Methodenartikel

Geautomatiseerde vibratoomdoorsnede van in agarose ingebed longweefsel voor multiplex fluorescentiebeeldvorming

DOI:

10.3791/65943

⸱

6 oktober 2023

 ,  , 
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een weefselverwerkingstechniek ontwikkeld die gebruik maakt van een vibratoom en in agarose ingebed longweefsel om longsecties te genereren, waardoor het mogelijk wordt om beelden met een hoge resolutie van de longarchitectuur te verkrijgen. We gebruikten immunofluorescentiekleuring om ruimtelijke eiwitexpressie te observeren met behulp van specifieke structurele markers in de longen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege de inherente structurele kwetsbaarheid wordt de long beschouwd als een van de moeilijkere weefsels om te verwerken voor microscopische uitlezingen. Om structurele ondersteuning voor secties toe te voegen, worden stukjes longweefsel gewoonlijk ingebed in paraffine of OCT-verbinding en gesneden met respectievelijk een microtoom of cryostaat. Een recentere techniek, bekend als precisiegesneden longplakjes, voegt structurele ondersteuning toe aan vers longweefsel door middel van agarose-infiltratie en biedt een platform om primair longweefsel in kweek te houden. Vanwege epitoopmaskering en weefselvervorming leent geen van deze technieken zich echter voldoende voor de ontwikkeling van reproduceerbare geavanceerde lichtbeeldvormingsuitlezingen die compatibel zouden zijn met meerdere antilichamen en soorten.

Daartoe hebben we een weefselverwerkingspijplijn ontwikkeld, die gebruik maakt van agarose-inbedding van vast longweefsel, gekoppeld aan geautomatiseerde vibratome-sectie. Dit vergemakkelijkte het genereren van longsecties van 200 μm tot 70 μm dik, in muizen-, varkens- en menselijke longen, die geen antigeenextractie vereisen en de minst "verwerkte" versie van het oorspronkelijke geïsoleerde weefsel vertegenwoordigen. Met behulp van deze plakjes onthullen we een multiplex beeldvormingsuitlezing die in staat is om beelden met een hoge resolutie te genereren waarvan de ruimtelijke eiwitexpressie kan worden gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan longbeschadiging en regeneratie te kwantificeren en beter te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ex vivo plakjes longweefsel worden op grote schaal gebruikt bij de studie van longziekten1. De huidige gouden standaarden, met name in klinische en translationele grote dierstudies, maken gebruik van hematoxyline- en eosinekleuring in combinatie met helderveldmicroscopie en op waarnemer gebaseerde scores om longdisfunctie te beoordelen en te beoordelen 2,3. Hoewel het nog steeds een waardevolle techniek is, vertoont het beperkingen op het gebied van ruimtelijke resolutie en het aantal markers dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld. Bovendien moet longweefsel uitgebreide wasbeurten op basis van oplosmiddelen ondergaan, wat resulteert in uitdroging, krimp en rehydratatie van het weefsel vóór de definitieve beeldvorming4. Dit proces is niet alleen tijdrovend, maar ook milieuonvriendelijk, maskeert eiwitepitopen en kan structurele weefselveranderingen veroorzaken 5,6,7,8. Voor longweefsel was inbedding in paraffine voorafgaand aan secties echter een noodzaak vanwege de structurele kwetsbaarheid van de long. Daarentegen kunnen vaste organen zoals de hersenen worden doorgesneden met behulp van een vibrerend microtoom (vibratoom), zowel in vast als vers weefsel 9,10,11,12.

Om vibratome-secties in longweefsel mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld die precisie-gesneden longplakjes (PCLS) wordt genoemd, waarbij agarose met een laag smeltpunt via de luchtwegen of bloedvaten in vers longweefsel wordt geïnjecteerd en wordt gestold13,14. De agarose in de luchtwegen biedt voldoende structurele ondersteuning om vervolgens vibratoomdoorsnede 9,14 mogelijk te maken. Bij knaagdieren is dit eenvoudig te bereiken omdat agarose via de luchtpijp kan worden geïnjecteerd; In varkens- en menselijk weefsel kan het echter een uitdaging zijn om een geschikte luchtweg/vat te vinden binnen een bepaalde biopsie15,16. Bovendien, zelfs als een dergelijke luchtweg/bloedvat zich bevindt, is er meestal aanzienlijke kracht nodig om de agarose te injecteren, wat de latere longmorfologie kan beïnvloeden17.

Om de uitdagingen op het gebied van paraffine-inbedding/secties/kleuring en de PCLS-workflow het hoofd te bieden, hebben we een nieuwe verwerkingspijplijn voor vast longweefsel opgezet. Deze workflow maakt het gebruik van een vibratoom voor secties mogelijk, kan dunnere plakjes produceren dan in PCLS en levert plakjes op waarvoor geen antigeenextractie nodig is voor multiplex fluorescentiebeeldvorming. Deze methode biedt een middel tot "minimale verwerking" om longsecties te genereren die kunnen worden gebruikt in geavanceerde lichtmicroscopie. Bovendien kunnen beeldvormingsuitlezingen worden gebruikt om de ruimtelijke relaties van cellen en anatomische structuren in het longweefsel aan te tonen door de volumetrische architectuur van het weefsel vast te leggen 18,19,20,21. Dit artikel beschrijft het protocol om deze longsecties te genereren en demonstreert multiplexkleuringen die op elk van deze weefsels worden aangebracht en hoe deze geavanceerde beeldvormingsgegevens kunnen worden gebruikt voor kwantificering.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizenlongen werden gedoneerd door onderzoekers die andere orgaansystemen gebruikten in een poging om de 3 V's te handhaven. Alle procedures bij varkens werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU en werden goedgekeurd door de Malmö-Lund Ethische Commissie voor Dierproeven (Dnr 5.8.18-05527/2019) en uitgevoerd volgens de CODEX-richtlijnen van de Zweedse Onderzoeksraad. Goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters werd verleend door de Zweedse nationale ethische commissie (Dnr 2020-07115 en Dnr 2020-01864). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van oplossingen en materialen

  1. Fixeer het longweefsel in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 48 uur. Breng vervolgens het longweefsel over in een kegelvormige buis van 50 ml gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,01% natriumazide bevat.
  2. Bereid een agarose-oplossing van 3% (m/v) door 1,5 g agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 50 ml steriele PBS. Zet een plastic beker, een fijne pincet en een steriele schaar klaar.
  3. Verwarm de agarose in de magnetron tot het kookt en laat het vervolgens afkoelen tot 42 °C in een waterbad. Bewaar de agarose in vloeibare vorm door deze tot gebruik in het waterbad te bewaren.
    NOTITIE: Houd tijdens het verwarmen van de agarose de magnetron in de gaten totdat deze begint te koken, zodat deze niet overloopt. Dit duurt meestal ongeveer 1,5 minuut.

2. Longweefsel ingebed in agarose

  1. Til de longbiopsie uit de PBS-azide en ontleed de longkwabben voorzichtig met een fijne pincet en een steriele schaar. Snijd de longkwab in kleinere blokjes.
    OPMERKING: Hoewel secties met borstvlies mogelijk zijn, kunnen de dikke elastinebundels het snijden met het vibratomemes belemmeren. Daarom raden we aan om het te verwijderen als het niet nodig is.
  2. Snijd een plastic beker door het midden en voeg een kleine hoeveelheid agarose toe aan de bodem. Plaats het deksel van een conische buis van 50 ml (rand verwijderd) op het oppervlak van de agarose en bewaar de beker gedurende 5 minuten bij 4 °C om de agarose te laten stollen voor later gebruik.
  3. Haal de plastic beker uit de koelkast van 4 °C, voeg ongeveer 1 ml vloeibare agarose toe aan het deksel en plaats het longweefselblok voorzichtig op het deksel. Laat de agarose 2-3 minuten half stollen bij kamertemperatuur. Giet vervolgens langzaam de vloeibare agarose op het longweefsel totdat het volledig is ondergedompeld.
  4. Zet ongeveer 15 minuten in de koelkast bij 4 °C tot de agarose stolt. Gebruik vervolgens voorzichtig een scherp mes om extra agarose rond het longweefsel te verwijderen, zodat er een uniforme laag van ongeveer 5 mm dikte rond het weefsel overblijft (Figuur 1).

3. Snijden van longweefselsecties

  1. Om het longweefsel voor te bereiden op sectie, bevestigt u elk weefselblok met superlijm op de monsterschijf van het vibratoom. Vul vervolgens de vibratomebufferbak met PBS en plaats ijs in het omringende ijsbad. Installeer ten slotte de sampleschijf voorzichtig in de bufferlade.
  2. Snijd het longweefsel met het vibratoom met de volgende instellingen: dikte: 200 μm, frequentie: 100 Hz, amplitude van het mes: 1,3 mm en voorwaartse snelheid van het mes van 0,02-0,03 mm/s, afhankelijk van de weefselstijfheid.
    OPMERKING: Snijden is mogelijk tot een dikte van 70 μm als de messnelheid wordt verlaagd tot 0.01 mm/s. Bepaalde vibratomen (bijv. Leica V1200s) maken automatisering van secties mogelijk door een snijvenster in te stellen.
  3. Om secties te verzamelen, brengt u het weefselplakje voorzichtig over door het met een borstel uit de vibratomebak te scheppen in een plaat met 24 putjes gevuld met 0.01% azide in PBS. Bewaar ten slotte de longplakken bij 4 °C.

4. Immunokleuring van elastine, CD31, HTII-280 en SMA

  1. Permeabiliseren en blokkeren (1% runderserumalbumine + 0,5% Triton + 5% normaal geitenserum) het weefsel bij 4 °C onder zacht schudden gedurende 45 min.
  2. Verdun de primaire antilichamen (SMA 1:500; elastine 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) in PBS, voeg 300 μL per putje toe en incubeer een nacht bij 4 °C onder zacht schudden.
  3. Zonder het plakje aan te raken en de primaire antilichamen te verwijderen met een pipetpunt, was 3 x 20 min (400 μL) met PBS.
  4. Verdun de secundaire antilichamen (1:1000) in PBS, voeg 300 μl per putje toe en incubeer bij 4 °C onder zacht schudden gedurende 90 min.
  5. Verwijder de secundaire antilichamen met een pipetpunt, voeg 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)(1:1000) en tomatenlectine-488 (1:500) toe gedurende een incubatie van 30 minuten en was gedurende 3 x 10 minuten met PBS.
  6. Plaats drie druppels montagemedium op het objectglaasje, monteer een dekglaasje en ga verder met beeldvorming.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het proces van het genereren van plakjes longweefsel omvat verschillende belangrijke stappen, waaronder voorbereiding, inbedding en sectie. De agarose-oplossing (3% (m/v) wordt gemaakt door 1,5 g agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 50 ml steriele PBS. Verbruiksartikelen die nodig zijn, zijn onder meer een plastic beker, een deksel van een conische buis van 50 ml (rand verwijderd), een tang en een schaar. Het longweefsel wordt zorgvuldig in kleinere blokken verwijderd met een fijne pincet en een steriele schaar (Figuur 1A,B). Om de longweefselblokken in te bedden, wordt vervolgens de bodem van de beker gevuld met een kleine hoeveelheid agarose, wordt een deksel op het oppervlak van de agarose geplaatst en wordt de beker gedurende 5 minuten bij 4 °C bewaard (figuur 1C). Ongeveer 1 ml vloeibare agarose wordt aan het deksel toegevoegd en het longweefselblok wordt op het deksel geplaatst. De agarose wordt 2-3 minuten gelaten om bij kamertemperatuur halfgestold te worden (Figuur 1D). Zodra een longblok op zijn plaats wordt gehouden door de halfgestolde agarose, wordt vloeibare agarose in de beker gegoten totdat het longweefselblok volledig is ondergedompeld. Dit wordt gedurende 15 minuten bij 4 °C bewaard (Figuur 1E,F). De agarose-inbedding met laag smeltpunt zorgt voor de nodige ondersteuning en stijfheid van het longweefsel, waardoor de oorspronkelijke architectuur tijdens het snijproces behouden blijft. Een scherp mes wordt gebruikt om overtollige agarose rond het longweefsel te verwijderen. Er blijft een uniforme laag van ongeveer 5 mm dikte achter rond het weefsel (figuur 1G). Het weggesneden longweefselblok wordt vervolgens voorzichtig op de weefselhouder gelijmd (figuur 1H). De vibratoombufferbak wordt gevuld met PBS, ijs wordt in het omringende ijsbad geplaatst en de sampleschijf wordt in de bufferbak geïnstalleerd (Figuur 1I). De trillingssnijparameters die op het paneel waren ingesteld, waren: plakdikte: 200 μm; frequentie: 100 Hz; amplitude van het blad: 1,3 mm; voorwaartse snelheid van het blad: 0,02-0,03 mm/s, afhankelijk van de weefselstijfheid (Figuur 1J). Ten slotte wordt de kleuring uitgevoerd op vrij zwevende plakjes (Figuur 1K-M).

Immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd in secties van 200 μm van elke soort voor gladde spieractine (SMA, een marker voor gladde spiercellen en myofibroblasten), elastine (extracellulair matrixeiwit) en Lycopersicon Esculentum-lectine (LEA), dat bindt aan bronchoalveolaire epitheelcellen. De long is een structureel heterogeen weefsel en als zodanig wordt differentiële SMA- en elastineverdeling waargenomen over structuren, waaronder alveolaire kanalen, bloedvaten, intrapulmonale bronchiolen en longblaasjes van muizen, varkens en mensen (Figuur 2A-L). Een weergave met hoge resolutie van een volume van 20 μm van een bronchiol laat zien hoe fijne structuren in de long kunnen worden onderzocht op een semi-driedimensionaal niveau (Supplemental Video S1). Als kwantitatief voorbeeld, met behulp van beeldtracering, laten we zien hoe de grootte van de longblaasjes verschilt tussen monsters (n = 20 longblaasjes) (Figuur 2L,M).

Om te laten zien hoe het mogelijk is om deze geavanceerde beeldvormingsgegevens kwantitatief te gebruiken, vergeleken we type 2 pneumocyt (TII) celdistributies in menselijk longweefsel van een volwassene en een zuigeling. Het mensspecifieke type 2 alveolaire celantilichaam, HTII-280, heeft een sterke affiniteit met het oppervlak van menselijke type 2-cellen (Figuur 3A-F). Deze cellen kunnen verder worden bekeken in de driedimensionale ruimte van een enkele longblaasje met behulp van volumetrische beeldvorming (Supplemental Video S2). Om het TII-getal tussen de monsters van volwassenen en baby's te kwantificeren, hebben we de HTII-280-telling verwerkt over 10 willekeurige gezichtsvelden (fov). Tussen deze monsters leverde het zuigelingenmonster een significant hoger aantal TII-cellen op (Figuur 3G). Het monster van de baby vertoonde echter ook een significant hogere steigerdekking dan de volwassene, wat het hogere aantal cellen zou kunnen verklaren (Figuur 3H). Om hier rekening mee te houden, beoordeelden we vervolgens het aantal TII's op basis van de dekking van de steiger, als cellen per mm2 weefsel, die nog steeds een significant hoger aantal TII's in het babymonster behielden (Figuur 3I). Het hogere aantal TII's in het zuigelingenmonster is dus niet te wijten aan een grotere steigerdekking en benadrukt het belang van het beoordelen van celverdelingen in de longen op basis van het gebied van de steiger, niet de algehele fov.

figure-results-1
Figuur 1: Protocol voor het snijden van plakjes longweefsel. (A) De oplossingen en materialen: een agaroseoplossing van 3% (m/v) verkregen door 1,5 g agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 50 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing; een plastic beker; een deksel van een conische buis van 50 ml; tang en schaar. (B) De longweefsels werden ontleed met behulp van een fijne pincet en een steriele schaar. (C) Vul de bodem van de beker met een kleine hoeveelheid agarose en plaats het deksel op het oppervlak van de agarose; bewaar het vervolgens bij 4 °C gedurende 5 min. (D) Voeg langzaam 1-2 ml vloeibare agarose toe aan het deksel, plaats het longweefselstuk voorzichtig op het deksel en bewaar het gedurende 2 minuten bij 4 °C. (E,F) Giet de vloeibare agarose in de beker totdat het longweefselstuk volledig is ondergedompeld, bewaar het bij 4 °C gedurende 15 minuten, en breek dan voorzichtig de plastic beker. (G) Gebruik een scherp mes om overtollige agarose rond het longweefsel te verwijderen, zodat er een uniforme laag van ongeveer 5 mm dikte rond het weefsel overblijft. (H) Het weggesneden longweefselblok wordt vervolgens zorgvuldig op de weefselhouder gelijmd. (I) Vul de vibratomebufferbak met PBS, plaats ijs in het omringende ijsbad en installeer de sampleschijf in de bufferbak. (J) Stel snijparameters in op het paneel van de vibratoom; plakdikte: 200 μm, frequentie: 100 Hz, amplitude van het mes: 1,3 mm en voorwaartse snelheid van het lemmet van 0,02-0,04 mm/s. (KM) Representatieve afbeeldingen van een vrij zwevende plak die nog steeds is ingebed in agarose en klaar is voor immunofluorescentiekleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunofluorescentiebeelden van de longstructuur bij mensen, varkens en muizen. (A-L) Representatieve beelden van een alveolair kanaal, bloedvat, bronchiol en longblaasjes in plakjes longweefsel van respectievelijk muis, varken en mens. SMA (weergegeven in groen) is een marker voor gladde spiercellen en wordt waargenomen in de vasculaire en bronchiale wanden van longweefsel. Elastine (weergegeven in rood) maakt deel uit van de extracellulaire matrix van de longen. (M) Kwantificering van de alveolaire grootte door 20 willekeurige posities op elke longweefselplak te selecteren voor zowel mensen-, varkens- als muismonsters. Histogrammen werden gebruikt om de verdeling van de alveolaire grootte binnen elke groep te illustreren. Schaalbalken = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Kruskall-Wallis-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectine; SMA = gladde spieractine; ms = muis; HMN = mens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Verdeling van pneumocyten type 2 in monsters van volwassenen en zuigelingen. (A,B) Representatieve beelden van menselijk longweefsel bij volwassenen en zuigelingen gekleurd voor HTII-280 (weergegeven in rood), CD31 (weergegeven in groen) en LEA (weergegeven in grijs). (C,D) Representatieve beelden van volwassen en zuigelingen die alleen de verdeling van pneumocyten type 2 laten zien. (E,F) Representatieve beelden met eencellige resolutie van een individuele pneumocyt van type 2 uit menselijke longmonsters van volwassenen en zuigelingen. G) Kwantificering van het aantal pneumocyten van type 2 tussen monsters van volwassenen en zuigelingen. (H) Kwantificering van de dekking van het scaffoldoppervlak van het longweefsel (% versus lucht) in monsters van volwassenen en zuigelingen. (I) Kwantificering van pneumocyt type 2 per mm2 weefsel in monsters van volwassenen en zuigelingen. Schaalbalken = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 FOV per monster. Ongepaarde t-test of Mann-Whitney-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Afkortingen: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectine; HTII = menselijke type II cellen; CD31 = Adhesiemolecuul-1 van bloedplaatjes in endotheelcellen-1/cluster van differentiatie 31; FOV = gezichtsveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video S1: Video van 20 μm beeldvormingsvolume van een enkele varkensluchtweg gekleurd met DAPI, LEA, SMA en elastine met een beeld met hoge resolutie van de structuur van luchtwegwandelementen. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectine; SMA = gladde spier actine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S2: Video van 30 μm beeldvormingsvolume van een enkele longblaasje gekleurd met DAPI, LEA en HTII-280 die de verdeling van type 2 pneumocyten over de structuur laat zien. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectine; SMA = gladde spier actine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol presenteren we een verbeterde op vibratomen gebaseerde methode voor het genereren van longsecties. In vergelijking met verwerkingstechnieken op basis van paraffine is deze methode kosteneffectiever, tijdbesparend en beter voor het milieu22. Bovendien helpt deze methode de structurele integriteit van plakjes longweefsel te behouden en maakt het geavanceerde immunofluorescentiebeeldvorming mogelijk zonder dat antigeen hoeft te worden opgehaald. Tijdens onze experimenten vonden we echter ook bepaalde beperkingen aan deze workflow. Zieke longen kunnen het snijproces verstoren als gevolg van weefselvernietiging veroorzaakt door pathologische veranderingen. Tijdens het gebruik van het vibratoom voor secties kunnen luchtwegobstructies en ernstig fibrotisch longweefsel het mes belemmeren, waardoor het proces van het snijden van deze weefsels een grotere uitdaging wordt. Dit kan echter worden ondervangen door de messnelheid te verlagen en het weefsel te ondersteunen met een fijn penseel. Soortgelijke uitdagingen komen voort uit de verdikking van het borstvlies, wat een veel voorkomende uitkomst is bij pleuritis, chronische obstructieve longziekte (COPD) en idiopathische longfibrose (IPF)23,24,25. Als het borstvlies niet interessant is voor een experiment, raden we aan om het te verwijderen voordat het wordt doorgesneden of door een longvolume uit de buurt van het borstvlies te isoleren. Als het borstvlies nodig is, kan het worden gesneden met behulp van een vergelijkbare manipulatie als hierboven, met lagere messnelheden en snijondersteuning van een fijne borstel.

Hoewel nauwkeurig gesneden longplakjes de driedimensionale architectuur en de oorspronkelijke omgeving van de longkunnen behouden 26, is het belangrijk op te merken dat het genereren van PCLS een complex en tijdrovend proces is. Het succes van het genereren van plakjes longweefsel hangt sterk af van de efficiëntie van agarosevulling, die op zijn beurt wordt beïnvloed door de aanwezigheid van intact borstvlies en levensvatbare injectieplaatsen in het verkregen weefsel. Dit is eenvoudig te bereiken bij knaagdieren, omdat agarose gemakkelijk via de luchtpijp in intacte longen kan worden ingebracht27,28,29. In groot dieronderzoek zijn biopsieën die tijdens een experiment worden genomen echter meestal afkomstig van distale longsegmenten, die geen luchtweg hebben die groot genoeg is om te cannuleren30,31. Dus in plaats van agarose in de bronchus of bloedvaten te injecteren, passen we deze methode toe waarbij longweefsel, ongeacht de soort van herkomst of het monstervolume, wordt ingebed in agarose met een laag smeltpunt om plakjes longweefsel te genereren. Deze aanpak is technisch eenvoudiger en heeft tot doel weefselschade zoveel mogelijk te minimaliseren. Op basis van onze ervaring heeft deze methode een hogere efficiëntie en gemak aangetoond bij het genereren van longweefselsecties. Het behoudt effectief de morfologie van longblaasjes en is bijzonder geschikt voor het snijden van longweefsel, waardoor herhaalbare multiplexfluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie kan worden gegenereerd.

In deze studie demonstreren we verder twee op steekproeven gebaseerde kwantificeringen voor de gegenereerde beeldvormingsgegevens. De eerste maakte gebruik van beeldtracering om verschillen in alveolaire grootte tussen soortmonsters te beoordelen. Het is niet verwonderlijk dat longblaasjes van muizen de kleinste waren, terwijl varkens- en menselijke longblaasjes vergelijkbaar in grootte waren, wat varkens benadrukte als een interessant translationeel model voor longonderzoek.

Voor de tweede kwantificering vergeleken we de HTII-verdeling tussen een longmonster voor volwassenen en een baby. Type 2 pneumocyten spelen een vitale rol in de structuur van het distale longepitheel. Dit unieke vermogen van TII's draagt bij aan het herstel en de regeneratie van het alveolaire epitheel32. In de gezonde volwassen menselijke long vertegenwoordigen TII's ongeveer 15% van de totale celpopulatie, terwijl hun dekking van het alveolaire oppervlak wordt geschat op ongeveer 5%33. HTII-280 is een algemeen erkende longspecifieke marker voor het bestuderen van de ontwikkeling en respons van alveolaire epitheelcellen op letsel, en het is specifiek gelokaliseerd in de apicale plasmamembranen van TII's. In het experiment werd volwassen weefsel verkregen van een donorpatiënt die stierf als gevolg van intracerebrale bloeding en gelijktijdig longletsel had, terwijl het babymonster afkomstig was van een verstikkingsgerelateerde mortaliteit. Onze bevindingen geven aan dat de expressie van HTII-280 significant lager was in het volwassen longmonster dan in het zuigelingenmonster. Interessant is dat, hoewel HTII-280 tot expressie komt in de meeste HTII's, de expressie ervan ook kan worden beïnvloed door de weefselkwaliteit en dat het aanzienlijk wordt verminderd in gewond menselijk longweefsel34. Verouderd longweefsel vertoont een significante afname van het aantal en de secretoire activiteit van TII's in vergelijking met jonge weefsels, en oudere personen vertonen aanzienlijk lagere proliferatie, secretie en anti-apoptotische activiteit van TII's in vergelijking met die jonge weefsels35. In overeenstemming hiermee zou de identificatie en detectie van een celoppervlakeiwit dat specifiek is voor menselijke TII's kunnen helpen bij het beoordelen van de ernst van longletsel en het evalueren van behandelingsbenaderingen die gericht zijn op het verbeteren van longherstel36,37. Met behulp van deze pijplijn zou het dus van groot belang zijn om alveolaire TII-onderzoeken uit te voeren in grotere menselijke cohorten van gezondheid en ziekte.

Kortom, dit protocol biedt een snellere en eenvoudigere aanpak voor het snijden van longweefsel. Deze methode geeft gedetailleerde instructies voor het prepareren, snijden en kleuren van longweefsel, waardoor het behoud van de intacte longweefselstructuur wordt gegarandeerd. Het optimaliseert het model voor het bestuderen van zowel gezonde als zieke longarchitectuur, wat leidt tot verbeterde experimentele efficiëntie. Al met al introduceert deze studie een veelbelovende benadering om complexe ruimtelijke biologie in de pathofysiologie van longweefsel bij verschillende soorten te onderzoeken, wat kan helpen om de moleculaire mechanismen die een rol spelen bij ziekte en herstel beter te begrijpen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar voor de financiering die ze hebben ontvangen van de Wallenberg Molecular Medicine Foundation en het Stem Cell Center van de Universiteit van Lund en erkennen het Lund University Bioimaging Centre (LBIC) voor toegang tot de Nikon A1RHD.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24 well tissue culture insertsSARSTEDT83.3932.300
4% paraformaldehydeSOLVECO6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher scientificD1306
50 mL Falcon tube SARSTEDT2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31)Abcamab28364
Confocal microscope NikonA1R HD25
ElastinAbcamab23747
Epredia X1000 CoverslipThermo Fisher scientific10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher scientific10149870
ForcepsAESCULAPFB395R
Goat anti-mouse 647 Invitrogen A21235
Goat anti-rabbit 568Invitrogen A11011
Human type II cellsTerrace BiotechTB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting MediumThermo Fisher scientificE41473
Low gelling temperature AgaroseSigma-Aldrich1003467046
Lycopersicon Esculentum lectinThermo Fisher scientific2531965
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher scientific50-100-8798
Plastic cupkontorsgiganten885221
ScissorsSTILLE101-8380-18
Smooth muscle actinAbcamab5694
Sodium azideSigma-AldrichK54329188239
Super glueLOCTITE2721643
Vibrating microtomeLeicaVT1200S

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493(2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815(2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376(2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2(2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36(2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889(2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348(2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016(2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970(2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465(2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392(2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566(2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inbedding in agaroselongweefselsnijdenimmunofluorescentiekleuringruimtelijke eiwitexpressielight sheetmicroscopielongtransplantatiemodelantigeenhersteltype 2 pneumocyten

Gerelateerde artikelen