulp van rijpe epitheelcelspecifieke markers en gekwantificeerde epitheeldifferentiatie bestaande uit geacetyleerde tubuline58 (TUBA4A) positieve trilhaarcellen (~22%), SCGB1A1 positieve clubcellen (~13%) en MUC5AC-positieve bekercellen (~3%), terwijl de rest KRT5-positieve basale cellen (~51%) en andere zeldzame celtypen zijn (Figuur 2B).

Rho- en Smad-remmers werden gebruikt tijdens de eerste 7 dagen van de ALI-cultuur (ALI-dagen 0 tot 7) en vervolgens verwijderd uit de differentiatiemedia voor de rest van de ALI-kweekduur (Figuur 3A). Het apicale oppervlak van de celmonolaag wordt tijdens ALI-cultuur blootgesteld aan lucht, waardoor atmosferische verstoringsstudies mogelijk zijn. Hyperoxieblootstelling van de celmonolaag werd uitgevoerd met 60% O2 continu gedurende 7 dagen van ALI dag 7 tot 14 met behulp van de TriGas Incubator. De controlegroep werd in een aparte incubator met blootstelling aan kamerlucht (21%Ø2) gehouden. Gezien de toekomstige intentie om de langdurige gevolgen (1-2 weken na voltooiing van de blootstelling aan O2) van blootstelling aan O2 op de ontwikkeling en regeneratie van luchtwegepitheel te bestuderen, was het van essentieel belang dat de blootstelling aan O2 niet acuut leidde tot ernstige cytotoxiciteit of membraanbeschadiging in die mate dat het de ALI-celmonolaag aanzienlijk verstoort. Om schade aan het celmembraan te beoordelen, hebben we de LDH-afgifte in de basolaterale media op ALI dag 14 gemeten, die geen significant verschil liet zien tussen hyperoxie en met kamerlucht behandelde culturen (Figuur 3B). Om verder te beoordelen of cytotoxische effecten van O2 significant genoeg waren om apoptose in nTAEC's te induceren, voerden we immunoblot uit voor totaal caspase-3 en gesplitste caspase-359 op cellysaten geoogst uit hyperoxie en aan kamerlucht blootgestelde groepen op ALI dag 14 (Figuur 3C). De totale expressie van caspase-3 was vergelijkbaar tussen de twee groepen en gespleten caspase-3-expressie werd niet gedetecteerd, wat suggereert dat 7 dagen van 60% O2-blootstelling geen apoptose induceerde in nTAEC's op ALI dag 14. Daarnaast werd een positieve controle ontworpen met nachtelijke incubatie van nTAEC's onder ondergedompelde omstandigheden met toenemende concentraties staurosporine (0,5 μM, 1 μM en 2 μM), een cytotoxisch middel en een apoptose-inductor. Immunoblotting voor totale caspase-3 en gespleten caspase-3-expressie bevestigde succesvolle inductie van apoptose. Om oxidatieve stress geïnduceerd door 60% O2-blootstelling te meten, werd een cellulaire oxidatieve stresstest met fluorescerende intensiteitsmeting uitgevoerd op de nTAEC-celmonolagen op ALI 14 (Figuur 3D). Blootstelling aan hyperoxie veroorzaakte een significante toename van de fluorescerende intensiteit (berekend aan de hand van gecorrigeerde totale celfluorescentie of CTCF) in vergelijking met cellen die aan kamerlucht waren blootgesteld, wat wijst op verhoogde cellulaire oxidatieve stress. Genexpressieanalyse van antioxidantgenen toonde aan dat 60% O2 opregulatie van deze antioxidantgenen veroorzaakte op ALI dag 14, waarbij catalase, SOD1, SOD2 en GPX3 significant werden opgereguleerd (Figuur 3E).

figure-results-1
Figuur 1: Neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC's) worden met succes geïsoleerd uit neonatale tracheale aspiraten en gekweekt in een lucht-vloeistofinterface (ALI). (A) nTAEC's geïsoleerd met behulp van tracheale aspiratie van geïntubeerde pasgeborenen werden onder water gepasseerd met daaropvolgende ALI-cultuur. (B) Cellen werden geoogst op ALI dag 0 voor immunofluorescerende kleuring met basale celmarkers in de luchtwegen - KRT5 (rood) en TP63 (rood). Kernen zijn blauw gekleurd met DAPI. Schaalbalk = 50 μm. (C) Meting van trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) in celkweekinserts met behulp van een epitheliale volt/ohm-meter (EVOM). (D) TEER werd gemeten tijdens ALI-differentiatie. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde (n=2 donoren, 5-10 putjes per donor per tijdstip). Foutbalken geven SEM aan. (E) Fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran (FITC-dextran) trans-epitheliale permeabiliteitstest werd uitgevoerd tijdens ALI-differentiatie met behulp van twee verschillende molecuulgewichten van FITC-dextran (10 kD en 20 kD). FITC-dextranoplossing (10 kD of 20 kD) werd toegevoegd aan de apicale kamer en de celkweekinserts werden gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Fluorescentie in de basolaterale kamermedia werd spectrofotometrisch gemeten in platen met 96 putjes. Achtergrondfluorescentie (HBTEC-media) werd afgetrokken van de testmetingen om een gecorrigeerde fluorescentiewaarde te verkrijgen (uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de waarden van dag 0). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde (n=2 donoren, drie putjes per donor per tijdstip voor elk molecuulgewicht FITC-dextran). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC's) ondergaan mucociliaire differentiatie tijdens lucht-vloeistofinterface (ALI)-kweek. (A) Cellen werden geoogst op ALI-dag 0, 7 en 28 voor qPCR-analyse van epitheelcelspecifieke markers: cytokeratine-5 (KRT5) voor basaal, forkhead box-eiwit J1 (FOXJ1) voor trilhaar, uteroglobine (SCGB1A1) voor club en mucine-5AC (MUC5AC) voor slijmbekercellen. De relatieve expressie van elk gen werd bepaald met behulp van de δCt-methode met GAPDH als endogene controle. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde (van n = 3 donoren, drie putjes per donor per tijdstip). Foutbalken geven SEM aan. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van tweerichtings-ANOVA met Tukey post-hocanalyse, *p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001. (B) Immunofluorescerende kleuring van basale (KRT5, rood), trilhaarcellen (geacetyleerde tubuline of TUBA4A, groen), knots (SCGB1A1, rood) en beker (MUC5AC, groen) werd uitgevoerd op ALI dag 28 om epitheliale differentiatie te kwantificeren. Kernen zijn blauw gekleurd met DAPI. Gegevens voor percentage (%) positieve cellen gepresenteerd als gemiddelde (n=2 donoren, twee celkweekinserts per donor, 6-8 niet-overlappende afbeeldingen per objectglaasje, minimaal 3000 cellen geteld per objectglaasje). Foutbalken geven SEM aan. Schaalbalk = 50 μm.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Hyperoxie induceert cellulaire oxidatieve stress in neonatale tracheale luchtwegepitheelcellen (nTAEC's), maar veroorzaakt geen significante celmembraanbeschadiging of apoptose. (A) Experimentele tijdlijn voor blootstelling aan hyperoxie van nTAEC's met behulp van de Trigas-incubator. De blootstelling aan zuurstof werd gestart nadat de remmers op ALI dag 7 uit de differentiatiemedia waren verwijderd en werd gedurende 7 dagen voortgezet (ALI dag 7 tot 14). (B) Basolaterale media werden geoogst voor een LDH-afgiftetest om celmembraanschade tussen kamerlucht (controle) en 60% O2 (hyperoxie) blootgestelde groep op ALI dag 14 te beoordelen. Gegevens gepresenteerd als individuele gegevenspunten (gecorrigeerde absorptie) met lijnen die het eindgemiddelde voor elke groep aangeven, n=3 donoren aangeduid met respectievelijk zwarte cirkels, vierkanten en driehoeken met vier putjes per donor. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-toets, p=0,6184. (C) Cellen werden geoogst op ALI dag 14 en immunoblotting voor markers van apoptose (caspase-3 en gesplitste caspase-3) werd uitgevoerd om de respons tussen kamerlucht en aan O2 blootgestelde nTAEC's te vergelijken. Positieve controle voor de test werd ontworpen door nTAEC's 's nachts te incuberen met staurosporine (Stau 0,5 μM, 1 μM en 2 μM) of mediumcontrole (Veh Ctrl) in een ondergedompelde kweektoestand. Cellen werden geoogst voor immunoblot met totaal caspase-3 en gesplitst caspase-3-antilichaam. Densitometrie werd uitgevoerd met α-tubuline als huishoudgen. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde (van n=2-3 donoren, één tot twee putjes per donor). Foutbalken geven SEM aan. Een ongepaarde t-test werd gebruikt om de totale caspase-3-expressie tussen kamerlucht en de 60% O2-groep te vergelijken, p = 0,4. Eenrichtings-ANOVA werd gebruikt om de totale caspase-3 en gespleten caspase-3-expressie te vergelijken tussen de blootgestelde groepen Veh Ctrl en Stau, *p<0,05, ***p<0,0005. (D) CM-H2DCFDA-test voor cellulaire oxidatieve stress werd uitgevoerd op ALI dag 14 met celkweekinserts geoogst uit kamerlucht en aan O2 blootgestelde nTAEC's. Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van kamerlucht (controle) en 60% O2 (hyperoxie) blootgestelde celkweekinserts worden getoond. Gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) werd berekend om cellulaire oxidatieve stress tussen kamerlucht en 60% O2-blootgestelde nTAEC's te vergelijken. CTCF-gegevens gepresenteerd als individuele datapunten met een lijn die het eindgemiddelde voor elke groep aangeeft, 6-7 afbeeldingen/groep van 2 individuele donoren (zwarte cirkels en vierkanten) met twee putjes per donor. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-toets, *p<0,05. Schaalbalk = 50 μm. (E) Cellen werden op ALI dag 14 geoogst uit kamerlucht en aan hyperoxie blootgestelde putjes voor qPCR-analyse van oxidatieve stressgenen, waaronder catalase, superoxide dismutase 1 & 2 (SOD1 & SOD2), glutathionperoxidase 1, 2 en 3 (GPX1, GPX2 en GPX3) werd uitgevoerd. Vouwveranderingsgegevens van elk gen werden bepaald met behulp van de δCt-methode met 18s rRNA als endogene controle. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde (van n=3 donoren, twee putjes per donor). Foutbalken geven SEM aan. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-test, *p<0,05, **p=0,006.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MediacomponentAantalUiteindelijke concentratie
BLEAM-I
BLEAM media500 ml
HLL aanvulling1,25 ml500 μg/ml humaan serumalbumine
0,6 μM linolzuur; 0,6 μg/ml lecithine
L-glutamine15 ml6 miljoen
P extraheren2 ml0,4% extract van de runderhypofyse
TM15 ml1 μM Epinefrine; 5 μg/ml Transferrine
10 nM trijoodthyronine; 0,1 μg/ml hydrocortison
5ng/ml epidermale groeifactor (EGF)
5 ng/ml insuline
Normocin1 ml0,1 mg/ml
Y-27632Kan variëren op basis van lotnummer5 μM
A83-01Kan variëren op basis van lotnummer1 μM
CHIR 99021Kan variëren op basis van lotnummer0,4 μM
RapamycineKan variëren op basis van lotnummer5 nM
HBTEC
HBTEC-media500 ml
Normocin1 ml0,1 mg/ml
HBTEC-I
HBTEC-media500 ml
Normocin1 ml0,1 mg/ml
Y-27632Kan variëren op basis van lotnummer5 μM
A83-01Kan variëren op basis van lotnummer0,5 μM

Tabel 1: Mediacomponenten voor bronchiaal epitheliaal luchtwegmedium met remmers (BLEAM-I), Humaan bronchiaal/tracheaal epitheelcel ALI media met remmers (HBTEC-I) en HBTEC.

Celcultuurkolf/Celcultuur inserts804G celgeconditioneerde media (ml)
T25 kolf3 ml
T75 kolf5 ml
Celkweekinzetstuk met 24 putjes (0,4 μm poriegrootte, 0,33cm2 oppervlak)400 μL

Tabel 2: Volumes van 804G-cel-afgeleide matrixgeconditioneerde media die nodig zijn voor kweekkolven en celkweekinserts.

Discussie

Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor het verzamelen en verwerken van neonatale tracheale aspiraatmonsters van geïntubeerde pasgeborenen in de NICU, met daaropvolgende isolatie en uitbreiding van levende nTAEC's uit deze monsters met behulp van eerder vastgestelde methoden39. Verder hebben we een methode beschreven voor het kweken van nTAEC's op ALI en het karakteriseren van hun differentiatie tot een gepolariseerd mucociliair luchtwegepitheel als functie van de tijd via meting van TEER, FITC-dextran-assay, immunofluorescerende kleuring en qPCR-analyse van celtype (d.w.z. basaal, trilhaar, knots en beker) specifieke markers. Het nieuwe aspect van dit protocol is de atmosferische redoxverstoring die wordt uitgevoerd door matige blootstelling aan hyperoxie (60% O2) op zich ontwikkelende nTAEC-monolagen. We hebben aangetoond dat 60% O2 blootstelling gedurende 7 dagen cellulaire oxidatieve stress induceert in nTAEC's. We tonen verder aan dat de O 2-blootstellingsstrategie niet acuut significante cellulaire apoptose of celmembraanbeschadiging induceert, waardoor deze nTAEC's in ALI-cultuur kunnen worden gehandhaafd na de voltooiing van de O2-blootstelling . Het model kan dus mogelijk worden gebruikt om zowel korte- als langetermijneffecten van blootstelling aan O2 op de programmering van neonatale luchtwegepitheliale te bestuderen.

Het kweken van nTAEC's in ALI biedt bepaalde voordelen ten opzichte van conventionele ondergedompelde cultuur, omdat het de vorming van een gepolariseerde luchtwegepitheelmonolaag met tight junction-vorming en mucociliaire differentiatie bevordert60,61. Eerdere studies met nTAEC's hebben aangetoond dat in de vroege fase van ALI-cultuur (ALI dag 0 tot 7) de cellen pseudo-stratificatie ondergaan (die verschijnen als meerlagig in tegenstelling tot een enkele cellaag) en uiteindelijk tegen het einde van de tweede week een volwassen pseudogestratificeerd epitheel vormen42,62. De vorming van tight junctions volgt een soortgelijk traject in de vroege fase van de ALI-cultuur, vergezeld van een snelle toename van TEER met een later plateau van63, aangetoond in het model met nTAEC's. Verder verbeteren luchtwegepitheelcellen gekweekt in ALI de expressie en apico-laterale lokalisatie van claudine-1 (een onderdeel van het tight junction-complex), wat de afdichtingseigenschappen van tight junctions tijdens ALI-cultuur verbetert, waardoor de vorming van een volwassen celmonolaag wordt bevorderd63. Dit correleert met verminderde paracellulaire permeabiliteit, die in het model werd getest met de FITC-dextran-assay en een over het algemeen afnemende trend in monolaagpermeabiliteit aantoonde. We hebben het mucociliaire differentiatiepatroon in nTAEC's met immunokleuring voor ciliated (TUBA4A), club (SCGB1A1) en goblet (MUC5AC) celspecifieke markers op ALI dag 28 afgebakend. Daarnaast voerden we genexpressie uit van trilhaarcellen (FOXJ1), club (SCGB1A1) en bekers (MUC5AC) celspecifieke markers tijdens het ALI-tijdsverloop. Andere groepen hebben aangetoond dat de transcriptiefactor FOXJ1 essentieel is voor het ontstaan van beweeglijke ciliogenese, terwijl TUBA4A aanwezig is in zowel primaire als beweeglijke trilharen 64,65. In dit model correleert het genexpressiepatroon voor FOXJ1 tijdens ALI-differentiatie van nTAEC's ruwweg met de tijd van verschijnen van beweeglijke trilharen in de epitheelcultuur van de luchtwegen uit eerdere studies64,66.

Een recente studie van Teape et al. beoordeelde de proteomische en metabolomische effecten van blootstelling aan hyperoxie op de ALI-cultuur67. De cellen waren echter afkomstig van volwassen donoren. Eerdere studies over het respiratoir syncytieel virus (RSV)62,68,69,70 en de recente COVID-19-pandemie71 hebben het belang benadrukt van leeftijdsgerelateerde verschillen in luchtwegepitheelrespons en -functie. Zhao et al. gebruikten vergelijkbare workflows om neonatale en volwassen luchtwegepitheelcellen te isoleren en toonden aan dat er na 21 dagen ALI-differentiatie geen significante verschillen waren in de cellulaire samenstelling tussen neonatale en volwassen luchtwegepitheelcellen62. Er waren echter duidelijke verschillen in hun reactie op RSV-infectie, waarbij neonatale cellen meer RSV-geïnfecteerde cellen en epitheelschade vertoonden in vergelijking met volwassenen. Over het algemeen produceerden de kweekomstandigheden die door Zhao et al. produceerden een robuustere differentiatie in nTAEC's in vergelijking met de onze, met een hoger aantal trilhaarcellen (41% versus 22%) en slijmbekers (10% versus 3%) cellen. Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van verschillende groeimedia. Het is aangetoond dat het PneumaCult-ALI-medium dat door hun groep wordt gebruikt (in tegenstelling tot het HBTEC-ALI-medium) een robuustere differentiatie induceert met hogere aantallen trilhaarcellen en slijmbekercellen72. In dit model vertoonde genexpressie van celtype-specifieke markers voor trilhaar-, knots- en slijmbekercellen een aanvankelijke snelle toename (ALI dag 0 tot 7) met latere afname rond ALI dag 28. Een mogelijke reden zou kunnen zijn dat de differentiatie na ALI dag 14 stagneert, wat is aangetoond in eerdere studies met nTAEC's42.

We hebben het gebruik van matige blootstelling aan hyperoxie (60% O2) gedurende 7 dagen beschreven, waarvan we denken dat het de ervaringen uit het echte leven van premature neonaten in de NICU beter simuleert in vergelijking met het gebruik van zeer hoge O2-niveaus (> 80% O2)67 waarbij het risico op acute O2-toxiciteit verhoogd is1, 5. okt. Inderdaad, 95% O2-blootstelling van pasgeboren longweefsel bleek cellulaire apoptose te induceren door caspase-activering73. Deze blootstellingsstrategie is echter slechts relevant bij een klein percentage van de baby's in de NICU die, als gevolg van de door O2 geïnduceerde acute longschade, ernstige BPS ontwikkelen met chronische bronchiale pathologieën (model voor acute longbeschadiging)37. In het moderne tijdperk van verstandig gebruik van O2-therapie worden de meeste premature baby's niet blootgesteld aan zo'n hoge O2; Ze lopen echter nog steeds risico op het ontwikkelen van toekomstige luchtwegaandoeningen (ontwikkelingsverstoringsmodel). In deze laatste groep kan het letsel door redoxverstoring in het vroege leven aanvankelijk stil zijn, maar zich later manifesteren tijdens de peuterleeftijd of ouder in de vorm van chronische luchtwegaandoeningen37. Onze gegevens met behulp van cellulaire oxidatieve stresstest toonden aan dat matige blootstelling aan hyperoxie (60% O2) de oxidatieve stress in de nTAEC-celmonolaag significant verhoogde. Analyse van LDH-afgifte en cellulaire caspase-3-activering suggereerde dat onze blootstellingsstrategie aan hyperoxie geen significante celdood veroorzaakte. De methoden en het modelsysteem die we beschrijven kunnen mogelijk worden gebruikt om O2-gevoelige moleculaire mechanismen vroeg in het leven bloot te leggen als een link naar de latere ontwikkeling van longziekte bij voormalige premature baby's.

Tijdens het foetale leven worden luchtwegepitheelcellen ondergedompeld in longvloeistof en bevinden ze zich in de relatief hypoxische intra-uteriene omgeving26. Neonatale luchtwegepitheelcellen ondergaan een snelle omzet en differentiatie en vormen een kritische barrière tussen de longen en de buitenwereld. Naarmate pasgeborenen overgaan naar het postnatale leven, worden luchtwegepitheelcellen blootgesteld aan een relatief hyperoxische postnatale omgeving. Deze overgang wordt abrupter gemaakt bij te vroeg geboren en klinisch zieke pasgeborenen, omdat ze ook routinematig therapeutisch O2 nodig hebben als onderdeel van hun zorg40,74, waardoor ze een hoog risico lopen op oxidatieve schade na de geboorte1. Hoewel de effecten van hyperoxie op postnatale longalveolarisatie goed zijn gekarakteriseerd met behulp van diermodellen75, zijn de effecten van blootstelling aan hyperoxie op het ontwikkelen van luchtwegepitheelcellen relatief weinig bestudeerd38. Het gebruik van humane neonatale afgeleide luchtwegepitheelcellen met fysiologisch relevante blootstelling aan hyperoxie tijdens ALI voegt translationele relevantie toe aan ons model. Bovendien simuleert het gebruik van blootstelling aan hyperoxie tijdens de vroege middenfase van actieve differentiatie en celmonolaagvorming in plaats van volledig gedifferentieerd rijp luchtwegepitheel67 mogelijk het klinische scenario bij extreem premature pasgeborenen (< 28 weken zwangerschap) die worden geboren tijdens de vroege stadia (canaliculaire tot saccularische) van longontwikkeling in plaats van het alveolaire stadium7.

Ons model heeft beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij de toepassing ervan op menselijke ontwikkeling en ziekte. We hebben gebruik gemaakt van voorwaardelijke herprogrammering van primaire neonatale luchtwegepitheelcellen die eerder zijn gepubliceerd in een ALI-model van nTAEC's39. Het gebruik van groeifactorremmers (Rho/Smad/GSK3/mTOR) maakt het mogelijk om deze cellen sneller en later te passeren. We hebben geprobeerd nTAEC's te kweken in zowel ondergedompelde als ALI-omstandigheden zonder remmers in het groeimedium; de expansie en passage van deze cellen waren echter significant langzamer en de celmonolaag in ALI werd tegen het einde van de tweede week lek (gegevens niet getoond). Een andere groep die dezelfde remmers gebruikte voor het kweken van primaire neonatale luchtwegepitheelcellen42 voerde eencellige RNA-sequencing uit om aan te tonen dat de aanwezigheid van deze remmers geen significante differentiële expressie veroorzaakte van genen die betrokken zijn bij oxidatieve stress, epitheel-mesenchymale overgang of cellulaire veroudering. Desalniettemin hebben we deze beperking in ons model in overweging genomen en besloten we blootstelling aan hyperoxie uit te voeren nadat Rho- en Smad-remmers uit de differentiatiemedia waren verwijderd. Voor deze studie hebben we alleen matige hyperoxie (60% O2) effecten op nTAEC's getest. Toekomstige studies zijn echter van plan om gebruik te maken van graduele blootstelling aan hyperoxie (40%, 60% en 95% O2) en de responsen in nTAEC's te vergelijken. Hoewel het hier beschreven model translationeel aantrekkelijk is gezien het gebruik van cellen van menselijke pasgeborenen die in de NICU zijn toegelaten, is dit een in vitro celcultuurmodel, en daarom zouden significante bevindingen waarbij dit model wordt gebruikt, bevestiging rechtvaardigen met een complementair in vivo diermodel.

Tot slot hebben we de stapsgewijze methode beschreven voor het opzetten van een in vitro 3D ALI-kweekmodel met behulp van neonatale luchtwegepitheelcellen geïsoleerd uit tracheale aspiraten van geïntubeerde pasgeborenen in de NICU. We hebben dit model gebruikt om de effecten te onderzoeken van matige blootstelling aan hyperoxie, een veel voorkomende belediging voor het milieu bij premature pasgeborenen in de NICU. Blootstelling aan hyperoxie veroorzaakte cellulaire oxidatieve stress in de celmonolaag zonder significante celmembraanbeschadiging of celdood te veroorzaken, waardoor de ALI-cultuur kon worden voortgezet om de langdurige effecten van blootstelling aan O2 op de ontwikkeling en functie van het neonatale luchtwegepitheel te bestuderen. Toekomstige toepassingen met behulp van deze methoden kunnen mogelijk vroege ziektemechanismen blootleggen die betrokken zijn bij door hyperoxie geïnduceerde langetermijnontwikkeling van longziekten die vaak worden gezien bij voormalige premature baby's.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Presbyterian Health Foundation (PHF) en Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 met een Institutional Development Award (IDeA) van NIGMS) aan AG. We willen graag Dr. Paul LeRou en Dr. Xingbin Ai van het Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, bedanken voor het verstrekken van neonatale donorcellen die in sommige van de experimenten zijn gebruikt. Figuren zijn gemaakt met Biorender. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Buffered FormalinFisher Scientific23-426796
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5mmCorning3470
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonalSigmaT7451
Anti-alpha Tubulin antibodyAbcamab7291
Anti-Cytokeratin 5 antibodyAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cleaved caspase-3 antibodyCell signaling9664T
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal AntibodyBioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)Thermo ScientificC6827
Corning Cell Culture Treated T25 FlasksCorning430639
Corning U-Shaped Cell Culture T75 FlasksCorning430641U
CyQUANT LDH Cytotoxicity AssayThermo ScientificC20300
DAPI Solution (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Distilled waterGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10082147
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation MediumLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific51030411
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Scientific4368814
HLL supplementLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - Antimicrobial ReagentFisher ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normal Goat SerumGibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Assays: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Assays: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression Assays: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression Assays: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression Assays: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression Assays: KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
Taqman Gene Exression Assays: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Combined SupplementLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Total caspase-3 antibodyCell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol redGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

Referenties

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D celkweekblootstelling aan hyperoxieneonatale luchtwegcellenlucht vloeistofinterfaceoxidatieve stressassayisolatie van tracheaal aspiraatmucociliaire differentiatiepolarisatie van celmonolaagneonatale longziekte

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.