Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het induceren van langdurige plasticiteit van intrinsieke neuronale prikkelbaarheid in neuronen van de dorsale laterale geniculate nucleus

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65950

⸱

20 september 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het induceren van langetermijn plasticiteit van neuronale intrinsieke prikkelbaarheid in relaisneuronen van de dorsale laterale geniculate kern, bewaard in ex vivo hersensneden.

Samenvatting

De dorsale laterale geniculate kern (dLGN) wordt al lang beschouwd als een basisrelais voor visuele informatie die van de retina naar corticale gebieden reist, maar recente bevindingen suggereren een grotendeels onderschatte functionele plasticiteit van dLGN-hoofdcellen. De cellulaire mechanismen die deze veranderingen ondersteunen, zijn echter niet volledig onderzocht. Hier rapporteren we een protocol om langdurige potentiëring van intrinsieke neuronale exciteerbaarheid (LTP-IE) te induceren in dorsale dLGN-relaiscellen van acute herfsnedingen van jonge ratten. Intrinsieke plasticiteit wordt over het algemeen parallel geïnduceerd met synaptische plasticiteit. Bij dLGN-neuronen wordt LTP-IE echter op betrouwbare wijze geïnduceerd door spiking-activiteit met een frequentie van 40 Hz gedurende 10 min. LTP-IE in dLGN-relaisneuronen is langdurig omdat het tot 40 min na het inductieprotocol kan worden gevolgd. Kortom, de resultaten van deze studie leveren het eerste bewijs voor de inductie van intrinsieke plasticiteit in dLGN-relaiscellen en wijzen zo verder op de rol van thalamusneuronen in activiteitsafhankelijke visuele plasticiteit.

Inleiding

Het algemene doel van dit methodepapper is om een eenvoudige manier te bieden om langdurige plasticiteit van neuronale excitabiliteit in visuele thalamische neuronen van de rat in vitro te induceren, met behulp van de standaard stroomklemmodus van de patch clamp-techniek1,2. De reden achter de ontwikkeling van deze techniek is zijn eenvoud en reproduceerbaarheid. Het voordeel ten opzichte van alternatieve technieken, zoals stimulatie van synaptische inputs, gepaard of niet gepaard met postsynaptische actiepotentialen met een bepaalde timing, is de betrouwbaarheid ervan.

Plasticiteit in het visuele systeem wordt traditioneel geacht uitsluitend te worden uitgedrukt op corticaal niveau, terwijl de dorsale laterale geniculate kern (dLGN), een primaire ontvangende structuur van retinale inputs op thalamisch niveau, traditioneel wordt beschouwd als een relais van visuele informatie3. Deze eerste conclusie is echter in twijfel getrokken door recente werken die aangeven dat deze simplistische opvatting niet langer geldt4,5,6. Bijvoorbeeld, functionele tekorten in visuele respons worden al waargenomen bij amblyopische patiënten in het stadium van de LGN7. Bovendien ontvangt een groot deel van de dLGN-relaisneuronen in een bepaald monoculair territorium inputs van elk oog, wat wijst op potentiële binoculariteit voor een groot deel van de dLGN-neuronen8,9,10. Bovendien veroorzaakt monoculaire deprivatie een significante verschuiving in oculaire dominantie in dLGN-neuronen5,11,12.

Onder de mechanismen van functionele plasticiteit die kunnen optreden in verschuiving van oculaire dominantie, is plasticiteit van intrinsieke neuronale excitabiliteit een potentiële kandidaat. Inderdaad, veel hersengebieden, inclusief visuele gebieden, vertonen intrinsieke plasticiteit na verschillende gedragstaken13,14. Langetermijnintrinsieke plasticiteit is gemeld in centrale neuronen na stimulatie van afferente glutamaatinputs15,16,17,18, spikingactiviteit19,20, sensorische stimulatie21 of na activiteit of sensorische deprivatie20,22,23. Hier beschrijven we een protocol dat de inductie van langetermijnpotentiëring van intrinsieke excitabiliteit (LTP-IE) in dLGN-relaisneuronen mogelijk maakt na spikingactiviteit met een frequentie van 40 Hz. De frequentie van 40 Hz komt overeen met een frequentie die wordt waargenomen in de meeste dLGN-neuronen in vivo bij visuele stimulatie24,25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Europese en Institutionele richtlijnen (Richtlijn 86/609/EEG van de Raad en Frans Nationaal Onderzoekscomité) en goedgekeurd door de lokale gezondheidsautoriteit (Veterinaire Diensten, Préfecture des Bouches-du-Rhône, Marseille).

1. Dieren

  1. Voer experimenten uit met 19-25 dagen oude Long Evans ratten van beide geslachten (met een gewicht tussen de 50-90 g).
  2. Huis de dieren in conventionele plastic kooien, samen met hun moeder en hun nestgenoot. Houd de temperatuur constant met een 12 uur licht/donkercyclus en ad libitum toegang tot water en voedsel.

2. Acute plakjes van ratten dLGN

  1. Bereid snij-/herstel- en extracellulaire opnameoplossingen voor.
    1. Om de snij-/hersteloplossing te bereiden, meng 92 mM n-methyl-D-glutamine, 30 mM NaHCO3, 25 mM D-glucose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, 0,5 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 20 mM Hepes, 5 mM natriumascorbaat en 3 mM natriumpyruvaat en doorbubbel met 95% O2-5% CO2 (pH 7,4). Houd de snijoplossing koud tijdens de snijproceduur.
    2. Bereid de opnameoplossing (kunstmatige hersenvocht, ACSF) voor door 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 2,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,8 mM NaH2PO4 en 10 mM D-glucose te mengen en deze permanent te mengen met 95% O2-5% CO2.
  2. Bereid de dissectiegereedschappen en twee ijsplatforms voor (Figuur 1A).
  3. Doe ijs in de buitentank en vul de snijdkamer van de vibratome met een ijskoude snijoplossing (Figuur 1B).
  4. Anesthesiseer jonge Long Evans rat (leeftijd: P19-P25) diep met isofluraan (5%). Nadat bevestigd is dat het dier diep anesthetiseerd is (door stevig vast te knijpen in de voet zonder reactie), euthaniseer het dier door onthoofding met een schaar of een guillotine (afhankelijk van de leeftijd/grootte van het dier) ter hoogte van de medulla. Plaats het hoofd op het eerste ijsplatform en bevochtig het geïsoleerde weefsel elke 10 s met de geoxideerde ijskoude snijojoplossing.
    OPMERKING: Anesthesie- en euthanasieverslagen moeten worden uitgevoerd in een aparte ruimte van de dierfaciliteit.
  5. Snijd de schedel in caudale richting en snijd met kleine schaars de schedel bilateraal. Open met stompe pincetten de schedel en trek snel de hersenen uit de schedel met een spatel en leg deze op het tweede ijsplatform.
    OPMERKING: De tijd mag niet langer zijn dan 2 min vanaf de onthoofding tot het extractie van de hersenen.
  6. Maak 2 sneden in het frontale vlak van de hersenen over de hele hersenen; de eerste om het voorste deel van de cortex en de reukbollen te verwijderen (zie Figuur 1C) en de tweede ter hoogte van de inferieure colliculus om het achterste deel van de cortex en de cerebellum te verwijderen.
  7. Lijm de hersenblokken op de plaat van de vibratome met de rostrale kant omhoog (zie Figuur 1D,E). Bevochtig de hersenen regelmatig (elke 10 s) tijdens het hele proces totdat deze ondergedompeld zijn in de snijdkamer van de vibratome.
  8. Maak 350 µm dunne plakken met de vibratome die de dLGN bevatten (Figuur 1G). Verwijder de cortex en de hippocampus van de middenhersenen met een potlood door voorzichtig aan deze structuren te trekken.
  9. Zuig de plakken op met een gebroken Pasteurpijpje verbonden aan een flexibele rubberen zuiger (Figuur 1H).
  10. Laat de plakken 20-30 min herstellen in de hersteloplossing (Figuur 1I).

3. Whole-cell patch-clamp elektrofysiologie

OPMERKING: Gebruik voor whole-cell patch-clamp opnames van dLGN-relaisneuronen een specifieke patch-clamp versterker.

  1. Zet de pompen van de rig aan om de extracellulaire opnamezouten (zie samenstelling in stap 2.1) te laten circuleren in de opnamekamer.
  2. Bereid de intracellulaire oplossing voor door 120 mM K-gluconaat, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP en 0,3 mM NaGTP (pH 7,4) te mengen.
    OPMERKING: De intracellulaire oplossing kan van tevoren worden bereid en ingevroren worden bewaard bij -80°C. Wanneer ontdooid, wordt de oplossing bij 4°C bewaard.
  3. Voeg de GABAA kanaalblokker, picrotoxine (100 µM uiteindelijke concentratie), en de ionotropische glutamaatreceptorantagonist, kynurenine (2 mM, uiteindelijke concentratie), toe aan de extracellulaire zoutoplossing.
  4. Breng de plak over naar een ondergedompelde kamer gemonteerd op een rechtopstaande microscoop. De kamer wordt temperatuurgestuurd op 30°C en continu geperfundeerd met geëquilibreerd aCSF.
  5. Plaats de U-vormige platinadraad op de plak en positioneer de plak om de dLGN te visualiseren (Figuur 2A).
  6. Bereid patchpijpjes van

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

dLGN-neuronen werden geregistreerd in een whole-cell configuratie, en LTP-IE werd geïnduceerd door actiepotentiaalvuren bij 40 Hz gedurende 10 min in aanwezigheid van ionotrope glutamaat- en GABA-receptorantagonisten (Figuur 3A). Een drievoudige toename in het aantal actiepotentialen werd waargenomen 20-30 min na de inductie (Figuur 3B) zonder enige verandering in de inputweerstand, Rin (Figuur 3C). Dit protocol induceerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We rapporteren hier de inductie van LTP-IE in dLGN-neuronen die in leven worden gehouden in acute hersensnedes door stimulatie van het opgenomen neuron om actiepotentialen op te roepen met een frequentie van 40 Hz gedurende 10 minuten. Dit protocol is eenvoudig te implementeren in elk neurofysiologisch lab, omdat het een minimaal aantal apparatuur vereist (snijder, microscoop, 1 versterker, 1 acquisitiekaart en computer). Echter, er moeten een paar cruciale stappen worden gerespecteerd om waardevolle gegevens te verzamel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Ondersteund door INSERM, CNRS (tot DD), AMU (tot MR), FRM (DVS20131228768 tot DD en DEQ20180839583 tot DD), NeuroSchool ("France 2030" programma via A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) en ANR-financiering (ANR-17-EURE-0029 tot AW), en ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 tot DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 tot DD). Wij danken A Venture & K Milton voor uitstekende dierverzorging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Automated vibrating blade microtomeLeicaVT-1200Svibratome/slicer
Borosilicate glass tubePhymepB-15086-10
Controller Typ VLuigs&NeumannTyp Vtemperatuurregelaar
Igor softwarewavemetricsanalysesoftware
Infrarood videomicroscopieOlympusXM-10 Camera
KynurenateMerk/SigmaK3375AMPA/NMDA receptoren blokker
Laag-ruis Data Acquisition SystemAxon - Molecular devicesDigidata 1440Aanaloog/digitaal interface
MicromanipulatorsLuigs&NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Molecular devicesN/APatch-clamp versterker
Multiclamp 700BAxon - Molecular devicesN/Apatch-clamp versterker
PC-100 pullerNarishigePC-100micropipet puller
PClamp10Axon - Molecular devicesN/Apatch-clamp opnamesoftware
PicrotoxinAbCamab120315GABAA receptoren blokker
Slice mini kamer Luigs&NeumannLN Chambre Slice mini I-IIOndergedompelde kamer
Staande microscoopOlympusBX51 WI

Referenties

  1. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  3. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Effect of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. J Neurophysiol. 26, 978-993 (1963).
  4. Sherman, S. M. The thalamus is more than just a relay. Curr Opin Neurobiol. 17 (4), 417-422 (2007).
  5. Rose, T., Bonhoeffer, T. Experience-dependent plasticity in the lateral geniculate nucleus. Curr Opin Neurobiol. 53, 22-28 (2018).
  6. Duménieu, M., Marquèze-Pouey, B., Russier, M., Debanne, D. Mechanisms of plasticity in subcortical visual areas. Cells. 10 (11), 3162(2021).
  7. Hess, R. F., Thompson, B., Gole, G., Mullen, K. T. Deficient responses from the lateral geniculate nucleus in humans with amblyopia. Eur J Neurosci. 29 (5), 1064-1070 (2009).
  8. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple retinal axons converge onto relay cells in the adult mouse thalamus. Cell Rep. 12 (10), 1575-1583 (2015).
  9. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The fuzzy logic of network connectivity in mouse visual thalamus. Cell. 165 (1), 192-206 (2016).
  10. Rompani, S. B., et al. Different modes of visual integration in the lateral geniculate nucleus revealed by single-cell-initiated transsynaptic tracing. Neuron. 93 (4), 767-776 (2017).
  11. Sommeijer, J. -P., et al. Thalamic inhibition regulates critical-period plasticity in visual cortex and thalamus. Nat Neurosci. 20 (12), 1715-1721 (2017).
  12. Jaepel, J., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Rose, T. Lateral geniculate neurons projecting to primary visual cortex show ocular dominance plasticity in adult mice. Nat Neurosci. 20 (12), 1708-1714 (2017).
  13. Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
  14. Debanne, D., Inglebert, Y., Russier, M. Plasticity of intrinsic neuronal excitability. Curr Opin Neurobiol. 54, 73-82 (2019).
  15. Sourdet, V., Russier, M., Daoudal, G., Ankri, N., Debanne, D. Long-term enhancement of neuronal excitability and temporal fidelity mediated by metabotropic glutamate receptor subtype 5. J Neurosci. 23 (32), 10238-10248 (2003).
  16. Campanac, E., Gasselin, C., Baude, A., Rama, S., Ankri, N., Debanne, D. Enhanced intrinsic excitability in basket cells maintains excitatory-inhibitory balance in hippocampal circuits. Neuron. 77 (4), 712-722 (2013).
  17. Incontro, S., et al. Endocannabinoids tune intrinsic excitability in O-LM interneurons by direct modulation of postsynaptic Kv7 channels. J Neurosci. 41 (46), 9521-9538 (2021).
  18. Sammari, M., Inglebert, Y., Ankri, N., Russier, M., Incontro, S., Debanne, D. Theta patterns of stimulation induce synaptic and intrinsic potentiation in O-LM interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2205264119(2022).
  19. Cudmore, R. H., Turrigiano, G. G. Long-term potentiation of intrinsic excitability in LV visual cortical neurons. J Neurophysiol. 92 (1), 341-348 (2004).
  20. Nataraj, K., Le Roux, N., Nahmani, M., Lefort, S., Turrigiano, G. Visual deprivation suppresses L5 pyramidal neuron excitability by preventing the induction of intrinsic plasticity. Neuron. 68 (4), 750-762 (2010).
  21. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  22. Desai, N. S., Rutherford, L. C., Turrigiano, G. G. Plasticity in the intrinsic excitability of cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (6), 515-520 (1999).
  23. Brown, A. P. Y., Cossell, L., Margrie, T. W. Visual experience regulates the intrinsic excitability of visual cortical neurons to maintain sensory function. Cell Rep. 27 (3), 685-689 (2019).
  24. Denman, D. J., Contreras, D. On parallel streams through the mouse dorsal lateral geniculate nucleus. Front Neural Circuits. 10, 20(2016).
  25. Sriram, B., Meier, P. M., Reinagel, P. Temporal and spatial tuning of dorsal lateral geniculate nucleus neurons in unanesthetized rats. J Neurophysiol. 115 (5), 2658-2671 (2016).
  26. Duménieu, M., et al. Visual activity enhances neuronal excitability in thalamic relay neurons. bioRxiv. , (2023).
  27. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28 (3), 955-966 (2000).
  28. Sherman, S. M. Thalamus plays a central role in ongoing cortical functioning. Nat Neurosci. 19 (4), 533-541 (2016).
  29. Cudmore, R. H., Fronzaroli-Molinieres, L., Giraud, P., Debanne, D. Spike-time precision and network synchrony are controlled by the homeostatic regulation of the D-type potassium current. J Neurosci. 30 (38), 12885-12895 (2010).
  30. Zbili, M., et al. Homeostatic regulation of axonal Kv1.1 channels accounts for both synaptic and intrinsic modifications in the hippocampal CA3 circuit. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (47), e2110601118(2021).
  31. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  32. Galuske, R. A. W., Munk, M. H. J., Singer, W. Relation between gamma oscillations and neuronal plasticity in the visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (46), 23317-23325 (2019).
  33. Inglebert, Y., Aljadeff, J., Brunel, N., Debanne, D. Synaptic plasticity rules with physiological calcium levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33639-33648 (2020).
  34. Blitz, D. M., Regehr, W. G. Timing and specificity of feed-forward inhibition within the LGN. Neuron. 45 (6), 917-928 (2005).
  35. Chrobok, L., Palus-Chramiec, K., Chrzanowska, A., Kepczynski, M., Lewandowski, M. H. Multiple excitatory actions of orexins upon thalamo-cortical neurons in dorsal lateral geniculate nucleus - implications for vision modulation by arousal. Sci Rep. 7 (1), 7713(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Visuele thalamische neuronenpatchclamp-registratiehersenplakpreparatiewhole-cell configuratieactiepotentiaal-firingionkanaalplasticiteitvisuele plasticiteit
Het induceren van langdurige plasticiteit van intrinsieke neuronale prikkelbaarheid in neuronen van de dorsale laterale geniculate nucleus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.