Microglia worden beschouwd als enkele van de meest veelzijdige cellen in het lichaam, die in staat zijn tot morfologische en functionele aanpassing. Hun heterogeniteit en multifunctionaliteit maken het mogelijk om de homeostase van de hersenen te handhaven, terwijl ze ook in verband worden gebracht met verschillende neurologische pathologieën. Hier wordt een techniek beschreven voor het zuiveren van microglia van het ruggenmerg.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle en efficiënte verrijking van microglia van het ruggenmerg van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De wervelkolom definieert een gewerveld dier en vormt het wervelkanaal, een holte die het ruggenmerg omsluit en beschermt. Een goede ontwikkeling en functie van het centrale zenuwstelsel van zoogdieren zijn in belangrijke mate afhankelijk van de activiteit van residente macrofagen die bekend staan als microglia. Microglia vertonen heterogeniteit en multifunctionaliteit, waardoor verschillende genexpressie en gedrag in het ruggenmerg en de hersenen mogelijk zijn. Talrijke studies hebben de functie van de cerebrale microglia onderzocht, waarbij de zuiveringsmethoden uitgebreid worden beschreven. De zuivering van microglia uit het ruggenmerg bij muizen mist echter een uitgebreide beschrijving. Daarentegen ontbreekt het gebruik van een sterk gezuiverd collagenase, in tegenstelling tot een ongeraffineerd extract, aan rapportage in weefsels van het centrale zenuwstelsel. In deze studie werden de wervelkolom en het ruggenmerg weggesneden van 8-10 weken oude C57BL/6-muizen. De daaropvolgende vertering maakte gebruik van een sterk gezuiverd collagenase en de zuivering van microglia maakte gebruik van een dichtheidsgradiënt. Cellen ondergingen kleuring voor flowcytometrie, waarbij de levensvatbaarheid en zuiverheid werden beoordeeld door middel van CD11b- en CD45-kleuring. De resultaten leverden een gemiddelde levensvatbaarheid van 80% en een gemiddelde zuiverheid van 95% op. Concluderend betrof manipulatie van microglia van muizen spijsvertering met een sterk gezuiverd collagenase, gevolgd door een dichtheidsgradiënt. Deze aanpak produceerde effectief substantiële populaties microglia in het ruggenmerg.
Inleiding
Het bepalende kenmerk van gewervelde dieren is de wervelkolom of wervelkolom, waarin het notochord is vervangen door een opeenvolging van gesegmenteerde botten die wervels worden genoemd, gedeeld door tussenwervelschijven. Deze opeenvolging van botmateriaal vormt het wervelkanaal, een holte die hetruggenmerg omsluit en beschermt. In het geslacht Rodentia wordt de wervelkolom meestal gevormd door zeven halswervels, dertien borstwervels, zes lendenwervels en een variabel aantal staartwervels 2,3. De lengte van het ruggenmerg is vergelijkbaar met die van de wervelkolom en het terminale filum is een niet-nerveuze structuur die het ruggenmerg aan het heiligbeen verankert. Bovendien komen zenuwvezels naar buiten via het foramen tussen de wervels1.
De ontwikkeling en goede werking van het centrale zenuwstelsel bij zoogdieren hangt in belangrijke mate af van de activiteit van de inwonende macrofagen van het zenuwstelsel, microglia4 genaamd. Hoewel microglia aanvankelijk werden beschreven als fagocyten die in de hersenen wonen, heeft recent onderzoek veel dynamische functies aan deze cellen toegeschreven 5,6. De grootte van microglia varieert van 7 tot 10 μm in homeostase; Ze worden beschouwd als een van de meest veelzijdige cellen in het lichaam en kunnen zich morfologisch en functioneel aanpassen aan hun voortdurend veranderende omgeving7. Deze cellen vertonen een hoge heterogeniteit tijdens zowel de embryonale als de volwassen fase8,9, terwijl ze in de volwassen fase ook complexe functionele heterogeniteit vertonen op basis van hun spatiotemporele context10. De heterogeniteit en meerdere functies van microglia zorgen voor differentiële genexpressie en gedrag in het ruggenmerg en de hersenen. Het is aangetoond dat de expressie van CD11b, CD45, CD86 en CCR9 hoger is in het ruggenmerg in vergelijking met de hersenen 8,9.
Er bestaan meerdere protocollen voor isolatie van cerebrale microglia11,12; Er zijn er echter maar een paar voor microglia van het ruggenmerg13,14. Het optimaliseren van een methode voor het zuiveren van microglia uit het ruggenmerg vergemakkelijkt de ontwikkeling van meerdere studies gericht op het ontdekken van de fysiologie van microglia. Dit protocol heeft tot doel een eenvoudige en zeer reproduceerbare extractie van het ruggenmerg van de muis en de zuivering van microglia te beschrijven (Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de officiële Mexicaanse norm NOM-062-ZOO-1999 en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Goedkeuring voor de studie werd verkregen van de commissies voor onderzoek, ethiek en bioveiligheid van het Mexico Children's Hospital (HIM/2023/006) en de onderzoeks- en bio-ethische commissie van het General Hospital of Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Drie C57BL/6-muizen in de leeftijd van 6 tot 8 weken werden verkregen uit het Mexico Children's Hospital, waar ze onder geïsoleerde omstandigheden werden grootgebracht in geventileerde rekken, in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren in instellingen.
1. Bereiding van materialen en reagentia
- Verwarm Ca 2+ en Mg2+ vrij PBS voor, evenals Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) tot 37 °C.
- Vul de HBSS-oplossing aan met 100 μg/ml Liberase en 4 μg/ml DNase (HBSS-LD). Zorg ervoor dat de oplossing een fysiologische pH van 7,4 behoudt.
OPMERKING: 1 ml werkoplossing per ruggenmerg is nodig. - Bereid een isotone 90%-oplossing voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie (in de handel verkrijgbaar, zie Materiaaltabel) en verwarm deze voor tot 37 °C.
- Bereid de kleuringsbuffer voor door 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) te combineren met PBS en bewaar het mengsel op ijs.
- Verwarm Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (1g/L) (DMEM) voor tot 37 °C.
- Vul het DMEM-medium aan met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 200 E/ml penicilline, 200 μg/ml streptomycine en 500 pg/ml amfotericine B (zie Materiaaltabel) om DMEM-S te bereiden.
2. Dissectie en voorbereiding van het ruggenmerg
- Euthanaseer de muis met een intraperitoneale overdosis pentobarbital in een dosis van 150 mg/kg. Steriliseer de borstkas en rug van de muis met 70% ethanol.
OPMERKING: Bevestig dat de euthanasie succesvol was voordat u doorgaat met de muizendissectie. - Scheer het thoracolumbale gebied en bevestig de ledematen met plakband aan het dissectiebord.
- Maak met een scalpel een zorgvuldige incisie langs de dorsale middellijn van het occipitale naar het sacrale gebied (Figuur 2).
- Ontleed met behulp van een stereoscopische chirurgische microscoop in lagen totdat u de lumbale wervelkolom bereikt en de laatste ribbenboog identificeert.
OPMERKING: De 13 ribbenbogen zijn gearticuleerd in de borstwervels; wanneer ze worden ontleed, worden ze zichtbaar boven de L1-wervel2. - Bepaal de laatste halswervel en het heiligbeen en maak vervolgens een snede om de wervelkolom te scheiden (Figuur 2).
- Voer met behulp van een ontleedtang een dorsale laminectomie van de wervels uit om het ruggenmerg te extraheren (Figuur 3A-D).
OPMERKING: Met uitzondering van de eerste twee halswervels (atlas en as), hebben alle beweegbare wervels een gemeenschappelijk morfologisch ontwerp in verschillende regio's (cervicaal, thoracaal of lumbaal). Elke typische beweegbare wervel heeft een cilindrisch wervellichaam aan het voorste uiteinde. Aan de achterkant van het lichaam is een benige boog bevestigd die bekend staat als de wervelboog (neurale boog), bestaande uit laminae en doornuitsteeksels. Tussen deze structuren ligt het wervelforamen15. - Verwijder de zenuwen die door de foramina (dorsale en ventrale wortels) naar buiten komen en die het perifere zenuwstelsel vormen en geïnfiltreerde macrofagen kunnen bevatten (Figuur 3D).
OPMERKING: Het is niet nodig om de pia mater of hersenvliezen te verwijderen, aangezien het dichtheidsgradiëntmedium verontreinigende astrocyten effectief elimineert. Bovendien verkort het vasthouden van de hersenvliezen de zuiveringstijd en verbetert het de levensvatbaarheid.
3. Weefselvertering en isolatie van microglia
- Leg het ruggenmerg op het snijbord en knip met een Vannas-schaar het ruggenmerg in stukken van 2 mm, wat een gemiddelde van 10 stukken oplevert.
- Breng de delen van het ruggenmerg over naar een microbuis met platte bodem van 2 ml (Figuur 3E,F).
- Voeg 1 ml van de HBSS-LD werkoplossing toe (stap 1.2). Incubeer bij 37 °C gedurende 25 min, krachtig wervelend om de 5 min.
- Haal de inhoud van elke vertering door een zeef van 40 μm en voeg vervolgens 7 ml HBSS met 2% FBS toe om de vertering te neutraliseren.
- Plet het resterende weefsel met een spuitzuiger van 1 ml. Centrifugeer de suspensie in een conische buis van 50 ml gedurende 5 minuten bij 220 x g, 4 °C.
- Gooi het supernatans weg met een micropipet van 1 ml en resuspendeer de pellet in 2 ml HBSS met 2% FBS in een conische buis van 15 ml. Combineer met 2 ml 90% isotoon dichtheidsgradiëntmedium. Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 160 x g, 18 °C.
NOTITIE: Gebruik langzame acceleratie en vermijd het gebruik van de rem. - Gebruik een transferpipet om de interface op te halen en over te brengen naar een conische buis van 15 ml. Was de cellen met 10 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten op 220 x g, 4 °C.
- Resuspendeer de cellen in DMEM-S (stap 1.6) en bewaar ze op ijs.
4. Bepalen van zuiverheid/levensvatbaarheid
- Gebruik voor het kwantificeren van levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometerkamer een 0,4% Trypan-blauwe kleuring (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Gemiddeld levert een enkele muis 4-6 miljoen cellen. - Om levensvatbare cellen te kwantificeren via een flowcytometer, gebruikt u in de handel verkrijgbare amine-reactieve fluorescerende kleurstofkleuring (zie Tabel met materialen).
- Breng 1 miljoen cellen over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem (FACS). Verdun de fluorescerende kleurstof met PBS in een verhouding van 1:1000 (waardoor de levensvatbaarheidsoplossing ontstaat).
- Incubeer de monsters met de levensvatbaarheidsoplossing in het donker bij 4 °C gedurende 30 minuten. Was de cellen twee keer met ijskoud PBS. Resuspendeer de cellen in 400 μL kleuringsbuffer (stap 1.4).
- Blokkeer de cellen met 2.4G2 anti-FcRIII/I (zie materiaaltabel) gedurende 15 minuten bij 4 °C in de ijskoude kleuringsbuffer.
- Formuleer de antilichaamkleuringscocktail door de fluorescerend gelabelde monoklonale antilichamen CD45-PerCP en CD11b-eFluor 450 toe te voegen aan de kleuringsbuffer (bij een verdunning van 1:300) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Hoewel beide technieken beschikbaar zijn, kiest u degene die het beste aansluit bij het volgende protocol. - Incubeer de monsters met de antilichaamkleuringscocktail in het donker bij 4 °C gedurende 30 min. Was de cellen twee keer met ijskoude kleuringsbuffer. Resuspendeer de cellen in 400 μL kleuringsbuffer.
- Verkrijg 250.000 gebeurtenissen op een flowcytometer, zoals uiteengezet in de poortstrategie in stap 6 (Figuur 4).
5. Immunofluorescerende kleuring
- Plaats een voorbehandeld dekglaasje in een kuiltje van een bord met 6 putjes.
OPMERKING: Om dekglaasjes te behandelen, plaatst u ze in een petrischaal met 500 μL L-polylysineoplossing (0,01 mg/ml, zie tabel met materialen) en incubeert u gedurende 1 uur. Was ze daarna drie keer met gedestilleerd water en laat ze drogen. - Zaai 200.000 cellen op het behandelde dekglaasje met 500 μL DMEM-S-oplossing. Incubeer gedurende 24 uur.
- Verwijder de dekglaasjes en fixeer de cellen met 3,7% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de dekglaasjes drie keer met ijskoud PBS.
- Permeabiliseer de cellen met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dekglaasjes drie keer met koud PBS. Blokkeer de cellen met 0,2% BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun de fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen (bij een verdunning van 1:300, zie Materiaaltabel) in de blokkeringsoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dekglaasjes drie keer met ijskoud PBS.
- Breng montagemedium met DAPI aan op het glaasje en sluit het vervolgens af met een dekglaasje.
OPMERKING: De objectglaasjes kunnen onmiddellijk worden geanalyseerd met behulp van een fluorescentie- of confocale microscoop, of ze kunnen maximaal 3 maanden worden bewaard bij -20°C.
6. Poortstrategie voor microglia van het ruggenmerg
- Genereer een dot plot en creëer een poort om levensvatbare cellen te isoleren op basis van levensvatbaarheidskleuring en een leeg fluorescerend kanaal16. Sluit niet-levensvatbare cellen uit.
- Maak nog een plot met behulp van voorwaartse en zijwaartse verspreidingsparameters om puin te elimineren16.
- Ontwikkel een extra puntplot en analyseer de expressie van CD11b en CD45 om microglia te onderscheiden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van ruggenmergweefsel van muizen werd enzymatische vertering uitgevoerd met behulp van een mengsel dat sterk verrijkt was met collagenase en thermolysine. Het resulterende verteerde weefsel onderging een passage door een filter van 40 μm om onverteerd materiaal te verwijderen. De verzamelde cellen werden verrijkt door middel van een Percoll-dichtheidsgradiënt, met 90% in het onderste gedeelte en 45% in het bovenste gedeelte. De met microglia verrijkte cellen binnen het grensvlak werden vervolgens gekleurd met ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn talloze protocollen ontwikkeld voor de studie van microglia vanwege hun betekenis in de homeostase van de hersenen. Bij deze methoden zijn microglia meestal afkomstig van de hersenhelften van embryonale of neonatale ratten en muizen17. Een beperkt aantal studies heeft zich gericht op de zuivering van microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen13,14. Deze technieken omvatten enzymatische vertering met behulp van collagenase en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de beurs die werd toegekend door de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie (CONACYT) (702361). De auteurs erkennen de Ph.D. programma in Biologische Chemische Wetenschappen van de National School of Biological Sciences van het National Polytechnic Institute.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL collectiebuizen | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collectiebuizen | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibioticum-Antimycoticum (penicilline, streptomycine, amfotericine b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antilichaam CD11b eFluor 450 anti-muis | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antilichaam CD45 PerCP anti-muis | BioLegend, USA | 103130 | |
| Gebalande zout-oplossing (PBS) calcium- magnesium-vrij | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blauwe Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Dekglasjes | |||
| Digitaal verwarmd schuddroger | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissectietang voor microchirurgie | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium-hoge glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Elektrisch scheerapparaat | |||
| FACS buis | Thermo, USA | 352058 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s gebalanceerde zout-oplossing | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer kamer Telkamers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | dichtheidsgradiëntcentrifugatie |
| Poly-L-lysine oplossing | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel Nr. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifugebuizen 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopische microscoop | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Rechte chirurgische schaar (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Rechte Vannas schaar | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypanblauw Kleur 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactieve fluorescente kleurstofkleuring |
Referenties
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
