Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie en analyse van myogene voorlopercellen in vivo tijdens acuut skeletspierletsel door hoogdimensionale eencellige massacytometrie

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65944

⸱

1 december 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University

In dit artikel

Samenvatting

Het hier gepresenteerde protocol maakt de identificatie en hoogdimensionale analyse van spierstam- en voorlopercellen mogelijk door middel van eencellige massacytometrie en hun zuivering door FACS voor diepgaande studies van hun functie. Deze benadering kan worden toegepast om de regeneratiedynamiek in ziektemodellen te bestuderen en de werkzaamheid van farmacologische interventies te testen.

Samenvatting

Skeletspierregeneratie is een dynamisch proces dat wordt aangedreven door volwassen spierstamcellen en hun nageslacht. Meestal in rust in een stabiele toestand, worden volwassen spierstamcellen geactiveerd bij spierletsel. Na activering vermenigvuldigen ze zich en de meeste van hun nakomelingen differentiëren zich om fusiecompetente spiercellen te genereren, terwijl de rest zichzelf vernieuwt om de stamcelpool aan te vullen. Terwijl de identiteit van spierstamcellen meer dan tien jaar geleden werd gedefinieerd, op basis van de co-expressie van celoppervlaktemarkers, werden myogene voorlopercellen pas onlangs geïdentificeerd met behulp van hoogdimensionale single-cell-benaderingen. Hier presenteren we een single-cell massacytometrie (cytometrie door time of flight [CyTOF]) methode om stamcellen en voorlopercellen bij acuut spierletsel te analyseren om de cellulaire en moleculaire dynamiek op te lossen die zich ontvouwt tijdens spierregeneratie. Deze aanpak is gebaseerd op de gelijktijdige detectie van nieuwe celoppervlaktemarkers en belangrijke myogene transcriptiefactoren waarvan de dynamische expressie de identificatie mogelijk maakt van geactiveerde stamcellen en voorlopercelpopulaties die mijlpalen van myogenese vertegenwoordigen. Belangrijk is dat een sorteerstrategie wordt beschreven die gebaseerd is op het detecteren van celoppervlaktemarkers CD9 en CD104, waardoor prospectieve isolatie van spierstam- en voorlopercellen mogelijk wordt met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor diepgaande studies van hun functie. Spiervoorlopercellen vormen een cruciale ontbrekende schakel om de controle van het lot van spierstamcellen te bestuderen, nieuwe therapeutische doelen voor spierziekten te identificeren en celtherapietoepassingen voor regeneratieve geneeskunde te ontwikkelen. De hier gepresenteerde benadering kan worden toegepast om spierstam- en voorlopercellen in vivo te bestuderen als reactie op verstoringen, zoals farmacologische interventies gericht op specifieke signaalroutes. Het kan ook worden gebruikt om de dynamiek van spierstam- en voorlopercellen in diermodellen van spierziekten te onderzoeken, ons begrip van stamcelziekten te vergroten en de ontwikkeling van therapieën te versnellen.

Inleiding

Skeletspieren vormen het grootste weefsel in massa in het lichaam en reguleren meerdere functies, van zicht tot ademhaling, van houding tot beweging, evenals metabolisme1. Daarom is het behoud van de integriteit en functie van de skeletspieren van cruciaal belang voor de gezondheid. Skeletspierweefsel, dat bestaat uit dicht opeengepakte bundels van meerkernige myovezels omgeven door een complex netwerk van zenuwen en bloedvaten, vertoont een opmerkelijk regeneratief potentieel 1,2.

De belangrijkste aanjagers van skeletspierregeneratie zijn volwassen spierstamcellen (MuSC's). Ook bekend als satellietcellen, vanwege hun unieke anatomische locatie naast het plasmamembraan van de myofiber en onder de basale lamina, werden ze voor het eerst geïdentificeerd in 19613. MuSC's brengen een unieke moleculaire marker tot expressie, de transcriptiefactor gepaarde box 7 (Pax7)4. Meestal in rust bij gezonde volwassenen, worden ze geactiveerd bij spierblessure en prolifereren ze om nakomelingen voort te brengen die (i) differentiëren in fusiecompetente spiercellen die nieuwe myofibers zullen vormen om spierschade te herstellen of (ii) zichzelf vernieuwen om de stamcelpool aan te vullen5.

Op cellulair en moleculair niveau is het regeneratieproces vrij dynamisch en omvat het overgangen van celtoestand, gekenmerkt door de gecoördineerde expressie van belangrijke myogene transcriptiefactoren, ook bekend als myogene regulerende factoren (MRF's)6,7. Eerdere in vivo ontwikkelingsstudies, experimenten met het traceren van afstammingslijnen en celkweekwerk met behulp van myoblasten hebben aangetoond dat sequentiële expressie van deze transcriptiefactoren myogenese stimuleert, waarbij myogene factor 5 (Myf5) tot expressie wordt gebracht bij activering, myogene differentiatie 1 (MyoD1) expressie markeert toewijding aan het myogene programma, en myogenine (MyoG) expressiemarkeringdifferentiatie 8,9,10,11, 12,13,14. Ondanks deze kennis en de ontdekking van markers op het celoppervlak om MuSC's te zuiveren, ontbreken strategieën en hulpmiddelen om discrete populaties langs het myogene differentiatiepad te identificeren en te isoleren en een myogene progressie in vivo op te lossen 15,16,17,18.

Hier presenteren we een nieuwe methode, gebaseerd op recent gepubliceerd onderzoek, die de identificatie van stam- en voorlopercellen in skeletspieren en de analyse van hun cellulaire, moleculaire en proliferatiedynamiek in de context van acuut spierletsel mogelijk maakt19. Deze benadering is gebaseerd op eencellige massacytometrie (ook bekend als cytometrie door Time of Flight [CyTOF]) om tegelijkertijd belangrijke celoppervlaktemarkers (α 7-integrine, CD9, CD44, CD98 en CD104), intracellulaire myogene transcriptiefactoren (Pax7, Myf5, MyoD en MyoG) en een nucleoside-analoog (5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU) te detecteren om cellen in S-fase19,20 te monitoren, 21,22,23. Bovendien presenteert het protocol een strategie gebaseerd op de detectie van twee celoppervlaktemarkers, CD9 en CD104, om deze celpopulaties te zuiveren door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), waardoor toekomstige diepgaande studies van hun functie in de context van letsel en spierziekten mogelijk worden. Hoewel primaire myoblasten in het verleden op grote schaal zijn gebruikt om de late stadia van myogene differentiatie in vitro te bestuderen, is het niet bekend of ze de moleculaire toestand van spiervoorlopercellen die in vivo worden aangetroffen recapituleren 24,25,26,27,28,29,30 . De productie van myoblasten is arbeidsintensief en tijdrovend, en de moleculaire toestand van deze primaire cultuur verandert snel bij het passeren van31. Daarom zullen vers geïsoleerde myogene voorlopers die met deze methode zijn gezuiverd, een meer fysiologisch systeem bieden om myogenese en het effect van genetische of farmacologische manipulaties ex-vivo te bestuderen.

Het hier gepresenteerde protocol kan worden toegepast om een verscheidenheid aan onderzoeksvragen te beantwoorden, bijvoorbeeld om de dynamiek van het myogene compartiment in vivo te bestuderen in diermodellen van spierziekten, als reactie op acute genetische manipulaties of bij farmacologische interventies, waardoor ons begrip van spierstamceldisfunctie in verschillende biologische contexten wordt verdiept en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies wordt vergemakkelijkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door de Deense inspectie voor dierproeven (protocol # 2022-15-0201-01293) en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Universiteit van Aarhus. Analgesie (buprenorfine) wordt 24 uur voor verwonding in drinkwater toegediend zodat de muizen zich aan de smaak kunnen aanpassen. De toediening van buprenorfine in het drinkwater wordt gedurende 24 uur na het letsel voortgezet. Samen met een subcutane (s.c.) injectie van buprenorfine op het moment van acuut spierletsel, zal buprenorfine in het drinkwater na injectie met notexine de pijn verlichten die gepaard gaat met het letsel. Hoewel het wordt aanbevolen om een s.c. injectie van buprenorfine toe te dienen op het moment van acuut spierletsel, gevolgd door buprenorfine in het drinkwater, is buprenorfine in het drinkwater voorafgaand aan het letsel optioneel. Onderzoekers moeten zich echter houden aan de dierenwelzijnsnormen en -richtlijnen die zijn opgesteld door de betreffende regelgevende instantie.

OPMERKING: Voor experimenten met eencellige massacytometrie (CyTOF) van geblesseerde achterpootspieren, begint u bij sectie 1: Analgesie in water 24 uur voorafgaand aan spierletsel tot 24 uur na het letsel. Voor het sorteren van spierstam- en voorlopercellen van niet-gewonde muizen, voert u secties 5 en 6 uit: Euthanasie + Skeletspierdissectie en dissociatie, en gaat u verder met sectie 11: Kleuring met fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voor FACS. Een overzicht van de experimentele opzet en het protocol is weergegeven in figuur 1.

1. Analgesie in water 24 uur voor spierblessure tot 24 uur na blessure

  1. Voeg aan een in donkere of aluminiumfolie verpakte drinkfles 3 ml buprenorfine (0,3 mg/ml) toe en vul tot 100 ml met gefilterd water om een eindconcentratie van 0,009 mg/ml 24 uur voor het letsel te bereiken. Bevestig aan de muizenkooi.
  2. Verwijder de drinkfles 24 uur na het letsel en sluit de muizenkooi weer aan op het drinkkleppensysteem.

2. Voorbereiding op de procedure voor acuut letsel

NOTITIE: Gebruik 70% ethanol om de werkbank, de opstelling van de neuskegel en de inductiebox te desinfecteren.

  1. Bereid een tube van 1,5 ml met verdunde notexine in PBS (5 μg/ml). Verdun buprenorfine (0,3 mg/ml) in steriele 0,9% zoutoplossing tot 0,015 mg/ml in een lichtveilige tube van 1,5 ml. Blijf op het ijs. Bereid insulinespuiten voor injecties met buprenorfine (28 G, 0,5 ml) en notexine (29 G, 0,3 ml) voor.
  2. Configureer anesthesie-eenheden op basis van isofluraan:
    1. Gebruik voor anesthesie in een inductiebox 3% isofluraan met een debiet van 1,5 l/min (50% O2, 50% atmosferische lucht).
    2. Gebruik voor onderhoud met behulp van een neuskegelopstelling 1,5% isofluraan met een debiet van 0,6 l/min (50% O2, 50% atmosferische lucht).

3. Acuut letsel door injectie met notexine

LET OP: Notexin heeft fosfolipase A2-activiteit en is het belangrijkste bestanddeel van gif van de Australische tijgerslang (Notechis scutatus), met een intraveneuze LD50 van 5-17 mg notexine/kg bij muizen32,33. In het huidige protocol wordt de Tibialis Anterior (TA) spier van elke achterpoot geïnjecteerd met 10 μL 5 mg/ml notexine, en de Gastrocnemius (GA) spier van elke achterpoot wordt tweemaal geïnjecteerd (één keer in elke kop van de spier) met 15 μL 5 mg/ml notexine. Het is belangrijk om de intramusculaire (i.m.) injecties correct uit te voeren om de schade te beperken en de geïnjecteerde dieren regelmatig te inspecteren om minimale pijn te garanderen.

  1. Verdoof de muis in de inductiebox (3% isofluraan). Wanneer de muis bewusteloos is, verlaagt u het isofluraangehalte tot 1,5% in de inductiebox.
  2. Weeg en markeer de muizen individueel volgens door de instelling goedgekeurde procedures. Scheer onder de opstelling van de neuskegel de achterpoten met een trimmer en breng ze terug naar de inductiebox.
  3. Bereken het buprenorfinevolume voor elke muis : figure-protocol-1
  4. Meng de notexinoplossing door op en neer te pipetteren. Bereid 2 insulinespuiten (29 G, 0,3 ml) klaar met 10 μl notexine-oplossing (5 μg/ml) voor TA-injecties en 4 insulinespuiten geladen met 15 μl notexine-oplossing (5 μg/ml) voor GA-injectie.
    OPMERKING: De Tibialis Anterior (TA) spier bevindt zich aan de voorste zijde van het onderbeen van de muis en strekt zich uit van de knie tot de enkel. De Gastrocnemius (GA) spier is een tweekoppige spier die zich aan de achterkant van het onderbeen bevindt, oppervlakkig ten opzichte van de soleus. Het loopt van de twee koppen (mediaal en lateraal) net boven de knie tot de hiel en strekt zich uit over in totaal drie gewrichten (knie-, enkel- en subtalaire gewrichten).
  5. Voer intramusculaire injecties uit
    1. TA-injectie (2 injecties in totaal)
      1. Plaats de muis in rugligging onder de opstelling van de neuskegel en desinfecteer de injectieplaats met steriele alcoholdoekjes (70% ethanol of isopropanol). Steek de naald, schuin naar beneden, in de buik van de TA (distaal van het midden van de buik) in een hoek van 30°. Schuif de naald langs de spier, evenwijdig aan het scheenbeen, om het midden van de buik van de TA te bereiken. Injecteer de notexine langzaam en continu en laat de naald 10 s op zijn plaats voordat u deze terugtrekt. Steek de naald in eerste instantie niet te diep in (om te voorkomen dat notexine onder de TA in de extensor digitorum longus-spier wordt geïnjecteerd) en niet te ver proximaal bij het naar voren brengen van de naald (om te voorkomen dat de naald te dicht bij de knie wordt geïnjecteerd).
    2. GA-injectie (4 injecties in totaal)
      1. Steek de naald schuin naar beneden in een hoek van ~45° in het midden van de buik van de laterale kop van de GA. Injecteer de notexin langzaam en continu en laat de naald 10 s op zijn plaats voordat u deze terugtrekt. Draai de achterpoot en injecteer notexine in de mediale kop van de GA-spier zoals hierboven. Zorg ervoor dat u de naald niet te diep insteekt.
  6. Draai de muis om en injecteer buprenorfine s.c. met behulp van een insulinespuit (28 G, 0,5 ml). Breng de muis over naar een lege herstelkooi op een verwarmingsplaat. Slechts de helft van de bodem van de kooi mag over de verwarmingsplaat worden geplaatst om de muis tijdens het herstel te laten thermoreguleren34. Herhaal stap 3.3-3.6 voor de overige muizen.
  7. Wanneer de muis in de herstelkooi volledig wakker is, plaatst u hem terug in de oorspronkelijke kooi. Breng het terug naar de stal en vul het aan met bevochtigd voer. Verwijder de buprenorfine drinkfles 24 uur na injectie.
  8. Controleer de muizen gedurende 6 uur na injectie met notexine en vervolgens elke 12 uur gedurende 2 dagen op tekenen van pijn, verminderde mobiliteit en verminderde voedselconsumptie35,36.

4. 5-jodo-2'-deoxyuridine-injectie

LET OP: 5-Jood-2'-deoxyuridine (IdU) wordt ervan verdacht genetische defecten te veroorzaken en de vruchtbaarheid of het ongeboren kind te schaden. Lees het veiligheidsinformatieblad (SDS) voordat u het aanraakt. Tijdens het hanteren moeten persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen. Gebruik een zuurkast bij het wegen van het IdU-poeder. Materialen die in contact zijn geweest met IdU moeten worden weggegooid in overeenstemming met de lokale veiligheidsvoorschriften.

OPMERKING: IdU-etikettering in vivo wordt gebruikt om de celdeling tijdens het verloop van de blessuretijd te controleren, omdat IdU, een gejodeerd thymidine-analoog, wordt opgenomen in het DNA van cellen in de S-fase. IdU wordt intraperitoneaal (i.p.) geïnjecteerd met 20 mg/kg lichaamsgewicht 8 uur voordat de muis wordt geofferd.

  1. Gebruik een sonicator bij 37 °C om een 2 mg/ml stockoplossing van IdU te bereiden in steriele PBS. IdU is lichtgevoelig; Gebruik op dezelfde dag of vries in bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden. Bij gebruik van bevroren IdU: ontdooien, vortex, centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 30 s en gebruik het supernatans voor injecties hieronder.
  2. Verdoof de muis in de inductiebox (3% isofluraan). Noteer de oormerking, weeg de muizen en bereken het volume van de IdU-oplossing: figure-protocol-2
  3. Voer i.p.-injectie uit met behulp van een insulinespuit (28 G, 0,5 ml) en breng de muis over naar een lege herstelkooi op een verwarmingsplaat. Als u wakker bent, verplaatst u de muis terug naar de oorspronkelijke kooi. Herhaal stap 4.2-4.3 voor de overige muizen en zet ze terug in de stal.

5. Euthanasie

OPMERKING: Zie Tabel 1 voor bufferrecepten. Bereid wasmedia voor (voedingsmengsel F-10 (Ham's), 10% paardenserum, 1x Pen/Streptokok) en filtreer door een polyethersulfon (PES) membraan in een polystyreen container. Bereid de dissociatiebuffer voor (wasmiddel aangevuld met 650 E/ml collagenase, type II) en bewaar op ijs. CyTOF-massacytometriemetingen zijn zeer gevoelig voor verontreinigingen. Om deze reden is het essentieel om reagentia van de hoogste analytische kwaliteit te gebruiken voor de verwerking van monsters. Om metaalverontreiniging te voorkomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om steriel plastic en nieuw glaswerk te gebruiken dat nooit met wasmiddel is gewassen, omdat veel laboratoriumzepen een hoog gehalte aan barium bevatten. Het wordt aanbevolen om dubbel gefilterd, gedestilleerd, gedeïoniseerd water te gebruiken voor de bereiding van reagens. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wordt in eigen huis bereid. Verdun de 10x voorraden tot 1x en filter de 1x PBS met 0,2 μm filters. Filter de 1x PBS opnieuw aan het begin van elk experiment. Dissectiegereedschap mag niet met afwasmiddel worden gereinigd vanwege de aanwezigheid van barium.

  1. Bereid de weegschaal, de container en de anesthesie-eenheid op basis van isofluraan voor met de inductiebox. Desinfecteer de juiste dissectiehulpmiddelen.
  2. Bereid voor en markeer buisjes van 50 ml voor elke muis met 5 ml dissociatiebuffer en een petrischaaltje. Houd de dissociatiebuffer op ijs.
  3. Verdoof de muis in de inductiebox (3% isofluraan, verhoog tot 5% bij bewusteloosheid) en voer cervicale dislocatie uit.

6. Dissectie en dissociatie van skeletspieren

  1. Ontleed de TA- en GA-spieren van beide achterpoten en plaats ze in het deksel van een petrischaal. Gebruik een schaar om het weefsel in een fijngehakte brij te knippen (~1 mm3 stuks). Breng over naar een tube van 50 ml met 5 ml ijskoude dissociatiebuffer. Blijf op het ijs.
  2. Herhaal de euthanasieprocedure (stap 5.3) en de skeletspierdissectie en dissociatieprocedure (stap 6.1) totdat alle muizen zijn verwerkt.
  3. Verwarm alle monsterbuisjes voor in een waterbad van 37 °C (2 min) en incubeer gedurende 45 minuten rond in een incubator (37 °C).
  4. Vortex en was door 10 ml wasmiddel toe te voegen. Centrifugeer (380 x g, 10 min, kamertemperatuur [RT]) en zuig aan tot 4 ml.
  5. Voeg 0,5 ml collagenase (1000 E/ml) en 0,5 ml dispase (11 E/ml) toe. Draai en incubeer gedurende 20 minuten bij rotatie bij 37 °C (bijv. in een incubator). Centrifugeer (380 x g, 1 min, RT) en resuspendeer met een pipet van 5 ml.
  6. Voeg 40 μm celzeven toe aan buisjes van 50 ml en bevochtig ze vooraf met 5 ml wasmedia. Zuig de celsuspensie 10 keer op en werp deze uit met behulp van een spuit van 5 ml met een naald van 20 G. Zeef door de vooraf bevochtigde celzeef van 40 μm. Was de tube van 50 ml met 10 ml wasmedium, breng deze over naar de celzeef van 40 μm en centrifugeer (380 x g, 10 min, 4 °C) de celsuspensie.

7. Levende/dode kleuring met fixatie van cisplatine en paraformaldehyde

LET OP: Cisplatine en paraformaldehyde (PFA) zijn kankerverwekkend. Lees het veiligheidsinformatieblad voordat u het aanraakt. Paraformaldehyde (PFA; 16%) is irriterend voor de huid, de ogen en de luchtwegen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en behandel deze stoffen onder een zuurkast. Tijdens de fixatie van cellen zal de uiteindelijke concentratie PFA 1,6% zijn. Er moeten de juiste beschermende maatregelen worden genomen en afval moet worden behandeld in overeenstemming met de lokale regelgeving.

LET OP: Bereid koude (4 °C) en warme (37 °C) serumvrije DMEM. Bereid DMEM aangevuld met 10% FBS, filtreer door een PES-membraan in een polystyreencontainer en bewaar op ijs. Bereid PBS en celkleuringsmedia (CSM; PBS, 0,5% BSA, 0,02% natriumazide) in een CyTOF-speciale glazen fles en filtreer door een PES-membraan. CSM kan tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.

  1. Zuig het supernatant op, tik de pellet op en resuspendeer in 1 ml koud serumvrij DMEM. Tel de cellen en pas de celdichtheid aan naar 1 x 106 cellen/ml in serumvrije DMEM.
  2. Voeg cisplatinebouillon (25 mM) toe tot een eindconcentratie van 25 μM. Vortex 10 s en incubeer precies 1 minuut (de reactie is zeer tijdgevoelig). Blus de reactie met ijskoude DMEM+10% FBS (3 keer het monstervolume) en bewaar deze op ijs. Centrifugeer (380 x g, 10 min, 4 °C), zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet grondig (tot 10 x 106 cellen/ml in CSM). Filtreer de suspensie door een celzeef van 35 μm.
  3. Fixeer de celsuspensie met gefilterde PFA-bouillonoplossing (16%) en pipette op en neer (voer uit onder een zuurkast) om de uiteindelijke PFA-concentratie (1,6%) te bereiken (voeg bijvoorbeeld 100 μl 16% PFA toe aan 900 μl celsuspensie). Vortex gedurende 30 s, 10 minuten incuberen op ijs en tweemaal wassen met 2 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 5 min, RT).
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters worden ingevroren op droogijs en worden bewaard bij -80 °C of direct worden gebruikt voor antilichaamkleuring. Als cellen moeten worden ingevroren, breng de cellen dan over in polypropyleenbuizen van 5 ml, omdat polystyreen bij lage temperaturen kan barsten. Als vers gefixeerde cellen worden gebruikt voor het kleuren, ga dan verder met stap 8.2.

8. Kleuring met metaalgeconjugeerde antilichamen

LET OP: Methanol (MeOH) is licht ontvlambaar en corrosief voor de luchtwegen. Lees het veiligheidsinformatieblad voordat u het aanraakt. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en behandel deze stof onder een zuurkast. Behandel afval in overeenstemming met de lokale regelgeving.

OPMERKING: Een lijst met antilichamen (Ab) gericht op oppervlaktemarkers en intracellulaire markers is te vinden in Tabel 2.

Antilichaamconjugatie: De meeste antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, zijn intern geconjugeerd omdat ze niet in de handel verkrijgbaar waren. Protocollen voor metaalconjugatie van antilichamen zijn eerder gepubliceerd en conjugatiekits zijn nu in de handel verkrijgbaar37,38. Immunoglobuline type G (IgG) is compatibel met de beschikbare conjugatieprotocollen. Het is van groot belang dat de antilichaamformulering die wordt gebruikt voor metaalconjugatie vrij is van cysteïne-bevattende dragereiwitten (bijv. runderserumalbumine (BSA)), die de conjugatie-efficiëntie kunnen beïnvloeden door te concurreren om de vrije maleimidegroepen van het polymeer, en de kwantificering van het metaalgeconjugeerde antilichaam kunnen verstoren. Het cysteïnegehalte van gelatine is veel lager dan dat van BSA. Het wordt echter aanbevolen dat als de antilichaamformulering dragereiwitten bevat, dergelijke eiwitten vóór conjugatie worden verwijderd. Het is nu mogelijk om BSA- en gelatinevrije antilichamen aan te vragen bij de fabrikant. Conserveermiddelen met kleine moleculen (bijv. natriumazide, glycerol en trehalose) zijn compatibel met metaalconjugatieprotocollen37,38.

Antilichaamtitratie: Na elke metaalconjugatie moeten antilichamen worden getitreerd om de optimale antilichaamconcentratie te bepalen die de maximale signaal-ruisverhouding oplevert. Voer voor antilichaamtitratie een tweevoudige seriële verdunning in 6 stappen uit en kleurt beide monsters waarvan bekend is dat ze het betreffende eiwit tot expressie brengen (bijv. spiercellen, positieve controles) en ontbreken (negatieve controles) 19,21,37,38.

Bereid verse Cell-ID Intercalator-Ir (voorraad = 500 μM; intercalator-ir oplossing) werkoplossing door de voorraad te verdunnen tot 0,1 μM in PBS/1,6% PFA.

  1. Ontdooi ingevroren monsters gedurende 5 minuten bij RT en centrifugeer (800 x g, 1 min, RT). Wassen met 2 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 5 min, RT).
  2. Bereid een 2,5x oppervlakte-antilichaam (Ab) kleuringsmengsel in CSM. Zuig het supernatans op tot ~60 μL en resuspendeer de pellet grondig. Kleuring van de cellen door 40 μL Ab-kleuringsmix aan het oppervlak toe te voegen en deze gedurende 1 uur bij RT te incuberen.
  3. Veeg de samples elke 20 minuten om te mixen. Tweemaal wassen met 1 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 5 min, RT). Zuig het supernatans op en tik de pellet op.
    OPMERKING: Als er geen intracellulaire kleuring nodig is, is methanolpermeabilisatie niet vereist. Als echter alleen oppervlaktekleuring wordt uitgevoerd, moet de intercalator-ir-oplossing worden verdund in een buffer die een permeabiliserend middel bevat (bijv. Maxpar-fix en permanentbuffer) om het kernmembraan binnen te dringen. Ga verder met stap 8.5 en verdun de Cell-ID Intercalator-Ir in een buffer met een permeabibiliserend middel en 1,6% PFA. Ga anders verder met de intracellulaire kleuring hieronder.
    LET OP: Iridium is gevaarlijk en er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen voor veilig gebruik. Iridium is ontvlambaar en irriterend voor de ogen/huid. Vermijd het creëren en inademen van stof of dampen. Vermijd contact met huid en ogen. Het mengsel van intercalator-ir-oplossing wordt echter geleverd in een concentratie van <1% in water, wat als niet-gevaarlijk wordt beschouwd volgens het wereldwijd geharmoniseerde systeem (GHS) voor classificatie en etikettering van chemicaliën. Lees het veiligheidsinformatieblad van Standard Biotools voordat u het aanraakt. Tijdens het hanteren moeten persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen. Materialen die in contact zijn geweest met de intercalator-ir-oplossing moeten worden weggegooid in overeenstemming met de lokale veiligheidsvoorschriften.
  4. Om de cellen te permeabiliseren, voegt u druppelsgewijs 0,5 ml ijskoude MeOH toe tijdens het vortexen. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs onder een zuurkast. Centrifugeer (800 x g, 5 min, RT) en was vervolgens tweemaal met 1 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 5 min, RT). Na de laatste wasbeurt zuigt u het supernatans op tot ~60 μL en resuspendeert u de pellet grondig.
  5. Bereid een 2,5x intracellulaire Ab-kleuringsmix in CSM. Kleuring van de cellen door 40 μL intracellulaire Ab-kleuringsmix toe te voegen en gedurende 1 uur te incuberen bij RT. Veeg de monsters elke 20 minuten om te mengen.
  6. Tweemaal wassen met 1 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 5 min, RT). Zuig het supernatans op en tik de pellet op. Resuspendeer de monsters in 0,5 ml intercalator-iridiumoplossing (tabel 1) en vortex. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij RT of 's nachts (O/N) bij 4 °C (zie opmerking hieronder).
    OPMERKING: Monsters kunnen maximaal 48 uur worden bewaard in een intercalator-iridiumoplossing bij 4 °C. Het kleuringsprotocol dat in deze studie is gebruikt, is ontwikkeld op basis van baanbrekend werk van het Nolan-lab{C}23. Het verschilt van de standaard Biotools-protocollen, omdat (i) in-house bereide buffers worden gebruikt voor wassen en kleuren, (ii) de cellen worden gefixeerd voorafgaand aan oppervlaktekleuring, en (iii) cellen worden gepermeabiliseerd met methanol voor intracellulaire kleuring met antilichamen tegen transcriptiefactoren of signaalmoleculen. Onderzoekers die een nieuw protocol ontwikkelen, moeten de compatibiliteit van hun antilichaampanel met methanol als permeabilisatiemiddel grondig testen. Bij het toevoegen van nieuwe antilichamen aan een panel wordt aanbevolen om de specificiteit van antilichamen te testen door middel van flowcytometrie met behulp van positieve en negatieve controlemonsters voorafgaand aan metaalconjugatie en titratie.

9. Monstervoorbereiding voor het laden in de massacytometer

OPMERKING: Celpellets zijn erg los in CAS-buffer (Tabel met materialen). Tijdens wasbeurten met CAS-buffer niet opzuigen tot het droog is. Houd in plaats daarvan een restvolume aan zoals hieronder beschreven.

  1. Vortex en centrifugeer (800 x g, 10 min, RT) de monsters. Giet het supernatans (handvat als PFA-afval) en de vortex af.
  2. Wassen met 1 ml CSM door centrifugeren (800 x g, 10 min, RT). Zuig het supernatans op en tik de pellet op.
  3. Wassen met 1 ml CAS-buffer door centrifugeren (800 x g, 10 min, RT). Zuig aan tot ~200 μL. Vortex en voeg 1 ml CAS-buffer toe. Neem 5 μL aliquot voor het celgetal. Centrifugeer (800 x g, 10 min, RT) en zuig voorzichtig op tot ≤50 μL. Verstoor de pellet niet.
  4. Resuspendeer de pellet tot 1-2 x 106 cellen/ml in CAS-buffer en voeg kalibratieparels toe (1x; Tabel met materialen) tot een eindconcentratie van 0,1x (bijv. voeg 100 μL 1x kalibratiekorrels toe aan 900 μL celsuspensie).
  5. Laad het monster in de massacytometer en verzamel gegevens met een stroomsnelheid van 400-500 cellen/s.
  6. Gegevensnormalisatie van FCS-bestanden uitvoeren met behulp van de CyTOF-software of eerder ontwikkelde normalisatietools39.
    OPMERKING: De werking van CyTOF-massacytometers is instrumentspecifiek 40,41. Het wordt aanbevolen om voor gebruik de gebruikershandleiding van de CyTOF te raadplegen. De kalibratiekorrels zijn in metaal ingebedde polystyreen normalisatieparelstandaarden die bekende concentraties van de metaalisotopen cerium (140/142Ce), europium (151/153Eu), holmium (165Ho) en lutetium (175/176Lu) bevatten. De kalibratieparels maken controle mogelijk voor de gevoeligheid van de machine, die in de loop van de tijd kan variëren, voornamelijk als gevolg van de opbouw van biologisch materiaal en variaties in plasma-ionisatie in de loop van de tijd.

10. CyTOF data-analyse

OPMERKING: Voor downstream-analyse kunnen genormaliseerde FCS-bestanden lokaal worden geanalyseerd of worden geüpload naar cloudgebaseerde softwareoplossingen zoals Cytobank, Cell Engine, OMIQ of FCS Express42.

  1. Voeg indien nodig afzonderlijke FCS-bestanden voor elk monster samen tot één bestand.
  2. Identificeer afzonderlijke cellen door te gating op Iridium-intercalator positieve gebeurtenissen, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen cellen met één kern en puin of doubletten.
  3. Poort voor levende cellen door cisplatine-negatieve gebeurtenissen te selecteren. Cisplatine bindt covalent aan cellulaire eiwitten en labelt stervende en dode cellen met aangetaste membranen in grotere mate dan levende cellen43.
  4. Ga naar de populatie van belang, bijvoorbeeld het myogene compartiment (Live/CD45-/CD31-/Sca1-/α7integrine+/CD9+) (Figuur 2A) en kwantificeer het relatieve aandeel van stam- en voorlopercellen. Deze benadering vereist voorkennis van het celoppervlak of de expressie van intracellulaire markers om individuele populaties te definiëren.
  5. Om hoogdimensionale analyse uit te voeren die de identificatie van voorheen niet-herkende subsets van zeldzame cellen binnen een complexe populatie mogelijk maakt, de populatie van belang te exporteren en clustering-algoritmen te gebruiken die speciaal zijn ontwikkeld voor CyTOF-gegevensanalyse44.
    OPMERKING: Eerder werk maakte gebruik van het X-shift-algoritme, dat gebruikmaakt van gewogen k-nearest neighbor density estimation (kNN-DE) in een hoogdimensionale ruimte om clustering zonder toezicht uit te voeren op basis van gedefinieerde parameters19. Het is aangetoond dat X-shift zeer effectief is bij het identificeren van zeldzame celpopulaties45.
  6. Voor X-shift-analyse downloadt u het vortex-softwarepakket (van de Nolan lab GitHub-pagina [https://github.com/nolanlab/vortex]) en Java 64-bit46. Instructies zijn hier te vinden: https://github.com/nolanlab/vortex/wiki/Getting-Started.
  7. Upload de geëxporteerde celpopulaties naar een lokale database en definieer de clusterparameters. Tot de door de gebruiker gedefinieerde parameters behoren (i) de markeringen die worden gebruikt voor clustering, (ii) het bereik van k-waarden (bijv. 5 tot 150) en (iii) het aantal clusterstappen.
    OPMERKING: Eerder werk gebruikte, als clustermarkers, een combinatie van oppervlaktemarkers waarvan bekend is dat ze tot expressie worden gebracht in spierstamcellen, nieuwe oppervlaktemarkers geïdentificeerd in een high-throughput flowcytometrische screening van spiercellen en myoblasten, en myogene transcriptiefactoren (TF's) waarvan bekend is dat ze verschillende stadia van myogenese definiëren. Deze aanpak maakte de identificatie mogelijk van twee markers op het celoppervlak, CD9 en CD104, waarvan het co-expressiepatroon voorheen niet-herkende voorlopercelpopulaties onderscheidt19.  De zorgvuldige keuze van clustering markers stelt de onderzoeker in staat om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Als bijvoorbeeld identificatie en analyse in de tijd van deelcelsubsets gewenst is, wordt aanbevolen om IdU als een van de clustermarkers op te nemen. X-shift kan clustering uitvoeren bij meerdere k-waarden en automatisch de k-waarde identificeren door het "elleboogpunt" te berekenen die resulteert in een optimaal clusternummer, waardoor onderclustering of overfragmentatie wordt vermeden. Het wordt aanbevolen om het elleboogpunt te berekenen en de clusteranalyse te gebruiken die wordt gedefinieerd door de optimale k-waarde voor gegevensvisualisatie en stroomafwaartse toepassingen.
  8. Om de ruimtelijke relaties tussen celpopulaties binnen de X-shift-clusters te visualiseren, voert u een krachtgerichte lay-out uit, die een 2D-kaart genereert waarbij de afstand tussen clusters hun gelijkenis in markerexpressie in hoogdimensionale fenotypische ruimte aangeeft. Door de kaart met één markering tegelijk in te kleuren, is het mogelijk om nieuwe celpopulaties te ontdekken en hun dynamiek te volgen. Vervolgkwantificering door handmatige gating in software, zoals Cytobank en Cell Engine, wordt aanbevolen.
  9. Voer heatmap-analyse uit om de dynamische expressie van meerdere oppervlakte- en intracellulaire eiwitten gedurende het tijdsverloop te kwantificeren en nieuwe trends te onthullen.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van een blessuretijdverloop is het mogelijk om gegevens van alle tijdstippen samen te clusteren om een regeneratiekaart te genereren. Bovendien is het mogelijk om een dergelijke kaart te ontleden in de individuele tijdstippen om de cellulaire en moleculaire dynamiek van regeneratie in de loop van de tijd te volgen19.

11. Kleuring met fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voor FACS

OPMERKING: Cellen die worden gebruikt voor niet-gekleurde, eenkleurige controles en fluorescentie min één (FMO)-controles kunnen afkomstig zijn van de TA- en GA-set van een extra muis, indien beschikbaar. Als alternatief kan de quadriceps (bovenste voorste dijspier) worden ontleed en verteerd tot een eencellige suspensie, volgens dezelfde procedure als voor de TA+GA die hierboven is ingesteld en wordt gebruikt voor controles. Bereid FACS-buffer voor (PBS, 2,5% geitenserum, 2 mM EDTA), filtreer door een PES-membraan in een polystyreencontainer en bewaar op ijs. FACS-buffer kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. Een lijst van antilichamen die voor FACS worden gebruikt, is te vinden in tabel 3.

  1. Bereid een afstammingsmix voor. Kleur elke controle in 50 μL (met ca. 3-5 x 105 cellen). Bereken de hoeveelheid afstammingsmix die nodig is. Maak 20%-30% volumeovertollig. De voorraadconcentratie van antilichamen die worden gebruikt voor de afstammingsmix is 0,2 mg/ml.
    1. Voeg in een tube van 0,5 ml anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD31 APC-Cy7, anti-Sca1 APC-Cy7 en anti-CD11b APC-Cy7 toe om eindconcentraties van respectievelijk 1 μg/ml, 2,5 μg/ml, 2,5 μg/ml en 0,63 μg/ml te bereiken.
  2. Bereid een volledig vlekkenmengsel voor. Kleurstof elk volledig gekleurd monster in 500 μl (met ca. 3-5 x 106 cellen). Maak 10% volume-overmaat van all-stain-mix.
    1. Voeg in een tube van 1,5 ml afstammingsmengantilichamen toe zoals hierboven + anti-α7 integrine PE, anti-CD9 APC en anti-CD104 FITC om eindconcentraties van respectievelijk 2 μg/ml, 1,2 μg/ml en 3 μg/ml te bereiken.
  3. Bereid FACS-buffer + DAPI voor: Voeg voor 10 ml FACS-buffer 1 μL DAPI toe (voorraad = 1 mg/ml) om een uiteindelijke DAPI-concentratie van 100 ng/ml te bereiken.
    LET OP: DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindooldihydrochloride) is geclassificeerd als mogelijk irriterend voor de huid en de luchtwegen. DAPI-oplossing in een concentratie van <1% wordt volgens GHS echter als ongevaarlijk beschouwd. Lees het veiligheidsinformatieblad voordat u het aanraakt. Tijdens het hanteren moeten persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen. Materialen die in contact zijn geweest met DAPI moeten worden weggegooid in overeenstemming met de lokale veiligheidsvoorschriften.
  4. Resuspendeer cellen uit sectie 6: Dissectie en dissociatie van skeletspieren:
    1. Voor volledig gekleurde monsters, resuspendeert TA- en GA-sets van een enkele muis in 500 μL FACS-buffer en brengt u deze over in buisjes van 15 ml voor kleuring.
    2. Gebruik voor controles TA- en GA-sets of quadricepsets. Als u 1 muis gebruikt voor controles, resuspendeer dan de cellen in 750 μl FACS-buffer. Als er meerdere muizen zijn, resuspendeer dan elke TA en GA of quadricep set in 500 μL FACS-buffer en combineer de sets tot een enkel monster van 1 ml door een fractie van elk monster te nemen. Voeg 50 μL controlecellen (3-5 x 105 cellen) toe aan polypropyleen buisjes van 5 ml voor kleuring.
  5. Vlek zoals beschreven in tabel 4 gedurende 45 minuten bij 4 °C in het donker.
  6. Was alle bevlekte monsters door 5 ml FACS-buffer toe te voegen. Was de bedieningselementen door 1 ml FACS-buffer toe te voegen en te centrifugeren (380 x g, 10 min, 4 °C).
  7. Resuspendeer alle gekleurde monsters in 1 ml FACS-buffer + DAPI. Resuspendeer de controles in 300 μL FACS-buffer met of zonder DAPI.
  8. Houd de cellen in het donker op 4 °C tot ze worden gesorteerd op een flowcytometer met 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm).
  9. Voer de controles en monsters uit op de sorteerder en maak sorteerpoorten met behulp van de relevante software. Voor niet-gevlekte/enkele kleurregelaars en FMO-bedieningselementen neemt u respectievelijk 1 x 104 en 0,3-1 x 105 gebeurtenissen op. Voor volledig bevlekte monsters neemt u maximaal 1 x 106 gebeurtenissen op. Sorteer alle volledig gekleurde monsters, of zoveel als nodig is, afhankelijk van de stroomafwaartse analysevereisten. Voor de hier gebruikte flowcytometer (FACSAria III) sorteert u in Purity Mode met behulp van een mondstuk van 70 mm.
  10. Zie figuur 4 voor de poortstrategie.
    1. Gebruik de ongekleurde en eenkleurige bedieningselementen om de spanning voor alle detectoren in te stellen.
    2. Gebruik de besturingselementen voor één kleur om de compensatiematrix in te stellen.
    3. Gebruik de FMO-besturingen om sorteerpoorten op te zetten.
  11. Verschillende populaties van spierstam- en voorlopercellen worden gesorteerd in ijskoude FACS-buffer.
  12. Centrifugeer (380 x g, 10 min, 4 °C) de celpopulaties. Suspendeer opnieuw in de juiste buffer, tel en ga verder met downstream-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier presenteren we een overzicht van de experimentele opzet voor het gebruik van deze gecombineerde aanpak, die (i) hoogdimensionale CyTOF-analyse van een acuut letselverloop door notexine-injectie omvat om de cellulaire en moleculaire dynamiek van stam- en voorlopercellen in skeletspieren te bestuderen (Figuur 1, bovenste schema); en (ii) FACS van stam- en voorlopercellen met behulp van twee celoppervlaktemarkers, CD9 en CD104, om deze populaties te isoler...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Regeneratie van skeletspieren is een dynamisch proces dat afhankelijk is van de functie van volwassen stamcellen. Hoewel eerdere studies zich hebben gericht op de rol van spierstamcellen tijdens regeneratie, is hun nageslacht in vivo onderbelicht, voornamelijk vanwege een gebrek aan hulpmiddelen om deze celpopulaties te identificeren en te isoleren 15,16,17,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We danken de leden van de FACS Core Facility in de afdeling Biogeneeskunde van de Universiteit van Aarhus voor de technische ondersteuning. We danken Alexander Schmitz, de manager van de afdeling Massacytometrie van de afdeling Biogeneeskunde, voor de discussie en de ondersteuning. Wetenschappelijke illustraties zijn gemaakt met behulp van Biorender.com. Dit werk werd gefinancierd door een Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) Starting Grant en een Start Package-subsidie (0071113) van de Novo Nordisk Foundation aan EP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302

Referenties

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Orienting muscle stem cells for regeneration in homeostasis, aging, and disease. Cell Stem Cell. 23 (5), 653-664 (2018).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  5. Fuchs, E., Blau, H. M. Tissue stem cells: Architects of their niches. Cell Stem Cell. 27 (4), 532-556 (2020).
  6. Hernández-hernández, J. M., et al. The myogenic regulatory factors, determinants of muscle development, cell identity and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 10-18 (2017).
  7. Zammit, P. S. Function of the myogenic regulatory factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in skeletal muscle, satellite cells and regenerative myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 72, 19-32 (2017).
  8. Sabourin, L. A. The molecular regulation of myogenesis. Clin Genet. 57 (1), 16-25 (2000).
  9. Cooper, R. N., et al. In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. J Cell Sci. 112 (17), 2895-2901 (1999).
  10. Rudnicki, M. A., Jaenisch, R. The MyoD family of transcription factors and skeletal myogenesis. Bioessays. 17 (3), 203-209 (1995).
  11. Braun, T., Arnold, H. H. Inactivation of Myf-6 and Myf-5 genes in mice leads to alterations in skeletal muscle development. EMBO J. 14 (6), 1176-1186 (1995).
  12. Yablonka-Reuveni, Z. Development and postnatal regulation of adult myoblasts. Microsc Res Tech. 30 (5), 366-380 (1995).
  13. Braun, T., et al. MyoD expression marks the onset of skeletal myogenesis in Myf-5 mutant mice. Development. 120 (11), 3083-3092 (1994).
  14. Rudnicki, M. A., et al. MyoD or Myf-5 is required for the formation of skeletal muscle. Cell. 75 (7), 1351-1359 (1993).
  15. Montarras, D., et al. Developmental biology: Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  16. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  17. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Porpiglia, E., et al. High-resolution myogenic lineage mapping by single-cell mass cytometry. Nat Cell Biol. 19 (5), 558-567 (2017).
  20. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry Part A. 81 (7), 552-566 (2012).
  21. Hartmann, F. J., et al. Mass Cytometry: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2019).
  22. Devine, R. D., Behbehani, G. K. Use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform. J Vis Exp. (176), e60556(2021).
  23. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  24. Nag, A. C., Foster, J. D. Myogenesis in adult mammalian skeletal muscle in vitro. J Anat. 132, Pt 1 1-18 (1981).
  25. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro). Int J Dev Biol. 34, 171-180 (1990).
  26. Yablonka-Reuveni, Z. Development and postnatal regulation of adult myoblasts. Microsc Res Tech. 30 (5), 366-380 (1995).
  27. Chu, C., Cogswell, J., Kohtz, D. S. MyoD functions as a transcriptional repressor in proliferating myoblasts. J Biol Chem. 272 (6), 3145-3148 (1997).
  28. Shah, B., Hyde-Dunn, J., Jones, G. E. Proliferation of murine myoblasts as measured by bromodeoxyuridine incorporation. Methods in Mol Biol. 75, 349-355 (1997).
  29. Springer, M. L., Blau, H. M. High-efficiency retroviral infection of primary myoblasts. Somat Cell Mol Genet. 23 (3), 203-209 (1997).
  30. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  31. Springer, M. L., Rando, T. A., Blau, H. M. Gene delivery to muscle. Curr Protoc Hum Genet. , Chapter 13, Unit13.4 (2002).
  32. Cull-Candy, S. G., Fohlman, J., Gustavsson, D., Lullmann-Rauch, R., Thesleff, S. The effects of taipoxin and notexin on the function and fine structure of the murine neuromuscular junction. Neuroscience. 1 (3), 175-180 (1976).
  33. Francis, B., John, T. R., Seebart, C., Kaiser, I. I. New toxins from the venom of the common tiger snake (Notechis scutatus scutatus). Toxicon. 29 (1), 85-96 (1991).
  34. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62, Issue 1-2, 2021 238-273 (2021).
  35. Langford, D., Bailey, A., Chanda, M., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, 447-449 (2010).
  36. Matsumiya, L. C., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wieskopf, J. S., Zaloum, A., King, O. D., Mogil, J. S. Using the Mouse Grimace Scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012 (1), PMID: 22330867; PMCID: PMC3276965 42-49 (2012).
  37. Gonzalez, V. D., et al. High-grade serous ovarian tumor cells modulate NK cell function to create an immune-tolerant microenvironment. Cell Rep. 36 (9), 109632(2021).
  38. Delgado-Gonzalez, A., et al. Measuring trogocytosis between ovarian tumor and natural killer cells. STAR Protoc. 3 (2), 101425(2022).
  39. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  40. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. (69), e4398(2012).
  41. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample preparation for mass cytometry analysis. J Vis Exp. (122), e54394(2017).
  42. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Curr Protoc Cytom. , Chapter 10., Uni10.17 (2010).
  43. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  44. Kimball, A. K., et al. A beginner's guide to analyzing and visualizing mass cytometry data. J Immunol. 200 (1), 3-22 (2018).
  45. Weber, L. M., Robinson, M. D. Comparison of clustering methods for high-dimensional single-cell flow and mass cytometry data. Cytometry Part A. 89 (12), 1084-1096 (2016).
  46. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nat Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
  47. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal Chem. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  48. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nat Commun. 12 (1), 692(2021).
  49. de Morree, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (43), E8996-E9005 (2017).
  50. Luo, D., et al. Deltex2 represses MyoD expression and inhibits myogenic differentiation by acting as a negative regulator of Jmjd1c. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3071-E3080 (2017).
  51. Wersto, R. P., et al. Doublet discrimination in DNA cell-cycle analysis. Cytometry. 46 (5), 296-306 (2001).
  52. Porpiglia, E., Blau, H. M. Plasticity of muscle stem cells in homeostasis and aging. Curr Opin Genet Dev. 77, 101999(2022).
  53. Porpiglia, E., et al. Elevated CD47 is a hallmark of dysfunctional aged muscle stem cells that can be targeted to augment regeneration. Cell Stem Cell. 29 (12), e1658 1653-1668 (2022).
  54. Brunet, A., Goodell, M. A., Rando, T. A. Ageing and rejuvenation of tissue stem cells and their niches. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (1), 45-62 (2022).
  55. Danielli, S. G., et al. Single-cell profiling of alveolar rhabdomyosarcoma reveals RAS pathway inhibitors as cell-fate hijackers with therapeutic relevance. Sci Adv. 9 (6), eade9238 (2023).
  56. de Morree, A., Rando, T. A. Regulation of adult stem cell quiescence and its functions in the maintenance of tissue integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (5), 334-354 (2023).
  57. Yucel, N., et al. Glucose metabolism drives histone acetylation landscape transitions that dictate muscle stem cell glucose metabolism drives histone acetylation landscape transitions that dictate muscle stem cell function. Cell Rep. 27 (13), 3939-3955 (2019).
  58. Tierney, M. T., Sacco, A. Inducing and evaluating skeletal muscle injury by notexin and barium chloride. Methods Mol Biol. 1460, 53-60 (2016).
  59. Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).
  60. Call, J. A., Lowe, D. A. Eccentric contraction-induced muscle injury: Reproducible, quantitative, physiological models to impair skeletal muscle's capacity to generate force. Methods Mol Biol. 1460, 3-18 (2016).
  61. Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin Induced Injury and Skeletal Muscle Regeneration. Methods Mol Biol. 1460, 61-71 (2016).
  62. Le, G., Lowe, D. A., Kyba, M. Freeze injury of the tibialis anterior muscle. Methods Mol Biol. 1460, 33-41 (2016).
  63. Borok, M., et al. Progressive and coordinated mobilization of the skeletal muscle niche throughout tissue repair revealed by single-cell proteomic analysis. Cells. 10 (4), 744(2021).
  64. Petrilli, L. L., et al. High-dimensional single-cell quantitative profiling of skeletal muscle cell population dynamics during regeneration. Cells. 9 (7), 1723(2020).
  65. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), e606 609-621 (2019).
  66. Hartmann, F. J., et al. Scalable conjugation and characterization of immunoglobulins with stable mass isotope reporters for single-cell mass cytometry analysis. Methods Mol Biol. 1989, 55-81 (2019).
  67. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. (190), e64557(2022).
  68. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  69. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat Biotechnol. 30 (9), 858-867 (2012).
  70. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , Chapter 8 11-20 (2012).
  71. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  72. Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).
  73. Han, G., Spitzer, M. H., Bendall, S. C., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Metal-isotope-tagged monoclonal antibodies for high-dimensional mass cytometry. Nat Protoc. 13 (10), 2121-2148 (2018).
  74. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), e5 612-620 (2018).
  75. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Curr Opin Immunol. 25 (4), 484-494 (2013).
  76. Kalina, T., Lundsten, K., Engel, P. Relevance of antibody validation for flow cytometry. Cytometry A. 97 (2), 126-136 (2020).
  77. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  78. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  79. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110 (3), 277-283 (2004).
  80. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Myogene progenitorcellenspierstamelcellensingle cell cytometrieceloppervlaktemarkersspierregeneratieceltoestandsovergangfluorescentie geactiveerde sorteringclusteringalgoritmen
Identificatie en analyse van myogene voorlopercellen in vivo tijdens acuut skeletspierletsel door hoogdimensionale eencellige massacytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.