Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65923

⸱

21 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we verschillende protocollen die gericht zijn op een geïntegreerde valorisatie van Gracilaria gracilis: het oogsten van wilde soorten, in-house groei en extractie van bioactieve ingrediënten. De antioxiderende, antimicrobiële en cytotoxische effecten van de extracten worden geëvalueerd, samen met de voedings- en stabiliteitsbeoordeling van voedsel verrijkt met hele zeewierbiomassa en pigmenten.

Samenvatting

De belangstelling voor zeewier als overvloedige grondstof om waardevolle en multitarget bioactieve ingrediënten te verkrijgen, groeit voortdurend. In dit werk onderzoeken we het potentieel van Gracilaria gracilis, een eetbaar rood zeewier dat wereldwijd wordt gekweekt vanwege zijn commerciële belang als bron van agar en andere ingrediënten voor cosmetische, farmacologische, voedsel- en diervoedertoepassingen.

De groeiomstandigheden van G. gracilis werden geoptimaliseerd door vegetatieve vermeerdering en sporulatie, terwijl de fysisch-chemische omstandigheden werden gemanipuleerd om een grote biomassavoorraad te verkrijgen. Groene extractiemethoden met ethanol en water werden uitgevoerd over de zeewierbiomassa. Het bioactieve potentieel van extracten werd beoordeeld door middel van een reeks in vitro testen met betrekking tot hun cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen. Bovendien werd gedroogde zeewierbiomassa verwerkt in pastaformuleringen om de voedingswaarde van voedsel te verhogen. Pigmenten geëxtraheerd uit G. gracilis zijn ook in yoghurt verwerkt als een natuurlijke kleurstof en hun stabiliteit werd geëvalueerd. Beide producten werden onderworpen aan de beoordeling van een semi-getraind sensorisch panel met als doel de beste uiteindelijke formulering te bereiken voordat ze op de markt komen.

De resultaten ondersteunen de veelzijdigheid van G. gracilis , of het nu wordt toegepast als een hele biomassa, extracten en/of pigmenten. Door verschillende geoptimaliseerde protocollen te implementeren, maakt dit werk de ontwikkeling mogelijk van producten met het potentieel om de voedsel-, cosmetica- en aquacultuurmarkten te laten profiteren, ecologische duurzaamheid en een blauwe circulaire economie te bevorderen.

Bovendien, en in overeenstemming met een bioraffinagebenadering, zal de resterende biomassa van zeewier worden gebruikt als biostimulant voor plantengroei of worden omgezet in koolstofmaterialen voor gebruik in waterzuivering van de interne aquacultuursystemen van MARE-Polytechnic van Leiria, Portugal.

Inleiding

Zeewier kan worden beschouwd als een interessante natuurlijke grondstof die kan worden gebruikt door de farmaceutische, voedings-, diervoeder- en milieusector. Ze biosynthetiseren een arsenaal aan moleculen, waarvan er vele niet worden aangetroffen in terrestrische organismen, met relevante biologische eigenschappen 1,2. Er moeten echter voor zeewier geoptimaliseerde teeltprotocollen worden geïmplementeerd om een grote biomassavoorraad te garanderen.

Bij de teeltmethoden moet altijd rekening worden gehouden met de aard van de zeewierthalli en de algehele morfologie. Gracilaria gracilis is een klonaal taxon, wat betekent dat het aanhechtingsorgaan meerdere vegetatieve assen produceert. Voortplanting door fragmentatie (vegetatieve voortplanting) wordt dus bereikt, aangezien elk van deze assen volledig in staat is om een onafhankelijk leven aan te nemen van het hoofdthallus3. Klonale taxa kunnen met succes worden geïntegreerd met eenvoudige en snelle kweekmethoden in één stap, aangezien grote hoeveelheden biomassa worden verkregen door het thallus te splitsen in kleine fragmenten die snel regenereren en uitgroeien tot nieuwe, genetisch identieke individuen. Zowel haplontische als diplontische thalli kunnen in dit proces worden gebruikt. Hoewel het geslacht een complexe haplo-diplontische isomorfe trifasische levenscyclus vertoont, is sporulatie zelden nodig, behalve wanneer genetische vernieuwing van de bestanden nodig is om verbeterde gewassen te verkrijgen. In dit geval geven zowel tetrasporen (haplontische sporen gevormd door meiose) als carpospores (diplontische sporen gevormd door mitose) aanleiding tot macroscopische thalli die vervolgens kunnen worden gekweekt en vermeerderd door vegetatieve voortplanting4. Groeicycli worden bepaald door omgevingsomstandigheden en de fysiologische toestand van de individuen, naast andere biologische factoren zoals het ontstaan van epifyten en de hechting van andere organismen. Daarom is het optimaliseren van de groeiomstandigheden cruciaal om een hoge productiviteit te garanderen en biomassa van goede kwaliteit te produceren5.

De extractie van bioactieve stoffen uit zeewier, waaronder G. gracilis, kan op verschillende manieren worden bereikt 6,7. De keuze van de extractiemethode hangt af van de specifieke verbindingen die van belang zijn, de beoogde toepassing en de kenmerken van het zeewier. In deze studie hebben we ons gericht op oplosmiddelextractie, waarbij groene oplosmiddelen, zoals water of ethanol, worden gebruikt om bioactieve stoffen op te lossen en te extraheren uit de zeewierbiomassa. De extractie kan op een veelzijdige en effectieve manier worden uitgevoerd door middel van maceratie en kan worden gebruikt voor een breed scala aan verbindingen. Het is een eenvoudige en veelgebruikte methode waarbij biomassa gedurende een langere periode in een oplosmiddel wordt geweekt, meestal bij kamertemperatuur of licht verhoogde temperaturen. Het oplosmiddel wordt geroerd om het extractieproces te verbeteren. Na de gewenste extractietijd wordt het oplosmiddel door filtratie of centrifugatie gescheiden van het vaste materiaal.

Water is een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen vanwege de veiligheid, beschikbaarheid en compatibiliteit met een breed scala aan voedingsproducten. Waterextractie is geschikt voor polaire verbindingen zoals polysachariden, peptiden en bepaalde fenolen. Het is echter mogelijk dat het niet-polaire verbindingen niet effectief extraheert. Ethanol is ook een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen en kan effectief zijn voor het extraheren van een verscheidenheid aan bioactieve moleculen, waaronder fenolische verbindingen, flavonoïden en bepaalde pigmenten. Ethanol wordt algemeen erkend als veilig voor gebruik in voedsel en kan gemakkelijk worden verdampt, waarbij de geëxtraheerde verbindingen achterblijven. Het is vermeldenswaard dat bij de keuze van de winningsmethode rekening moet worden gehouden met factoren als efficiëntie, selectiviteit, kosteneffectiviteit en milieu-impact. De optimalisatie van extractieparameters, zoals oplosmiddelconcentratie, extractietijd, temperatuur en druk, is cruciaal voor het bereiken van optimale opbrengsten van bioactieve stoffen uit G. gracilis of andere zeewieren.

Zeewieren blijken antimicrobiële activiteit te vertonen tegen een breed scala aan micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmelsen virussen. Deze activiteit wordt toegeschreven aan bioactieve componenten, waaronder fenolen, polysachariden, peptiden en vetzuren. Verschillende studies hebben hun werkzaamheid aangetoond tegen ziekteverwekkers zoals onderandere Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. en Pseudomonas aeruginosa. De antimicrobiële activiteit van zeewier wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van bioactieve stoffen die kunnen interfereren met microbiële celwanden, membranen, enzymen en signaalroutes10. Deze verbindingen kunnen de microbiële groei verstoren, de vorming van biofilms remmen en immuunresponsen moduleren.

Rode zeewieren, ook wel rhodofyten genoemd, zijn een groep algen die antimicrobiële activiteit kunnen vertonen tegen een verscheidenheid aan micro-organismen. Binnen deze groep bevat G. gracilis verschillende bioactieve stoffen die kunnen bijdragen aan de gerapporteerde antimicrobiële activiteit. Hoewel de specifieke moleculen kunnen variëren, zijn de gemeenschappelijke klassen die zijn gerapporteerd in G. gracilis en mogelijk antimicrobiële eigenschappen bezitten, polysachariden, fenolen, terpenoïden en pigmenten11. Het is echter belangrijk op te merken dat de aanwezigheid en hoeveelheden van deze componenten kunnen variëren, afhankelijk van factoren zoals de locatie van zeewierverzameling, seizoensgebondenheid, fysiologische toestand van de thalli en omgevingsomstandigheden. Daarom kunnen de specifieke klasse en concentratie van antimicrobiële verbindingen in G. gracilis dienovereenkomstig variëren.

G. gracilis blijkt ook antioxiderende eigenschappen te hebben, die verschillende fenolische verbindingen bevatten, waarvan is aangetoond dat ze vrije radicalen opruimen en oxidatieve stress verminderen12.Antioxidanten helpen cellen te beschermen tegen schade veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten en hebben potentiële gezondheidsvoordelen. De antioxiderende capaciteit kan direct worden geëvalueerd door middel van verschillende methoden, waaronder de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vrije radicalenvanger en, indirect, door de kwantificering van het totale polyfenolgehalte (TPC)13.

Hoewel van een ingrediënt wordt gemeld dat het een prominente bioactiviteit heeft, is de cytotoxiciteitsbeoordeling ervan onmisbaar bij het beoordelen van natuurlijke en synthetische stoffen die in contact komen met levende cellen of weefsels. Er zijn verschillende methoden om cytotoxiciteit te meten, elk met voordelen en beperkingen. Over het algemeen bieden ze een scala aan opties om de schadelijke effecten van veel stoffen op cellen te evalueren en tegelijkertijd de mechanismen van celbeschadiging en -dood te onderzoeken14.

In dit werk gebruiken we de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, een colorimetrische methode geïntroduceerd door Mosmann (1983)15. Deze methode meet de reductie van tetrazoliumzouten tot een paars formazanproduct door metabolisch actieve cellen. Hoe hoger de hoeveelheid formazankristallen, hoe hoger het aantal levensvatbare cellen, waardoor een indirecte maat voor cytotoxiciteit wordt geboden14. Aangezien in dit werk G. gracilis water- en ethanolextracten bedoeld zijn om te worden opgenomen in dermocosmetische formuleringen, wordt de in vitro cytotoxiciteitsevaluatie uitgevoerd in een keratinocyt (HaCaT) cellijn.

Wat de voedseltoepassing betreft, bevatten zeewieren over het algemeen weinig calorieën en zijn ze qua voedingswaarde rijk aan voedingsvezels, essentiële elementen en aminozuren, polysachariden, meervoudig onverzadigde vetzuren, polyfenolen en vitamines 2,16. G. gracilis is geen uitzondering, met een interessante voedingswaarde. Freitas et al. (2021)4 ontdekten dat gekweekte G. gracilis hogere niveaus van eiwitten en vitamine C had en het niveau van totale lipiden handhaafde in vergelijking met wild zeewier. Dit kan een economisch en ecologisch voordeel opleveren, aangezien de productie uit voedingsoogpunt de voorkeur verdient boven de exploitatie van wilde hulpbronnen. Bovendien maken consumenten zich steeds meer zorgen over het soort voedsel dat ze eten, dus het is belangrijk om nieuwe ingrediënten voor voedselverrijking te introduceren en nieuwe middelen te gebruiken om extracten te verkrijgen die waarde kunnen toevoegen aan een product en een "clean label" kunnen claimen. Bovendien is de huidige markt zeer concurrerend, waardoor de ontwikkeling van nieuwe producten en innovatieve strategieën nodig zijn om fabrikanten van hun concurrenten te onderscheiden17.

De verrijking van producten met een slechte voedingswaarde, zoals pasta, met mariene hulpbronnen, waaronder zeewier, is een strategie om deze hulpbron als een nieuw voedingsmiddel te introduceren en een strategie voor marktdifferentiatie door middel van een product met een duidelijke voedingswaarde. Aan de andere kant is G. gracilis een bron van natuurlijke rode pigmenten zoals phycobiliproteïnen18, met een groot potentieel voor toepassingen in de voedingsindustrie. Dit zeewier heeft op verschillende gebieden grote belangstelling getoond en kan worden toegepast met behulp van het hele zeewier, extracten en/of de resterende biomassa. In dit werk demonstreren we enkele voorbeelden van dergelijke toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Oogsten en voorbereiden van biomassa

  1. Oogst de exemplaren van G. gracilis tijdens eb en vervoer ze snel naar het laboratorium in donkere, gekoelde dozen om uitdroging, licht en blootstelling aan de lucht te voorkomen.
  2. Was in het laboratorium elk thallus met stromend zeewater en reinig grondig om puin, necrotische delen, epifyten en andere organismen van het oppervlak te verwijderen.
  3. Bewaar de wilde biomassa in constant belucht zeewater (31-35 psu) in een klimaatruimte (20 ± 1 °C) met een lage instraling van daglicht, koelwitte en fluorescentielampen en een fotoperiode van 16:08 (licht: donker) gedurende 7 dagen. Geef gedurende deze periode geen voedingsmedia toe; Hierdoor kan het zeewier zich langzaam aanpassen aan de nieuwe omstandigheden binnenshuis.

2. Voorraadbeheer

  1. Snijd na de acclimatisatieperiode gezonde uiteinden van zeewierthalli met een steriel mes. Volgens Redmond et al. (2014)19 en onder steriele omstandigheden, sleept u elke tip door een agargel die eerder is bereid in petrischalen (1,0% bacteriologische agar, in een verhouding van 1:1 gedestilleerd water/zeewater) om eventuele resterende verontreinigingen te verwijderen. Voer de agar-sleep drie keer uit voor elke tip en sleep de tip altijd door ongebruikte delen van de agar-gel.
  2. Glaswerk met zuur wassen in een zoutzuuroplossing (HCl, 15%) en grondig afspoelen met gedestilleerd water. Steriliseer alle gereedschappen, glaswerk, agar, zeewater en gedestilleerd water dat bij het reinigingsproces wordt gebruikt met een autoclaaf (121 °C, 15 min).
    LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van HCl dat door de leverancier is geleverd.
  3. Tips groeien in gesteriliseerd zeewater bij 35 psu, aangevuld met Von Stosch Enriched solution (VSE) gemodificeerd voor rode zeewieren, volgens Redmond et al. (2014)19. Voeg germaniumdioxide (GeO2) toe aan het medium (1 ml/l) om de groei van epifytische diatomeeën te voorkomen.
    LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van GeO2 dat door de leverancier is geleverd.
    OPMERKING: Tips die pigmentverlies vertonen, zoals waargenomen door gedeeltelijke of volledige verkleuring, staan onder stress of zijn al dood en moeten worden weggegooid.

3. Teelt en opschaling

  1. Verdeel na de acclimatisatieperiode willekeurig ongeveer 8-10 gezonde tips in kolven met platte bodem van 250 ml in een klimaatkamer van 20 ± 1 °C met het witte koele licht van 20 ± 0,5 μmol fotonen m-2 s-1 (1500 lux), een fotoperiode ingesteld op 16 uur: 8 uur (licht: donker) en steriel zeewater verrijkt met VSE-kweekmedia die elke week wordt vernieuwd.
  2. Voer wekelijkse gewichtsmetingen uit en vermijd overmatige belasting van de thalli20. Verwijder hiervoor voorzichtig de uiteinden van het kweekmedium, spoel voorzichtig af en weeg de milligrammen op een laboratoriumweegschaal.
    OPMERKING: Deze procedure kan worden uitgevoerd samen met de wekelijkse vernieuwing van de kweekmedia.
  3. Thalli kan in deze kolven groeien tot een dichtheid van 2 g/l. Voer nu een opschaling van de ontvanger uit (250 ml, 1 L en 5 L). Breng de teelt over naar open witte buitenbakken van 50 L en groter wanneer het volume 5 L bereikt.
  4. Bereken de relatieve groeisnelheid (RGR) volgens Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/dag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    waarbij IW en FW respectievelijk het begin- en het uiteindelijke verse gewicht zijn, uitgedrukt in grammen, en t de tijd in dagen.
    OPMERKING: Bij deze laboratoriumopstelling bereikt RGR waarden tot 21% per dag. Het oogsten van biomassa kan op elk moment worden uitgevoerd. Biomassa moet snel worden verwerkt om afbraak te voorkomen door drogen in de oven, vriesdrogen of gewoon ingevroren (-20 °C), afhankelijk van het beoogde gebruik. De gedroogde biomassa kan ook bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard of ingevroren worden opgeslagen.

4. Extractie procedure

OPMERKING: Om de in vitro cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen van G. gracils-extracten te beoordelen, houdt de bereiding ervan rekening met twee verschillende parameters: de extractietemperatuur en het type oplosmiddel.

  1. Om de extracties uit te voeren, droogt u de G. gracilis biomassa in de oven en maalt u de biomassa (bijv. in een huishoudelijke koffiemolen) totdat het poeder door een zeef van 200 μm gaat.
  2. Weeg de gedroogde biomassa (10 g) af en los deze op in 100 ml oplosmiddel (absolute ethanol of steriel water).
  3. Roer in een tegen licht beschermd vat gedurende 30 minuten.
  4. Voer sequentiële ethanol > water en water> ethanolextracties uit bij RT, 40 °C en 70 °C.
  5. Voer voor elke temperatuur de extracties met ethanol en water twee keer afzonderlijk uit.
  6. Scheid de vloeibare extracten van de resterende biomassa door filtratie door filtreerpapier (Whatman No.1), gevolgd door centrifugeren bij 8000 x g gedurende 10 minuten bij RT.
  7. Hergebruik de resterende algenbiomassa voor verdere extractie met het andere oplosmiddel. Als een monster eerst met ethanol is geëxtraheerd, extraheer het dan met water en vice versa.
  8. Vriesdroog de waterige extracten en damp de ethanolextracten in een roterende verdamper bij 40 °C.
  9. Bewaar de gedroogde extracten bij 4 °C.
  10. Los de extracten op in een concentratie van 50 mg/ml (antimicrobiële testen) of 10 mg/ml (antioxidanttesten). Los de waterige extracten op in steriel water en de ethanolextracten in absolute ethanol.

5. Antimicrobiële activiteit

OPMERKING: De ethanolische en waterige extracten moeten afzonderlijk worden getest op Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) en Listonella anguillarum (DSM 21597). Antimicrobiële tests moeten worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van het National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)22. Alle culturen zijn afkomstig uit de Duitse collectie van micro-organismen en celculturen (DSMZ). L. anguillarum werd gekweekt op tryptische sojabouillon (TSB) of tryptische soja-agar (TSA) aangevuld met 1% natriumchloride (NaCl). De overige twee stammen werden gekweekt op LB-medium (VWR Chemicals). De culturen Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) en Listonella anguillarum (DSM 21597) werden geïncubeerd bij 30 °C, terwijl Escherichia coli (DSM 5922) werd geïncubeerd bij 37 °C, volgens de instructies van de leverancier. De bouillon-microverdunningsmethode kan worden gebruikt voor de bepaling van antimicrobiële activiteit in vloeibare media, en dit moet op microschaal worden uitgevoerd, zodat het antimicrobiële potentieel snel en efficiënt kan worden bepaald. Deze goedkope methode maakt het mogelijk om in slechts 24 uur resultaten te verkrijgen, waardoor het geschikt is om in een vroeg stadium de beste extractieomstandigheden te bepalen die het mogelijk maken om voor een bepaalde microbiële stam resultaten te verkrijgen op het gebied van groeiremmende werking. De methodologie vereist echter het gebruik van steriele microtiterplaten met een deksel dat specifiek is voor microbiële groei, evenals de beschikbaarheid van een microplaatlezer voor de golflengte van 600 nm.

  1. Voer de microverdunningstests van de bouillon uit met behulp van onbehandelde microtiterplaten met 96 putjes en een ronde bodem met 170 μl Muller-Hinton-bouillon (MHB), geïnoculeerd met 10 μl gestandaardiseerd inoculum (bij 0,5 McFarland-standaard) en 20 μl van elk extract (50 mg/ml).
  2. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij de optimale temperatuur voor elke stam.
  3. Detecteer de antimicrobiële activiteit door de vermindering van de zichtbare troebelheid, gemeten door de optische dichtheid (OD 600) te registreren in een microplaatspectrofotometer, na 0 uur en 24 uur.
  4. Druk de resultaten uit als een percentage van remming:
    figure-protocol-1
    waarbij Abs. ext het verschil is in de gemeten extinctie, tussen 0 uur en 24 uur, in de putjes die een bacteriestam bevatten die groeit in aanwezigheid van het extract, en Abs verwijst naar dezelfde maat in putjes die de bacteriestam en het oplosmiddel bevatten.
  5. Neem bij deze methode controlereacties op, met putjes die alleen kweekmedium bevatten dat de negatieve controle zal zijn, maar ook putjes met medium dat is geïnoculeerd met de standaardstam toegevoegd aan oplosmiddel (ethanol of water) en medium met de bacteriestam en het positieve controle-antibioticum (chlooramfenicol).

6. Antioxiderende werking en kwantificering van de totale hoeveelheid polyfenolen

  1. Totaal polyfenolgehalte
    OPMERKING: Het totale polyfenolgehalte (TPC) wordt uitgevoerd volgens de Folin-Ciocalteu-methode23 en aangepast aan microschaal.
    1. Voeg aan elk putje van een microtiterplaat met 96 putjes, beschermd tegen licht, 158 μL ultrapuur water, 2 μL van het monster en 10 μL Folin-Ciocalteu-reagens toe.
      LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van het Folin-Ciocalteu-reagens dat door de leverancier is geleverd.
    2. Voeg na 2 minuten 30 μL Na2CO3 (20%) toe.
    3. Meet de monsters na incubatie in het donker bij RT gedurende 1 uur spectrofotometrisch bij 755 nm.
    4. Gebruik galluszuur (waarmee de kalibratiecurve kan worden uitgezet) of ultrapuur water (2 μL) als controles.
    5. Druk de resultaten uit als galluszuurequivalenten (mg GAE/g-extract).
  2. 2,2 difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicale wegvangende activiteit
    OPMERKING: De antioxiderende werking van de extracten wordt geëvalueerd zoals beschreven door Duan et al. (2006)24, aangepast aan microschaal
    1. Plaats in een microtiterplaat met 96 putjes, beschermd tegen licht, 2 μl van elk monster (met een concentratie van 10 mg/ml) en 198 μl DPPH opgelost in absolute ethanol (0,1 mM).
      LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van DPPH dat door de leverancier is geleverd.
    2. Voer de reactie 30 minuten uit op RT in het donker. Meet de extinctie bij 517 nm in een microplaatspectrofotometer.
    3. Voer een controlereactie uit met 2 μl absolute ethanol/gedestilleerd water en 198 μl DPPH-oplossing. Voer een blancometing uit met 2 μl extract en 198 μl absolute ethanol.
    4. Druk de resultaten uit als het percentage DPPH-remming met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-2
      waarbij As de extinctie van het algenextract is, Ab de extinctie van de blanco monsters en Ac de extinctie van de controle.

7. Evaluatie van cytotoxiciteit in epidermale cellen

OPMERKING: Het in vitro cytotoxische effect van de waterige en ethanolextracten van G. gracilis wordt geëvalueerd in menselijke keratinocyten (HaCaT-cellen - 300493) door middel van de MTT-colorimetrische test zoals eerder beschreven25. Cellen werden overgenomen van Cell Lines Services, Duitsland (CLS) en de methode werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en CLS-instructies.
LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van MTT dat door de leverancier is geleverd)

  1. Onderhoud van celkweek
    1. Kweek HaCaT-cellen in Dulbecco's Modified Eagle's high glucose medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum/antimycotische oplossing (amfotericine B, 0,25 mM; penicilline, 60 mM; streptomycine, 100 mM).
    2. Gebruik trypsine-EDTA om de cellen te dissociëren.
      OPMERKING: De subcultuur van HaCaT-cellen wordt bereikt nadat de cellen totale samenvloeiing hebben bereikt.
    3. Kweek de cellen in een kamer bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.
    4. Subcultuur van de cellen volgens de instructies van de biobank wanneer culturen 80%-85% samenvloeiing bereiken.
  2. Evaluatie van cytotoxiciteit
    1. Na het zaaien van cellen in platen met 96 putjes en een nacht incubatie, behandelt u HaCaT-cellen (4 x 104 cellen/putje) met de gedroogde extracten die eerder zijn opgelost in DMSO (100 mg/ml). Voeg vervolgens 2 μL van de extractoplossing toe aan 198 μL medium en incubeer de platen gedurende 24 uur.
    2. Verwijder het kweekmedium en voeg 100 μL MTT (0,5 mg/ml) toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in het donker onder de hierboven genoemde normale kweekomstandigheden.
    3. Verwijder de MTT-oplossing en los de intracellulaire formazankristallen op met 100 μL DMSO.
    4. Meet de extinctie bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer. Druk de resultaten uit als een percentage van de onbehandelde controlecellen.

8. Voedselinnovatie

  1. Nieuw voedingsproduct: Pasta met zeewier
    1. Selectie van ingrediënten en pastaformulering
      LET OP: De selectie van de ingrediënten is gemaakt in samenwerking met een pastabedrijf. Bij de keuze van de belangrijkste ingrediënten (beschreven in punt 8.2) is rekening gehouden met hun gemakkelijke toegankelijkheid en compatibiliteit met de bestaande productielijnen, waarbij gebruik wordt gemaakt van mariene hulpbronnen om pasta met toegevoegde voedingswaarde te verkrijgen.
      1. Ontwerp na de keuze van de ingrediënten de formulering volgens de beoogde voedingswaarde (bron van vezels, vitamines en minerale elementen, laag verzadigd vet) door de theoretische chemische samenstelling van de formuleringen te analyseren met behulp van een spreadsheet.
      2. Wanneer aan de theoretische vereisten is voldaan, gaat u verder met de productie op laboratoriumschaal zoals beschreven in stap 8.1.2.
      3. Voer een sensorische test uit met een semi-getraind panel (>10 proevers) om de noodzaak van herformulering of de acceptatie van de formulering voor de volgende stappen te valideren.
        OPMERKING: Het panel was eerder getraind voor het proeven van pasta en evalueerde hedonisch de gepresenteerde formuleringen met betrekking tot kenmerken zoals smaak, smaak, geur, textuur en uiterlijk.
    2. Productie van pasta
      NOTITIE: Maak Chifferi-pastamonsters met behulp van een pasta-extruder.
      1. Meng in de apparatuur eerder gedefinieerde porties rijstmeel, G. gracilis en Chlorella vulgaris en voeg ongeveer 30% water toe aan het mengsel.
      2. Om droge pasta te verkrijgen, droogt u Chifferi bij 68 °C gedurende 42 minuten, gevolgd door 5 uur en 30 minuten bij 76 °C, waarbij een industrieel proces wordt gesimuleerd.
      3. Verpak en vacumeer ten slotte de monsters en bewaar ze op een donkere plaats bij RT tot verdere analyse.
    3. Nutritionele analyse
      OPMERKING: Gebruik voor de analyses van het voedingsprofiel gedroogde en gemacereerde monsters in drievoud.
      1. Ruw eiwitgehalte: Voer een totale eiwitbepaling uit volgens de Kjeldahl-methode , aangepast aan Duarte et al. (2022)26, volgens de stappen 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Weeg 1,0 g monster (of gedestilleerd water voor de blanco test) nauwkeurig af en meng met twee Kjeldahl-tabletten en 25 ml H2SO4 in de digestiebuisjes.
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van H2SO4 dat door de leverancier is geleverd.
      3. Voer de vergisting van de monsters uit in een Kjeldahl-vergister bij 220 °C gedurende 30 min, gevolgd door 90 min bij 400 °C.
      4. Voeg na afkoeling tot RT 80 ml gedestilleerd water toe en destilleer de gevormde ammoniak tot 30 ml van een 4% H 3 BO3-oplossingdie broomcresolgroen en methylrood bevat. Deze stap vindt plaats onder alkalische omstandigheden (destillatie met 40% NaOH met behulp van een Kjeldahl-distilleerder.
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van de H 3 BO3-oplossingmet broomcresolgroen, methylrood en 40% NaOH die door de leverancier wordt geleverd.
      5. Titreer de gedistilleerde monsters met HCl 0,1 M totdat een kleurverandering naar grijsroze wordt waargenomen.
      6. Bereken het gehalte aan ruw eiwit, weergegeven door het stikstofgehalte van het monster, en druk dit uit in g per 100 g met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-3
        waarbij Vs overeenkomt met het HCl-volume (ml) dat wordt gebruikt bij de titratie van het monster; Vb komt overeen met het volume dat in de blanco wordt gebruikt; N komt overeen met HCl-normaliteit; w komt overeen met het gewicht van het monster (g).
      7. Totaal vetgehalte: Bepaal het totale vetgehalte met behulp van de Folch-methode, overgenomen van Folch et al. (1957)27, volgens de stappen 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Bereid het Folch-reagens voor doorCHCl 3 en MeOH te mengen in een verhouding van 2:1 (v:v).
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van het Folch-reagens dat door de leverancier is geleverd.
      9. Voeg aan reageerbuisjes met 1 g aliquots monsters 5 ml Folch-reagens en 0,8 ml gedestilleerd water toe. Meng in een draaikolk gedurende 1 min.
      10. Voeg vervolgens nog eens 5 ml Folch-reagens toe en homogeniseer gedurende 5 minuten. Voeg 1,2 ml 0,8% NaCl-oplossing toe en homogeniseer gedurende 2 minuten.
      11. Centrifugeer de monsters op 7000 x g gedurende 10 minuten. Filtreer de organische fase (onderste fase) door hydrofiel katoen en watervrij natriumsulfaat in een glazen kolf met ronde bodem.
      12. Om monsterverlies te voorkomen, herhaalt u de stappen van toevoeging van 5 mlCHCl 3, homogenisatie, centrifugatie en filtratie onder dezelfde omstandigheden.
      13. Verwijder het organische oplosmiddel uit de opgevangen organische fasen door middel van verdamping onder lage druk en laat het 4 uur in de oven op 105 °C staan. Koel de monsters af in een exsiccator
      14. Bereken het vetgehalte, uitgedrukt in g per 100 g, met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-4
        waarbij W1 het lege gewicht van de glazen kolf met ronde bodem is; W2 is het aanvankelijke gewicht van het monster; W3 is de glazen kolf met ronde bodem en het monstergewicht.
      15. Gehalte aan ruwe celstof: Bepaal het gehalte aan ruwe celstof met behulp van een methode die is aangepast aan ISO 6865 (2000)28, volgens de stappen 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Weeg 1 g van het monster (W0) af in een glazen kroes met filterbodem (referentie P2) en plaats het in de vezelanalysator.
      17. De eerste stap is zure hydrolyse: voeg 150 ml 1,25% H 2 SO4, voorverwarmd, en2ml antischuimmiddel (n-octanol) toe aan de kolom van elke kroes; Verwarm tot het kookt en bewaar 30 min.
      18. Na verwijdering van dit oplosmiddel, driemaal wassen met gedeïoniseerd water om door te gaan naar de basishydrolyse. Voeg 150 ml 1,25% NaOH, voorverwarmd, en 5 ml antischuimmiddel toe aan de vloeistofvrije kolom en voer dezelfde verhittingsprocedure uit als voor de zure hydrolyse.
      19. Maak tot slot een drievoudige wasbeurt met 150 ml aceton voor de koude extractie.
      20. Haal na dit proces de kroezen voorzichtig uit het systeem en plaats ze gedurende 1 uur in een oven op 150 °C. Noteer het eindgewicht (W1).
      21. Plaats de kroezen gedurende 3 uur in een moffeloven bij 500 °C en noteer vervolgens het eindgewicht (W2).
      22. Bereken het gehalte aan ruwe celstof en druk de resultaten uit in percentages met behulp van de volgende vergelijking:
        %Ruwe celstof = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Vetzuurprofiel (FA): Bepaal het vetzuurprofiel volgens Fernández et al.(2015)29, volgens de stappen 8.1.3.24-8.1.3.29.
        OPMERKING: De methylesters van vetzuren (FAME's) worden verkregen door directe zuurgekatalyseerde transmethylering van de gemalen gevriesdroogde monsters. Alle analyses worden in drievoud uitgevoerd.
      24. Voeg 2 ml van een 2% (v/v) H 2 SO4-oplossing in methanol toe aan een monster van 50 mg en giet het mengsel gedurende2uur onder voortdurend roeren bij 80 °C.
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van methanol dat door de leverancier wordt geleverd.
      25. Voeg na afkoeling tot RT 1 ml ultrapuur water en 2 ml n-heptaan toe aan elk monster, draai het mengsel gedurende 1 minuut en centrifugeer het gedurende 5 minuten.
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van n-heptaan dat door de leverancier is geleverd.
      26. Herstel de bovenste n-heptaanfase (organisch) die de FAME's bevat en breng deze over naar gaschromatografie (GC)-flacons.
      27. Analyseer in een gaschromatograaf die is uitgerust met een TR-FAME capillaire kolom (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm filmdikte), een autosampler en een vlamionisatiedetector (FID).
      28. Stel de injector (splitless-modus) in op 250 °C en de detector op 280 °C. Stel de begintemperatuur van de kolom in op 75 °C en houd deze 1 minuut vast. Verhoog vervolgens met 5 °C/min tot 170 °C en houd 10 minuten vast. Verhoog vervolgens met 5 °C/min tot 190 °C en houd nog eens 10 minuten aan. Verhoog ten slotte met 2 °C/min tot 240 °C en houd 10 minuten vast. Gebruik helium als draaggas met een debiet van 1,5 ml/min. Toevoer van lucht en waterstof met debieten van respectievelijk 350 en 35 ml/min.
      29. Bepaal het FA-profiel door de resulterende retentietijden te vergelijken met een standaard en de resultaten uit te drukken als een percentage van het totale vet.
      30. Profiel van minerale elementen: Bepaal de minerale elementen (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) geanalyseerd door ICP-OES, volgens de methode aangepast van Pinto et al. (2022)30, volgens de stappen 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Weeg ongeveer 0,4 g van elk droog monster nauwkeurig af en voeg 7,5 ml HNO3 en 2,5 ml HCl toe.
        LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van HNO3 en HCl dat door de leverancier is geleverd.
      32. De vergisting verloopt in twee fasen: Verhoog de temperatuur van RT tot 90 °C in 30 minuten (en houd nog eens 30 minuten aan bij deze temperatuur), gevolgd door 60 minuten bij 105 °C.
      33. Koel de monsteroplossingen, verdun ze tot 25 ml en filter ze en bewaar ze in geëtiketteerde buisjes. Voer bij elke vertering hetzelfde proces uit met een referentiemateriaal en een blanco. Verkrijg de concentratie van de verschillende elementen door ICP-OES.
      34. Druk de resultaten uit in mg per 100 g fw.
      35. Koolhydraatgehalte: Bereken het koolhydraatgehalte volgens de stappen 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Bereken het beschikbare koolhydraatgehalte (exclusief vezels) door het verschil van de eerder bepaalde factoren per 100 g, met behulp van de volgende vergelijking, volgens de Voedsel- en Landbouworganisatie (FAO; 2003)31
        figure-protocol-5
      37. Druk de resultaten uit in g per 100 g.
      38. Vocht- en asgehalte: Maak een schatting van het vocht- en asgehalte volgens de stappen 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Incubeer porseleinen kroezen gedurende 3 uur bij 105 °C, koel ze af in een exsiccator en weeg ze.
      40. Weeg 10 g van het monster af in de kroes en plaats het gedurende 3 uur in een droogoven bij 105 °C totdat de waarden van de opeenvolgende wegingen niet meer dan 10 mg verschillen.
      41. Bereken het vochtgehalte, uitgedrukt in g per 100 g fw, met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-6
        waarbij W1 het gewicht van de lege kroes is, W2 het gewicht van de kroes met het verse monster en W3 het gewicht van de kroes met het gedroogde monster.
      42. Plaats de kroezen met de gedroogde monsters na de bepaling van het vochtgehalte gedurende 4 uur in een verbrandingsoven bij 525 °C.
      43. Herhaal deze procedure totdat de opeenvolgende wegingen niet meer dan 1 mg verschillen.
      44. Koel de monsters af tot RT in een exsiccator en weeg ze vervolgens.
      45. Bereken het asgehalte, uitgedrukt in g per 100 g fw, met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-7
        waarbij W1 het gewicht van de lege kroes is, W2 het gewicht van de kroes met vers monster, W3 het gewicht van de kroes met gewicht.
      46. Energetische waarde: Bereken de energetische waarde volgens de stappen 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Bereken de energetische waarde van de monsters volgens de EU-verordening:De verstrekking van voedselinformatie aan consumenten (Verordening (EU) nr. 1169/2011)32, met behulp van de vergelijkingen:
        Energie (kcal/ 100 g) = 4 x (g eiwitten) + 4 x (g koolhydraten) + 9 x (g vet) + 2 x (g vezels)
        Energie (kJ/ 100 g) = 17 x (g eiwitten) + 17 x (g koolhydraten) + 37 x (g vet) + 8 x (g vezels)
      48. Druk de resultaten uit in kilocalorieën per 100 g en kilojoule per 100 g.
    4. Acceptatie door de consument
      1. Evalueer de acceptatie door de consument met behulp van pastamonsters die gedurende 8 minuten in gedestilleerd water zijn gekookt.
      2. Voer een consumentenacceptatietest uit: Evalueer het uiterlijk, de kleur, de textuur, de geur, de zeesmaak, de algehele smaak, de algehele evaluatie en de aankoopintentie van de monsters.
        OPMERKING: De consumentenacceptatietest is gebaseerd op hedonische tests die het uiterlijk, de kleur, de textuur, de geur, de zeesmaak, de algehele smaak, de algehele evaluatie en de aankoopintentie evalueren op een schaal van 1-9, waarbij 1 een slechte evaluatie is en 9 een zeer goede evaluatie.
      3. Voer sensorische tests uit in individuele sensorcabines in een sensorisch analyselaboratorium (met temperatuur- en lichtregeling). Zorg voor bestek, servetten en glazen bekers met mineraalwater om het gehemelte tussen de monsters door schoon te maken.
        OPMERKING: Proevers zijn tussen de 16 en 64 jaar oud en hebben alle achtergronden (n > 80).
  2. Yoghurt
    1. Pigment extractie
      OPMERKING: Voer de pigmentextractie uit volgens de methodologie beschreven in Pereira et al. (2020)18.
      1. Bereid het extractieoplosmiddel voor, natriumfosfaatbuffer op 0,1 M, met natriumfosfaat dibasisch (0,03 M) en natriumfosfaat monobasisch (0,07 M). Stel de pH in op pH 6,8 met behulp van NaOH of HCl.
      2. Weeg 1 g G. gracilis af en voeg 50 ml natriumfosfaatbuffer (pH 6,8) toe. Homogeniseer gedurende 10 minuten, gevolgd door 10 minuten maceratie met vijzel en stamper.
      3. Breng de oplossing over in een buis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 12,298 x g (4 °C).
      4. Pool het supernatans en voeg langzaam 65% ammoniumsulfaat toe. Wanneer al het ammoniumsulfaat is opgelost, bedek de oplossing met een aluminiumplaat en laat u deze een nacht neerslaan bij 4 °C.
        LET OP: Zie het door de leverancier geleverde veiligheidsinformatieblad van ammoniumsulfaat.
      5. Centrifugeer het neerslag gedurende 20 minuten bij 12,298 x g (4 °C). Win de pellet terug en los op in gedestilleerd water (ongeveer 5 ml).
      6. Dialyse van het extract met behulp van een slangmembraan (14 kDa) tegen water gedurende 24 uur, gevolgd door vriesdrogen. Bewaar het gevriesdroogde extract beschermd tegen licht bij 4 °C tot gebruik.
    2. Yoghurt bereiding
      1. Bereid natuurlijke yoghurt door 1 L gepasteuriseerde melk, 120 g natuurlijke yoghurt, 20 g suiker en 50 g melkpoeder in een thermomixer te mengen gedurende 5 min, 50 °C, snelheid 3.
      2. Plaats het mengsel gedurende 12 uur in de thermomixerpot in een incubator bij 37 °C.
      3. Voeg het extract toe door het in yoghurt te mengen in een concentratie van 0,21%. Bewaar de monsters tot de analyse in afzonderlijke glazen kolven bij 4 °C.
      4. Bewaar afzonderlijke porties yoghurt zonder pigment (controle) bij 4 °C tot analyse.
    3. Kleur stabiliteit
      OPMERKING: Evalueer de stabiliteit van het pigment in de yoghurt door middel van kleuranalyse gedurende 12 dagen. Voer een kleuranalyse uit met behulp van een reflectiecolorimeter, met behulp van een standaardwaarnemer van 2 graden en een D65-lichtbron. De resultaten worden gepresenteerd als CIELab-coördinaten met L (lichtheid, zwart - wit, 0 - 100), a* (groen - rood, -60 - 60) en b* (blauw - geel, -60 - 60) parameters. Parameter a* heeft positieve waarden voor roodachtige kleuren en negatieve waarden voor groenachtige kleuren. Parameter b* neemt positieve waarden voor gelige kleuren en negatieve waarden voor blauwachtige kleuren. L* is de parameter van helderheid, de eigenschap volgens welke elke kleur kan worden beschouwd als gelijkwaardig aan een lid van de grijstinten tussen zwart en wit33.
      1. Kalibreer de colorimeter met behulp van een witte keramische plaat (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) die door de fabrikant is geleverd.
      2. Vul een cel met ongeveer 28 g van het monster (of controlemiddel) en analyseer de kleur met behulp van software voor kleurgegevensanalyse.
        OPMERKING: De software die werd gebruikt voor de analyse van kleurgegevens was de SpectraMagic NX.
      3. Voer 5 keer metingen uit in monster-/controledrievouden.
    4. Sensorische analyse
      OPMERKING: Voer sensorische evaluatie uit van yoghurt met pigmentopname met behulp van een driehoekstest (ISO 4120, 2004)34 en een hedonistische evaluatie van kleur, smaak en algehele waardering.
      1. Geef de panelleden voor de driehoekstest drie monsters (één monster yoghurt met pigment en twee controlemonsters, of twee monsters yoghurt met pigment en één controlegroep) en vraag hen om een ander monster te kiezen op basis van het aroma, de textuur en de smaak. Verstrek monsters in vergelijkbare volumes die zijn geïdentificeerd met willekeurige 3-cijferige codes.
      2. Voor de hedonische evaluatie van de yoghurt met pigment, geef je de panelleden een monster van yoghurt met pigment en vraag je hen om de kleur, smaak en algehele waardering te evalueren met behulp van een 9-punts hedonische schaal (van extreem afkeer tot extreem leuk).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Antimicrobiële activiteit

Bij de interpretatie van de verkregen resultaten moet er rekening mee worden gehouden dat hoe hoger het remmingspercentage, hoe groter de werkzaamheid van het extract bij het remmen van de groei van die specifieke stam en dus hoe interessanter het extract is als antimicrobieel middel. Door deze methodologie kunnen we snel identificeren welke extracten een grotere activiteit hebben op be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De antimicrobiële activiteitstests in een vloeibaar medium worden gebruikt om de effectiviteit van antimicrobiële stoffen tegen micro-organismen gesuspendeerd in een vloeibaar medium te evalueren en worden meestal uitgevoerd om het vermogen van een stof te bepalen om de groei te remmen of micro-organismen te doden35,36,37,38. Ze worden gebruikt om de gevoeligheid van micro-organismen voor antim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT) via de strategische projecten die zijn toegekend aan MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 en UIDB/04292/2020) en Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT financierde ook de individuele doctoraatsbeurzen die werden toegekend aan Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) en Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Deze werkzaamheden werden ook financieel ondersteund door het project HP4A - GEZONDE PASTA VOOR IEDEREEN (co-promotie nr. 039952), medegefinancierd door het EFRO - Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling, in het kader van het Portugal 2020-programma, via COMPETE 2020 - operationeel programma voor concurrentievermogen en internationalisering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absolute EthanolAga, Portugal64-17-5
Ammonium ChloridePanReac12125-02-9
Amphotericin BSigma-Aldrich1397-89-3
Analytical scale balanceSartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)DSM 347
BiotinPanreac AppliChem58-85-5
CentrifugeEppendorf, 5810R5811JH490481
ChloramphenicolPanReac56-75-7
CO2 ChamberMemmertN/A
Cool White Fluorescent LampsOSRAM Lumilux SkywhiteN/A
Densitometer McFarlandGrant InstrumentsN/A
DMEM mediumSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Germany1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)DSM5922
Ethanol 96%AGA-Portugal64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)J.T.Baker6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Filter Paper (Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
FlasksVWR International, Alcabideche, Portugal N/A
Folin-CiocalteuVWR Chemicals31360.264
Gallic Acid Merck149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%AlfaAesar1310-53-8
HaCaT cells – 300493CLS-Cell Lines Services, Germany 300493
Hot Plate Magnetic StirrerIKA, C-MAG HS706.090564
Iron SulfateVWR Chemicals10124-49-9
Laminar flow hoodTelStar, Portugal526013
LB Medium VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarumGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 21597
Manganese ChlorideVWR Chemicals7773.01.5
Micropipettes Eppendorf, PortugalN/A
MicroplatesVWR International, Alcabideche, Portugal 10861-666
MicroplatesGreiner738-0168
Microplates (sterile)Fisher Scientific10022403
Microplate reader Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)VWR Chemicals90004-658
OvenBinder, FD11512-04490
OvenBinder, BD11504-62615
PenicillinSigma-Aldrich1406-05-9
pH meter Inolab VWR International, Alcabideche, Portugal 15212099
Pippete tipsEppendorf, Portugal5412307
Pyrex Bottles Media Storage VWR International, Alcabideche, Portugal 16157-169
Rotary EvaporatorHeidolph, Laborota 400080409287
RotavaporIKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)Chem-Lab497-19-8
Sodium Chloride (NaCl) Normax Chem7647-14-5
Sodium Phosphate DibasicRiedel-de Haën7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta, Japancolor data analysis software
SpectrophotometerEvolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA5A4T092004
StreptomycinSigma-Aldrich57-92-1
ThiaminePanreac AppliChem59-43-8
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049
Tryptic Soy Agar (TSA)VWR ChemicalsICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB) VWR Chemicals22091
Ultrapure water Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, GermanyF5HA17360B
Vacuum pumpBuchi, SwitzerlandFIS05-402-103
Vitamin B12Merck68-19-9

Referenties

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562(2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516(2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81(2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492(2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822(2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769(2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688(2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611(2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482(2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427(2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068(2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364(2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642(2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380(2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431(2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ZeewierextractieBioactieve verbindingenAntioxidante activiteitCytotoxiciteitstestSensorische analyseVetzuurprofielVoedingsverrijking
Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.