Detectie en kwantificering van mono-rhamnolipiden en di-rhamnolipiden geproduceerd door Pseudomonas aeruginosa

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa produceert de rhamnolipide biosurfactanten. Dunnelaagchromatografie detecteert en bepaalt het aandeel mono- en di-rhamnolipiden dat door elke stam wordt geproduceerd. Kwantificering van het totale aantal rhamnolipiden omvat het beoordelen van rhamnose-equivalenten die aanwezig zijn in deze biosurfactanten die worden geëxtraheerd uit de kweeksupernatanten met behulp van de orcinol-methode.

Samenvatting

De milieubacterie Pseudomonas aeruginosa is een opportunistische ziekteverwekker met een hoge antibioticaresistentie die een gevaar voor de gezondheid vormt. Deze bacterie produceert hoge niveaus van biosurfactanten, bekend als rhamnolipiden (RL), dit zijn moleculen met een aanzienlijke biotechnologische waarde, maar die ook in verband worden gebracht met virulentie-eigenschappen. In dit opzicht kan de detectie en kwantificering van RL nuttig zijn voor zowel biotechnologische toepassingen als biomedische onderzoeksprojecten. In dit artikel demonstreren we stap voor stap de techniek om de productie van de twee vormen van RL geproduceerd door P. aeruginosa te detecteren met behulp van dunne-laagchromatografie (TLC): mono-rhamnolipiden (mRL), moleculen gevormd door een dimeer van vetzuren (voornamelijk C10-C10) gekoppeld aan één rhamnosegroep, en di-rhamnolipiden (dRL), moleculen gevormd door een soortgelijk vetzuurdimeer gekoppeld aan twee rhamnosegroepen. Daarnaast presenteren we een methode om de totale hoeveelheid RL te meten op basis van de zure hydrolyse van deze biosurfactanten geëxtraheerd uit een P. aeruginosa cultuur supernatans en de daaropvolgende detectie van de concentratie van rhamnose die reageert met orcinol. De combinatie van beide technieken kan worden gebruikt om de geschatte concentratie van mRL en dRL geproduceerd door een specifieke stam te schatten, zoals hier geïllustreerd met de typestammen PAO1 (fylogroep 1), PA14 (fylogroep 2) en PA7 (fylogroep 3).

Inleiding

Pseudomonas aeruginosa is een omgevingsbacterie en een opportunistische ziekteverwekker die zeer zorgwekkend is vanwege de productie van virulentie-geassocieerde eigenschappen en de hoge antibioticaresistentie ^1,2. Een kenmerkende secundaire metaboliet die door deze bacterie wordt geproduceerd, is de biosurfactant RL, die op een gecoördineerde manier wordt geproduceerd met verschillende virulentie-geassocieerde eigenschappen zoals het fenazine pyocyanine, een antibioticum met redoxactiviteit, en het protease elastase³. De tensioactieve en emulgerende eigen....

Protocol

Deze procedure is geschematiseerd in aanvullende figuur 1. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Detectie van mRL en dRL in kweeksupernatanten van P. aeruginosa met behulp van TLC

1. Begin met de gecentrifugeerde bouillon van de P . aeruginosa-stam van belang, gekweekt in vloeibaar medium gedurende 24 uur (om de stationaire groeifase te bereiken waarin RL wordt geproduceerd). Meestal bevatten deze culturen 1 x 10⁹ bacteriën per ml.
2. Pas de pH van d....

Resultaten

In dit artikel werden drie verschillende stammen van het P. aeruginosa-type gebruikt om drie fylogroepen te vertegenwoordigen, elk met verschillende RL-productieniveaus en verhoudingen van mRL en dRL. Deze stammen omvatten PAO1 (een wondisolaat uit Australië, 1955²²), PA14 (een plantenisolaat uit de VS, 1977²³) en PA7 (een klinisch isolaat uit Argentinië, 2010²⁴). Als negatieve controle werd de PAO1 rhlA-mutant gebruikt, die niet in staat is.......

Discussie

De meest nauwkeurige methode voor het detecteren en kwantificeren van RL is HPLC in combinatie met massaspectrometrie (MS)^7,8,27; Het vereist echter gespecialiseerde en dure apparatuur die voor veel onderzoekers misschien niet toegankelijk is. De hier beschreven methoden kunnen routinematig worden uitgevoerd met basislaboratoriummaterialen en -apparatuur om RL-concentraties te detecteren en te schatten, maar ze hebben enkele bep.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
AZijnzuur	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			Voor het centrifugeren van buizen van 1,5 mL en 50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DROOGON
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASNPIPET	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
ZALZUUR	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Kaliumchloride (0.02M) Ammoniumchloride (0.02M), Peptone (1%), pH 7,4 Geautoclaveerd. Voeg Glucose (5%) en Magnesiumsulfaat (0.0016M) toe
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAIRE TLC-ONTWIKKELINGSTAND	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDES	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROFOTOMETER			VIS
SPRAYAPPARAAT	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
ZWAZUREZUUR	J.T. BAKER	9681-02
TES BUIZEN 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATERBAAD			> 80 °C