Detectie en kwantificering van mono-rhamnolipiden en di-rhamnolipiden geproduceerd door Pseudomonas aeruginosa

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa produceert de rhamnolipide biosurfactanten. Dunnelaagchromatografie detecteert en bepaalt het aandeel mono- en di-rhamnolipiden dat door elke stam wordt geproduceerd. Kwantificering van het totale aantal rhamnolipiden omvat het beoordelen van rhamnose-equivalenten die aanwezig zijn in deze biosurfactanten die worden geëxtraheerd uit de kweeksupernatanten met behulp van de orcinol-methode.

Samenvatting

De milieubacterie Pseudomonas aeruginosa is een opportunistische ziekteverwekker met een hoge antibioticaresistentie die een gevaar voor de gezondheid vormt. Deze bacterie produceert hoge niveaus van biosurfactanten, bekend als rhamnolipiden (RL), dit zijn moleculen met een aanzienlijke biotechnologische waarde, maar die ook in verband worden gebracht met virulentie-eigenschappen. In dit opzicht kan de detectie en kwantificering van RL nuttig zijn voor zowel biotechnologische toepassingen als biomedische onderzoeksprojecten. In dit artikel demonstreren we stap voor stap de techniek om de productie van de twee vormen van RL geproduceerd door P. aeruginosa te detecteren met behulp van dunne-laagchromatografie (TLC): mono-rhamnolipiden (mRL), moleculen gevormd door een dimeer van vetzuren (voornamelijk C10-C10) gekoppeld aan één rhamnosegroep, en di-rhamnolipiden (dRL), moleculen gevormd door een soortgelijk vetzuurdimeer gekoppeld aan twee rhamnosegroepen. Daarnaast presenteren we een methode om de totale hoeveelheid RL te meten op basis van de zure hydrolyse van deze biosurfactanten geëxtraheerd uit een P. aeruginosa cultuur supernatans en de daaropvolgende detectie van de concentratie van rhamnose die reageert met orcinol. De combinatie van beide technieken kan worden gebruikt om de geschatte concentratie van mRL en dRL geproduceerd door een specifieke stam te schatten, zoals hier geïllustreerd met de typestammen PAO1 (fylogroep 1), PA14 (fylogroep 2) en PA7 (fylogroep 3).

Inleiding

Pseudomonas aeruginosa is een omgevingsbacterie en een opportunistische ziekteverwekker die zeer zorgwekkend is vanwege de productie van virulentie-geassocieerde eigenschappen en de hoge antibioticaresistentie ^1,2. Een kenmerkende secundaire metaboliet die door deze bacterie wordt geproduceerd, is de biosurfactant RL, die op een gecoördineerde manier wordt geproduceerd met verschillende virulentie-geassocieerde eigenschappen zoals het fenazine pyocyanine, een antibioticum met redoxactiviteit, en het protease elastase³. De tensioactieve en emulgerende eigenschappen van RL zijn geëxploiteerd in verschillende industriële toepassingen en worden momenteel gecommercialiseerd⁴.

De meeste P. aeruginosa-stammen, die behoren tot fylogroepen 1 en 2, produceren twee soorten RL: mRL, dat bestaat uit één rhamnosegroep die is gekoppeld aan een vetzuurdimeer dat voornamelijk uit 10 koolstofatomen bestaat, en dRL, dat een extra rhamnosegroep bevat die is gekoppeld aan de eerste rhamnose⁴ (zie figuur 1). Er is echter gemeld dat twee kleine P. aeruginosa fylogroepen (groepen 3 en 5) slechts mRL ^5,6 produceren. De twee soorten RL bevatten een mengsel van vetzuurdimeren, die, zoals gezegd, voornamelijk C10-C10 zijn, maar er worden ook kleinere hoeveelheden moleculen geproduceerd die C12-C10, C12-C12 en C10-C12:1-dimeren bevatten. De karakterisering van de RL-congeneren geproduceerd door verschillende stammen met behulp van HPLC MS/MS is gerapporteerd ^7,8. De methoden die in dit werk worden beschreven, kunnen alleen onderscheid maken tussen mRL en dRL, maar kunnen niet worden gebruikt voor de karakterisering van de RL-congeneren.

P. aeruginosa en sommige Burkholderia-soorten zijn natuurlijke producenten van RL⁹, maar de eerste bacterie is de meest efficiënte producent. Commercieel gebruikte RL wordt momenteel echter geproduceerd in Pseudomonas putida KT2440-derivaten die P. aeruginosa-genen tot expressie brengen om het gebruik van deze opportunistische ziekteverwekker te vermijden^10,11. De detectie en kwantificering van RL geproduceerd door P. aeruginosa zijn van groot belang voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de expressie van virulentiegerelateerde eigenschappen¹², voor de karakterisering van stammen die behoren tot clades 3 of 5¹³, en voor het construeren van P. aeruginosa-derivaten die deze biosurfactanten overproduceren terwijl ze de virulentie verminderen¹⁴. De productie van biosurfactanten door verschillende micro-organismen is gedetecteerd op basis van enkele algemene kenmerken van deze verbindingen, zoals de collapsdruppelmethode of emulgeringsindex¹⁵, maar deze methoden zijn noch nauwkeurig, noch specifiek¹⁶.

Hier beschrijven we het protocol om mRL en dRL te detecteren met behulp van de vloeistofextractie van totaal RL uit de kweeksupernatanten van verschillende P. aeruginosa-type stammen en de scheiding van beide typen RL met behulp van TLC. Bij deze methode wordt de RL die uit het cultuursupernatans wordt geëxtraheerd, gescheiden door hun differentiële oplosbaarheid in de oplosmiddelen die voor TLC worden gebruikt, waardoor differentiële migratie op de silicagelplaat ontstaat. mRL heeft dus een snellere migratie dan dRL en ze kunnen worden gedetecteerd als afzonderlijke vlekken wanneer de platen worden gedroogd en gekleurd met α-naftol.

De hier beschreven methode voor het detecteren van mRL en dRL door TLC is gebaseerd op een eerder gepubliceerd artikel¹⁷, dat eenvoudig uit te voeren is en geen dure apparatuur vereist. Deze methode is nuttig geweest voor het detecteren van RL in verschillende P. aeruginosa-isolaten ¹³ met behulp van geschikte controles, zoals een van P. aeruginosa afgeleide mutant die geen RL kan produceren. Het is echter niet de voorkeursmethode voor het karakteriseren van nieuwe biosurfactanten geproduceerd door andere bacteriën dan Pseudomonas aeruginosa vanwege het gebrek aan specificiteit.

Daarnaast wordt een methode gepresenteerd voor het kwantificeren van de rhamnose-equivalenten van de totale RL geëxtraheerd uit een P. aeruginosa-cultuursupernatans . Deze methode kwantificeert deze biosurfactanten op basis van de reactie van orcinol met reductieve suikers, wat resulteert in een product dat spectrofotometrisch kan worden gemeten bij 421 nm, zoals eerder beschreven¹⁸. Aangezien de reactie met orcinol niet specifiek is voor rhamnose, is het belangrijk om deze methode uit te voeren met RL geëxtraheerd uit het cultuursupernatans dat geen significante hoeveelheden andere suikerhoudende moleculen, zoals lipopolysacchariden (LPS), bevat. Een aangezuurd chloroform/methanolmengsel wordt hier gebruikt voor vloeibare extractie van RL¹⁸, maar ethylacetaat kan ook worden gebruikt, en vastefase-extractie (SPE) levert zeer goede resultaten op¹⁹. De hier beschreven orcinol-methode vereist geen geavanceerde apparatuur en kan betrouwbare resultaten opleveren als deze met speciale zorg wordt uitgevoerd bij het voorbereiden van de geanalyseerde monsters, zoals besproken. Om een goede monstervoorbereiding te garanderen, is het belangrijk om een Pseudomonas aeruginosa rhlA-mutant die geen RL²⁰ kan produceren, op te nemen en om voor elke bepaling drie biologische en drie technische replicaten uit te voeren.

Er is aanzienlijke controverse geweest in de literatuur ^16,21 met betrekking tot RL-bepaling door de orcinol-methode, waarbij sommige studies suggereren dat de RL-productie wordt overschat en dat de test niet specifiek is voor rhamnose, waardoor mogelijk andere suikers worden gedetecteerd. We tonen hier echter aan dat de beschreven methoden onder de juiste omstandigheden nauwkeurig en specifiek kunnen zijn. Bovendien maken we voor vergelijking met de procedures die in dit artikel worden beschreven, gebruik van UPLC-MS/MS-detectie van een dRL-standaard en tonen we aan dat vergelijkbare resultaten worden verkregen met de orcinol-methode. Het gedetailleerde protocol voor het kwantificeren van RL met behulp van deze methode is opgenomen in aanvullend bestand 1.

Deze protocollen worden geïllustreerd met behulp van de typestammen PAO1 (fylogroep 1), PA14 (fylogroep 2) en PA7 (fylogroep 3). Deze stammen zijn gekozen omdat ze goed gekarakteriseerd zijn en verschillende RL-profielen produceren.

Protocol

Deze procedure is geschematiseerd in aanvullende figuur 1. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Detectie van mRL en dRL in kweeksupernatanten van P. aeruginosa met behulp van TLC

1. Begin met de gecentrifugeerde bouillon van de P . aeruginosa-stam van belang, gekweekt in vloeibaar medium gedurende 24 uur (om de stationaire groeifase te bereiken waarin RL wordt geproduceerd). Meestal bevatten deze culturen 1 x 10⁹ bacteriën per ml.
2. Pas de pH van de cultuur aan op 2 met behulp van geconcentreerd HCl.
3. Doe 5 ml van het aangezuurde cultuursupernatans in een buis van 50 ml polypropyleen en voeg 5 ml van een 2:1 chloroform: methanolmengsel toe.
4. Schud de buis drie keer door inversie, telkens gedurende 10 s, en laat de buis 2 minuten zonder inversie tussen elke beweging.
5. Laat de buis ongeveer 3 uur onbewogen staan totdat de twee fasen zijn gescheiden, of centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 3.000 x g bij 4 °C.
6. Breng de organische fase (onderlaag) over in een schone buis en laat de buis in een afzuigkap staan tot er droogheid optreedt.
7. Herhaal het proces vanaf stap 1.3 en doe de organische fase van de tweede chloroform: methanolextractie, in de buis die bij de eerste extractie is gebruikt.
8. Verdamp de organische fase tot er 1 ml of 1,5 ml over is. Breng dit volume over in een centrifugebuis van 1,5 ml en verdamp het oplosmiddel een nacht tot het droog is.
9. Voeg 50 μL methanol toe aan de gedroogde buis om RL te resuspenderen.
10. Voer dunnelaagchromatografie uit op silicagelplaten.
    NOTITIE: De grootte van de TLC-plaat moet worden gesneden op basis van het aantal monsters dat zal worden geanalyseerd. Elk monster moet op 1,5 cm worden aangebracht en het toepassingspunt moet zich op 1 cm van de rand van de plaat bevinden (teken een horizontale lijn met een potlood).
11. Breng 5 μl van elk monster aan met behulp van een micropipet van 10 μl.
12. De TLC vloeibare fase bestaat uit een 65:15:2 mengsel van chloroform: methanol: azijnzuur. Om 35 ml van dit mengsel te bereiden, mengt u 26 ml chloroform, 6 ml methanol en 0,8 ml van een 20% stockoplossing van azijnzuur. Meng deze oplosmiddelen en plaats ze minstens 10 minuten in de gesloten TLC-kamer voordat u met de chromatografie begint, zodat de atmosfeer verzadigd is met de vluchtige oplosmiddelen.
13. Plaats de TLC-plaat in de kamer en vermijd contact met het punt waar de monsters zijn aangebracht.
14. Sluit de kamer en laat de TLC staan tot het oplosmiddel 1 cm voor de rand van de plaat bereikt. Verwijder nu de plaat en laat deze drogen (een luchtstroom kan worden toegepast om het proces te versnellen).
15. Bereid een oplossing van α-naftol door 5 g van deze verbinding op te lossen in 33 ml ethanol. Eenmaal opgelost, voeg 127,5 ml ethanol, 12,6 ml water en 20,5 ml koude H₂SO₄ toe.
16. Om de aanwezigheid van mRL en dRL te detecteren, spuit u de α-naftoloplossing op de plaat in de afzuigkap en plaatst u de gespoten plaat enkele minuten in een oven op 85 °C totdat de roze markering van RL zichtbaar is.
17. Gebruik een afbeelding van de TLC om het aandeel mono- en di-RL in elk monster te berekenen met behulp van software die de dichtheid van elke plek detecteert.

2. Kwantificering van de totale hoeveelheid RL voor het meten van de rhamnose-equivalenten in de biosurfactant

1. Plaats 1,2 ml van een stationaire fasecultuur (gekweekt gedurende 24 uur) in een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C. Vang het supernatans op in een schone buis.
2. Breng 333 μL over in een schone buis (voer deze stap in drievoud uit) en voeg 1 ml ether toe.
3. Meng krachtig in een draaikolk gedurende 30 s. Herhaal deze procedure met één buisje per keer.
4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C. Verzamel de organische fase (bovenste fase), doe deze in een schone buis en laat deze open in de afzuigkap totdat deze droog is.
5. Herhaal de extractie met ether zoals beschreven in stap 2.2. Herhaal stap 2.3 en 2.4.
6. Eenmaal volledig gedroogd, voeg je 1 ml water toe aan elke buis. Laat de buizen 12 uur staan om de RL te laten hydrateren en schud vervolgens krachtig in de draaikolk.
7. Leg een schone kolf 5 minuten in ijs (want het is een exotherme reactie). Bereid een oplossing van 60% H₂SO₄ (bescherm de kolf tegen licht).
8. Bereid in een schone tube een 1,6% orcinoloplossing in gedestilleerd water. Om het orcinolreagens te bereiden, mengt u 4,4 ml van de 60% H₂SO_4-oplossing met 0,6 ml van de 1,6% orcinol-oplossing.
9. Bereken het uiteindelijke volume van het benodigde orcinolreagens. Voeg 900 μl van dit reagens toe aan elk monster en aan elke concentratie van de kalibratiecurve, met behulp van verschillende rhamnoseconcentraties (doorgaans worden 9 concentraties rhamnose gebruikt in het bereik van 1 μg/ml tot 9 μg/ml), en één met 100 μl water, en zorg ervoor dat alles in drievoud wordt uitgevoerd.
10. Voeg 100 μL van elk RL-monster toe aan 900 μL van het orcinolreagens in een glazen buis en meng de twee oplossingen.
11. Incubeer gedurende 30 minuten in een voorverwarmd waterbad tot 80 °C.
12. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur.
13. Lees de extinctie van de monsters en de kalibratiecurve af bij 421 nm met behulp van een kwartscel.
14. Bereken de concentratie van rhamnose in elk monster door de extinctie op de kalibratiecurve te interpoleren en rekening te houden met het volume dat voor de bepaling is gebruikt.
15. Om de μM-concentratie te berekenen, deelt u de verkregen concentratie in μg/ml door 182.2 (het molecuulgewicht van rhamnose) en vermenigvuldigt u dit met 1000.

Resultaten

In dit artikel werden drie verschillende stammen van het P. aeruginosa-type gebruikt om drie fylogroepen te vertegenwoordigen, elk met verschillende RL-productieniveaus en verhoudingen van mRL en dRL. Deze stammen omvatten PAO1 (een wondisolaat uit Australië, 1955²²), PA14 (een plantenisolaat uit de VS, 1977²³) en PA7 (een klinisch isolaat uit Argentinië, 2010²⁴). Als negatieve controle werd de PAO1 rhlA-mutant gebruikt, die niet in staat is tot RL-productie. Alle stammen werden gedurende 24 uur gekweekt in PPGAS-medium, speciaal ontworpen om hoge RL-niveaus²⁵ te bevorderen, bij 37 °C. De PPGAS-culturen werden geënt met een optische dichtheid van 0,05 bij 600 nm met behulp van een LB-medium²⁶ nachtcultuur. Doorgaans bereiken P. aeruginosa-stammen na 24 uur een optische dichtheid van 2 gemeten bij 600 nm in PPGAS-medium, wat ongeveer overeenkomt met 1 x 10⁹ bacteriën per ml. Om de kweeksupernatanten voor RL-detectie en -kwantificering te verzamelen, werden de culturen gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C en werd de celpellet weggegooid. De resultaten die met behulp van deze twee methoden zijn verkregen (figuur 2 en figuur 3) illustreren dat zowel de soorten RL die door elke stam worden geproduceerd als de hoeveelheid van hun productie verschillen tussen de drie geanalyseerde stammen. Zoals weergegeven in figuur 2, produceert PAO1 ongeveer 30% mRL en 70% dRL, terwijl PA14 een gelijke verhouding van 50% mRL en 50% dRL produceert, en PA7 uitsluitend mRL produceert. Dit RL-productieprofiel komt overeen met eerdere rapporten ^12,14.

Figuur 3A illustreert de hoeveelheid rhamnose-equivalenten die aanwezig zijn in RL geproduceerd door elk van deze drie soorten stammen. Uit de gedetecteerde rhamnose-hoeveelheden is het duidelijk dat stam PA14 de hoogste hoeveelheid RL produceert, terwijl stam PA7 de laagste hoeveelheid produceert. Deze resultaten alleen kunnen echter niet worden gebruikt om de μM-concentratie van RL te schatten die door elke stam wordt geproduceerd. Bovendien kan de orcinol-methode alleen geen geschatte RL-concentratie geven, omdat deze berust op het karakteriseren van de verhoudingen van mRL en dRL die door elke interessante stam worden geproduceerd. Om een schatting van de μM-concentratie van RL te verkrijgen, moet daarom het aandeel van elk type RL dat in de TLC is bepaald, in aanmerking worden genomen en moet een standaardcurve met verschillende concentraties rhamnose worden opgenomen (figuur 3B).

De orcinol-methode kan inderdaad worden gebruikt om de concentratie van RL te kwantificeren wanneer slechts één type van deze biosurfactant wordt geproduceerd. In dergelijke gevallen komt de μM-concentratie van de gedetecteerde rhamnose rechtstreeks overeen met de μM-concentratie van mRL. Aangezien twee rhamnoses worden geproduceerd door de hydrolyse van elk dRL-molecuul, moet de μM-concentratie van rhamnose die in RL wordt gedetecteerd, worden gedeeld door 2 om hun μM-concentratie te verkrijgen (zie figuur 4).

De meeste P. aeruginosa-stammen produceren echter beide typen RL in verschillende verhoudingen (zoals weergegeven in figuur 2), waardoor het mogelijk is om slechts bij benadering de concentratie van de totale RL te bepalen. Hiermee rekening houdend, hebben we de RL-productie door elke stam als volgt geschat: Voor de PA7-stam, aangezien deze alleen mRL produceert, komt de rhamnose die deel uitmaakt van RL (44,6 μg/ml + 4,5 μg/ml) rechtstreeks overeen met de μM-concentratie (244,78), die de concentratie van deze biosurfactant in de bovenliggende cultuur vertegenwoordigt, aangezien elk RL-molecuul één rhamnosegroep bevat. Voor de PAO1-stam was de gedetecteerde rhamnoseconcentratie echter 111,55 μg/ml + 11,41 μg/ml, maar slechts 30% komt overeen met mRL. Daarom bevat 70% van de RL-moleculen twee rhamnoses per molecuul. Om de concentratie van RL te schatten, werd de μM-rhamnoseconcentratie (612,24) gedeeld door 5, aangezien 1/5 overeenkomt met de μM-concentratie van mRL (122,49) en 2/5 (244,89) met dRL. De geschatte μM-concentratie van RL die door deze stam wordt geproduceerd, is dus 367.39.

Voor de PA14-stam was de gedetecteerde rhamnoseconcentratie 194,39 μg/ml + 11,5 μg/ml, die werd omgerekend naar de μM-concentratie (1.066,9) en gedeeld door 3. Het resultaat vertegenwoordigt de concentratie van elk RL-type, rekening houdend met het feit dat elk type voor 50% werd geproduceerd en dat dRL 2 rhamnoses per molecuul bevat. Deze stam produceert dus 355,63 μM mRL en dezelfde concentratie dRL, wat resulteert in een geschatte μM-concentratie van RL van 711,27, bijna twee keer zoveel als stam PAO1 en bijna drie keer de concentratie geproduceerd door de PA7-stam.

Figuur 1: Chemische samenstelling van de belangrijkste congeneren van mono-rhamnolipiden en di-rhamnolipiden. (A) Mono-rhamnolipiden. (B) Di-rhamnolipiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Detectie van mono-rhamnolipiden en di-rhamnolipiden door middel van dunne-laagchromatografie. (A) Afbeelding van een TLC-plaat met RL-standaarden en de RL geproduceerd door stammen PAO1, PA14, PA7 en de van PAO1 afgeleide ΔrhlA-mutant . (B) Schatting van het aandeel van elk RL-type (mRL en dRL) in elk van de onder (A) geteste monsters, met behulp van ImageJ-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwantificering van de RL-concentratie met behulp van de orcinolmethode. (A) Rhamnoseconcentratie (μg/ml) in RL geëxtraheerd uit de kweeksupernatanten van PAO1 (zwarte balk), PA14 (lichtgrijze balk) en PA7 (donkergrijze balk) stammen. De balken geven de standaarddeviatie aan. (B) De rhamnose-kalibratiecurve voor het experiment weergegeven in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Validatie van de orcinolmethode vergeleken met UPLC-MS/MS voor dRL-kwantificering. (A) De dRL-standaard werd gekwantificeerd met behulp van UPLC-MS/MS. (B) De orcinol-methode vergeleken met de rhamnoseconcentratie uitgedrukt in mM. (C) Dezelfde mM-concentratie van dRL als rhamnose geeft ongeveer tweemaal de extinctie bij 421 nm, zoals verwacht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Detailprotocol om dRL te kwantificeren door UPLC-MS/MS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De meest nauwkeurige methode voor het detecteren en kwantificeren van RL is HPLC in combinatie met massaspectrometrie (MS)^7,8,27; Het vereist echter gespecialiseerde en dure apparatuur die voor veel onderzoekers misschien niet toegankelijk is. De hier beschreven methoden kunnen routinematig worden uitgevoerd met basislaboratoriummaterialen en -apparatuur om RL-concentraties te detecteren en te schatten, maar ze hebben enkele beperkingen, met name hun onnauwkeurigheid bij het bepalen van mRL- en dRL-mengsels. Bovendien moet de voorbereiding van het monster dat wordt gebruikt voor de kwantificering van RL zorgvuldig worden uitgevoerd. Culturen die worden gebruikt voor RL-detectie en -kwantificering mogen zich niet in de late stationaire fase bevinden, aangezien cellen kunnen worden samengevoegd of gelyseerd, wat resulteert in niet-homogene celsuspensies die variabiliteit in de verkregen resultaten kunnen veroorzaken. Bovendien kan cellulair afval de orcinolmethode verstoren.

Nauwkeurige resultaten kunnen worden verkregen wanneer het beschreven protocol wordt uitgevoerd met de juiste controles, zoals een Pseudomonas aeruginosa-stam die geen RL kan produceren (zoals de PAO1 ΔrhlA-mutant ²⁰ die in dit werk wordt gebruikt, Figuur 2). Deze resultaten zijn nuttig voor het karakteriseren van verschillende P. aeruginosa-isolaten ^12,13, het genetisch modificeren van stammen om de RL-productie te verhogen¹⁴, of het bestuderen van de moleculaire genetica van RL-productie door verschillende P. aeruginosa-isolaten ¹².

De hier beschreven methoden kunnen dus worden gebruikt om Pseudomonas aeruginosa-stammen te karakteriseren op hun productie van virulentiefactoren en om hun biotechnologisch potentieel te beoordelen, vooral in de vroege stadia van onderzoek. Het is belangrijk op te merken dat deze methoden niet bedoeld zijn als vervanging voor technieken zoals HPLC/MS, maar eerder als toegankelijke technieken voor initiële stamkarakterisering en genetische manipulatie van P. aeruginosa-stammen .

Bovendien, als de onderzoeksfocus ligt op RL-productie voor biomedische doeleinden, is het van cruciaal belang om te erkennen dat RL-productie slechts een van de vele factoren is die door Pseudomonas aeruginosa worden geproduceerd. Bovendien is het type RL dat wordt geproduceerd of de hoeveelheid van hun productie niet strikt gecorreleerd met de virulentie van een bepaalde stam, aangezien virulentie wordt beïnvloed door meerdere factoren²⁸.

Wat de reproduceerbaarheid van de hier beschreven methoden betreft, moet bijzondere aandacht worden besteed aan het verkrijgen van de organische fasen bij zowel de detectie van RL door TLC (stap 1.6) als de meting van RL met behulp van de orcinolmethode (stap 2.4). Zelfs een kleine hoeveelheid van de andere fase die tijdens de extractie wordt genomen, kan leiden tot aanzienlijke variatie in de verkregen resultaten. De extractie van RL uit het kweeksupernatans is een cruciale stap in het bereiken van betrouwbare en reproduceerbare resultaten met de orcinol-methode. Het is van cruciaal belang dat bij het verzamelen van de organische fase de interfase en de vloeibare fase worden uitgesloten. Als een etherfase niet binnen 3 uur volledig is opgedroogd, bevat deze waarschijnlijk water, waardoor een nieuwe extractie nodig is.

Het gebruik van de orcinol-methode voor RL-kwantificering is besproken, met argumenten tegen de nauwkeurigheid en specificiteit ervan. Er is beweerd dat RL vaak wordt overschat, en de methode is niet specifiek omdat orcinol kan reageren met verschillende suikers, niet alleen rhamnose. De huidige gegevens tonen aan dat als RL efficiënt wordt geëxtraheerd uit de kweeksupernatant, deze techniek specifiek is, zoals blijkt uit het gebrek aan reactie wanneer de rhlA-mutant als negatieve controle wordt gebruikt. Om echter aanvullend bewijs te leveren van de nauwkeurigheid van de detectiemethode van de methode, onafhankelijk van de extractieprocedure, hebben we een dRL-standaard gedetecteerd door UPLC-MS/MS zoals eerder beschreven²⁷, en de verkregen resultaten vergeleken met de orcinolmethode¹⁸ (aanvullend bestand 1, figuur 4A). We vonden, zoals gerapporteerd¹⁸, een zeer goede correlatie tussen de RL-concentratie gemeten met behulp van deze methode, waarbij elke gedetecteerde μM-concentratie van dRL overeenkomt met ongeveer tweemaal de extinctie bij 421 nm als dezelfde rhamnose μM-concentratie (Figuur 4B,C). Dit controle-experiment toont duidelijk de nauwkeurigheid van deze methode voor RL-kwantificering aan.

Vanwege de uitdaging om de concentratie van mRL- en dRL-mengsels te meten met de orcinol-methode, rapporteren de meeste publicaties de resultaten als rhamnose-equivalenten in RL. Deze waarde heeft misschien geen directe correlatie met de werkelijke RL-concentratie, zoals geïllustreerd in de hier gepresenteerde voorbeelden, maar niettemin dient het als een nuttig middel om RL-hoeveelheden onder verschillende omstandigheden te vergelijken, vooral bij gebruik van dezelfde P. aeruginosa-stam .

Er is een alternatieve methode voor mRL- en dRL-kwantificering gerapporteerd, die is gebaseerd op de oplosbaarheid van de hydrofobe kleurstof Victoria Pure Blue BO, die vaak wordt gebruikt in balpennen²⁹. Deze methode is snel en goedkoop. Dit protocol is echter ontwikkeld om de heterologe productie van RL door P. putida te kwantificeren en is niet haalbaar voor gebruik met RL geproduceerd door P. aeruginosa, omdat de expressie van het blauwe toxine pyocyanine deze methode verstoort.

Samenvattend bieden de hier beschreven methoden een levensvatbaar alternatief voor de detectie en kwantificering van RL geproduceerd door P. aeruginosa waarvoor geen geavanceerde en dure apparatuur nodig is. Ze bieden een praktische benadering voor onderzoekers om de RL-productie in verschillende experimentele omgevingen te beoordelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
AZijnzuur	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			Voor het centrifugeren van buizen van 1,5 mL en 50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DROOGON
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASNPIPET	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
ZALZUUR	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Kaliumchloride (0.02M) Ammoniumchloride (0.02M), Peptone (1%), pH 7,4 Geautoclaveerd. Voeg Glucose (5%) en Magnesiumsulfaat (0.0016M) toe
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAIRE TLC-ONTWIKKELINGSTAND	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDES	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROFOTOMETER			VIS
SPRAYAPPARAAT	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
ZWAZUREZUUR	J.T. BAKER	9681-02
TES BUIZEN 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATERBAAD			> 80 °C