Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time beeldvorming van acrosomale calciumdynamiek en exocytose in levend muizensperma
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acrosoom-exocytose (AE), waarbij het enkele exocytotische blaasje van het sperma versmelt met het plasmamembraan, is een complex, calciumafhankelijk proces dat essentieel is voor bevruchting. Ons begrip van hoe calciumsignalering AE reguleert, is echter nog steeds onvolledig. Met name de wisselwerking tussen intra-acrosomale calciumdynamiek en de tussenstappen die tot AE leiden, is niet goed gedefinieerd. Hier beschrijven we een methode die ruimtelijk en temporeel inzicht geeft in de acrosomale calciumdynamiek en hun relatie met membraanfusie en daaropvolgende exocytose van het acrosoomblaasje. De methode maakt gebruik van een nieuwe transgene muis die een Acrosoom-gerichte sensor voor exocytose (AcroSensE) tot expressie brengt. De sensor combineert een genetisch gecodeerde calciumindicator (GCaMP) gefuseerd met mCherry. Dit fusie-eiwit is speciaal ontworpen om de gelijktijdige observatie van acrosomale calciumdynamiek en membraanfusiegebeurtenissen mogelijk te maken. Real-time monitoring van de acrosomale calciumdynamiek en AE in levend AcroSensE-sperma wordt bereikt met behulp van een combinatie van beeldvorming met hoge framesnelheid en een stimulerend toedieningssysteem dat zich kan richten op enkelvoudig sperma. Dit protocol geeft ook verschillende voorbeelden van basismethoden om de ruwe gegevens te kwantificeren en te analyseren. Omdat het AcroSensE-model genetisch gecodeerd is, kan de wetenschappelijke betekenis ervan worden vergroot door gebruik te maken van direct beschikbare genetische hulpmiddelen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of op genbewerking (CRISPR) gebaseerde methoden. Met deze strategie kunnen de rollen van aanvullende signaalroutes bij de capacitatie en bevruchting van sperma worden opgelost. Samenvattend biedt de hier beschreven methode een handig en effectief hulpmiddel om de calciumdynamiek in een specifiek subcellulair compartiment - het sperma-acrosoom - te bestuderen en hoe die dynamiek de tussenstappen reguleert die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Inleiding
Sperma verwerft het vermogen om te bevruchten tijdens een proces dat capacitatie1 wordt genoemd. Een eindpunt van dit proces is dat het sperma het vermogen verwerft om AE te ondergaan. Meer dan twee decennia aan gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een complex, meerstapsmodel van AE in sperma van zoogdieren (samengevat in 2,3). Het bestuderen van AE in levend sperma is echter een uitdaging, en de momenteel beschikbare methoden om dit proces met voldoende resolutie te volgen, zijn omslachtig en vereisen meerdere voorbereidingsstappen4, zijn beperkt tot de detectie van de laatste stap van AE (bijv. met behulp van PNA5), zijn beperkt tot metingen van veranderingen in cytosolisch calcium (in tegenstelling tot de acrosomale calciumdynamiek), of zijn beperkt tot metingen van cytosolische calciumdynamiek of AE6.
Om enkele van de belangrijkste beperkingen van real-time AE-studies onder fysiologische omstandigheden te overwinnen en om onderzoek naar de wisselwerking tussen calciumdynamiek en AE mogelijk te maken, werd een uniek muismodel gegenereerd. In dit muismodel wordt een fusie-eiwit bestaande uit de genetisch gecodeerde Ca2+-sensor (GCaMP3) en mCherry tot expressie gebracht en gericht op het acrosoom met behulp van een acrosinepromotor en signaalpeptide2. De gerichte dubbele GCaMP3-mCherry-sensor maakt gelijktijdige real-time metingen van calciumconcentraties en de status van de acrosomale inhoud in levend sperma onder fysiologische omstandigheden mogelijk met behulp van microscopie en een eencellig afgiftesysteem voor stimulerende middelen (Figuur 1). Als onderdeel van de acrosomale matrix zouden membraanfusie en AE resulteren in het verlies van de fotostabiele en pH-ongevoelige mCherry-fluorescentie uit het sperma, aangezien dit eiwit uit het acrosoomblaasje diffundeert. In dit opzicht is het vermogen van het model om de timing en het optreden van AE weer te geven vergelijkbaar met de voordelen van de acrosoomgerichte GFP-muislijn 7,8,9.
De GCaMP3-variant die in deze transgene muizenlijn wordt gebruikt, heeft een geschatte KD van 400 μM en een dynamisch bereik voor Ca2+ van 10-4-10-3 M10, wat geschikt is voor dit blaasje. We toonden aan dat deze combinatie van kenmerken van GCaMP3 de vorming van fusieporiën tussen het plasmamembraan en het buitenste acrosomale membraan (OAM)2 kon onthullen. De detectie van fusieporiën is het gevolg van het feit dat de poriegrootte te klein is om het AcroSensE-eiwit uit het acrosoom te laten dispergeren (via verlies van acrosoomgehalte) en tegelijkertijd een membraankanaal te bieden dat de instroom van Ca2+-ionen in het acrosoomlumen mogelijk maakt, wat leidt tot een toename van de fluorescentie-intensiteit van het GCaMP3.
Het heldere, monomeer, niet-calciumgevoelige fluorescerende eiwit mCherry ondersteunt de visualisatie van het acrosoom terwijl het GCaMP3-signaal zwak is (bijv. voorafgaand aan Ca2+ -binding, Figuur 2), en belangrijker nog, het maakt ook de identificatie mogelijk van acrosoom-intacte zaadcellen die geschikt zijn voor beeldvorming.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van het unieke AcroSensE-muismodel en de methoden voor microscopie die experimenteel worden gebruikt om de dynamiek van AE en spermacalcium met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Cornell University (#2002-0095). 8-10 weken oude AcroSensE-muizen2 werden gebruikt voor de huidige studie. Verzoeken om informatie over de beschikbaarheid van de AcroSensE-muizen kunnen worden ingediend bij de betreffende auteur.
1. Sperma verzamelen en wassen
- Verzamel cauda epididymaal sperma (meer details over deze procedure vindt u in11) van AcroSensE-muizen. Laat 15 minuten uitzwemmen in een weefselkweekschaaltje van 3,5 cm met 0,5 ml Modified Whitten's medium (MW) bij 37 °C. De schotel moet worden afgedekt om de verdamping van de MW te verminderen en moet worden gekanteld zodat het medium voldoende diepte heeft om de cauda epididymides te bedekken.
OPMERKING: Het medium (MW) van gemodificeerd Whitten omvat 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pyrodruivenzuur, 4.8 mM melkzuur hemi-Ca2+ zout, pH 7.35. Glucose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) en 2-hydroxypropyl-cyclodextrine (CD; 3 mM) worden aangevuld (zie Materiaaltabel) als dat nodig is voor inductie van capaciteit, en concentraties kunnen worden gewijzigd voor specifieke experimenten. Bovendien kunnen alternatieve sterolacceptoren worden gebruikt in plaats van CD (bijv. runderserumalbumine of lipoproteïnen met hoge dichtheid). - Verwijder met een fijne pincet eventueel bijbalweefsel uit de opvangschaal voor het uitzwemmen. Breng het medium met het sperma over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer de suspensie op 100 x g gedurende 1 minuut in een zwenkbare emmerrotor bij kamertemperatuur. Verwijder met een plastic pipet het MW-supernatans met het sperma uit alle grove weefselresten die bij deze stap zijn gepelleteerd.
- Breng het MW-supernatans dat het sperma bevat op een totaal volume van 3 ml door MW bij 37 °C toe te voegen. Centrifugeer op 400 x g gedurende 8 minuten (bij kamertemperatuur) in een buis met ronde bodem. Verwijder langzaam het supernatans MW uit het losjes gepelleteerde sperma.
- Als het levensvatbaar is, moet het sperma verschijnen als een "donzig" uitziende pellet. Resuspendeer het sperma voorzichtig via trituratie met een transferpipet met grote boring of via zachte handmatige tikken op de buis ("vingertikken"). Eenmaal gelijkmatig geresuspendeerd, brengt u ze over in een nieuwe buis met ronde bodem. Gebruik 10-20 μL van de spermasuspensie om de beweeglijkheid te tellen en te beoordelen. Verdun sperma in MW voor gebruik.
OPMERKING: Voor de meeste experimenten met de capaciteit van muizensperma wordt een uiteindelijke concentratie van 5-10 miljoen sperma/ml MW gebruikt. Het hier beschreven beeldvormingsprotocol vereist geen capaciteit van sperma, hoewel het noodzakelijk is dat sperma het vermogen verwerft om fysiologisch relevante acrosoomexocytose te ondergaan. Men zou pathologische exocytose of exocytose kunnen bestuderen die wordt geïnduceerd door reagentia zoals een calciumionofoor zonder het sperma te capaciteren. Daarnaast zou men mogelijke veranderingen in acrosomaal calcium in niet-capaciterende cellen kunnen onderzoeken als reactie op verschillende stimuli. - Gebruik het sperma binnen 3-5 uur na het verzamelen, waarbij u de tijd zo kort mogelijk houdt en consistent houdt tussen experimentele onderzoeken.
- Voer alle stappen van verzamelen en wassen uit bij 37 °C met behulp van MW-medium, waarbij methoden worden gebruikt om schade aan het membraan tot een minimum te beperken. Dit omvat het gebruik van plastic transferpipetten met een grote diameter of pipetpunten met een grote opening, die worden aanbevolen voor gebruik tijdens alle fasen van de procedure.
2. Poly-D-lysine-coating van dekglaasjes voor beeldvorming
OPMERKING: Poly-D-lysine (PDL) gerechten moeten voor elk experiment vers worden bereid.
- Doseer een druppel PDL van 0,5 μl (0,5 mg/ml, zie materiaaltabel) in het midden van een dekglaasje.
- Smeer met een gegradueerde punt van 10 μl de PDL-druppel over het dekglaasje (kriskras patroon zoals weergegeven in figuur 1B).
- Laat 10 minuten drogen bij 37 °C. Bewaar servies met PDL-coating afgedekt en op 37 °C tot gebruik.
3. Capillair trekken, laden voor puffen
- Trek de capillairen van borosilicaatglas (buitendiameter, 2 mm, binnendiameter, 1.56 mm, zie materiaaltabel) met behulp van de volgende instellingen: warmte: 330, trekkracht: 250, snelheid: 250 en tijd: 70. Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke trekker die wordt gebruikt.
- Vul voor elk experiment een enkel capillair met de stimulerende oplossing die 3-5x de concentratie van het stimulerende middel bevat (om rekening te houden met de snelle diffusie van de oplossing bij het puffen). Gebruik voor het vullen een fijn pincet om de capillaire punt op ongeveer 1-2 mm van het uiteinde open te breken. Dit zou een openingsdiameter van ∼5 μm moeten opleveren. Thermisch polijsten is niet nodig.
- Injecteer de stimulerende oplossing met behulp van een dunne plastic transferpipet langzaam in het capillair totdat driekwart van de lengte vol is.
- Verwijder eventuele luchtbellen die tijdens het vullen zijn ontstaan door zachtjes op het capillair te tikken.
- Monteer gevuld capillair op de micromanipulator (zie Tabel met materialen).
4. Voorbereiding van de toediening van stimulatie voor puffen
NOTITIE: Om het risico op letsel van de gebruiker tot een minimum te beperken, moet tijdens de uitvoering van de puffprocedure een veiligheidsbril worden gedragen.
- Stel de instellingen van het eencellige afgiftesysteem in om een puls van 10 s bij 5 psi te leveren.
- Sluit het capillair van borosilicaat aan op de pipethouder van het eencellige toedieningssysteem. Zorg ervoor dat de afdichtingen goed vastzitten.
- Terwijl u de capillaire punt observeert, brengt u een korte puf van 2 s bij 20 psi aan om ervoor te zorgen dat de oplossing inderdaad door het uiteinde van de punt wordt gedoseerd (een kleine druppel moet duidelijk zijn aan het einde van de punt).
5. Microscopie en beeldacquisitie
OPMERKING: Er zijn meerdere merken microscopen beschikbaar en kunnen worden gebruikt; Een minimale framerate van 3 frames/s is echter wenselijk. Houd er met betrekking tot temperatuur- en omgevingsregeling rekening mee dat de werkelijke temperatuur van het medium in de schaal moet worden bevestigd, bijvoorbeeld met behulp van een contactloze infraroodthermometer.
- Voeg 80 μL verdund sperma toe aan het midden van een poly-D-lysine-gecoate 35 mm dekglaasje. Voor de meeste experimenten met de capaciteit van muizensperma wordt een eindconcentratie van 5-10 miljoen zaadcellen/ml gebruikt.
- Voeg langzaam 3 ml warm (37 °C) MW-basismedium toe aan het sperma, aangevuld met 10 mM CaCl2.
OPMERKING: Men zou experimenten kunnen uitvoeren bij kamertemperatuur om cellulaire processen te vertragen, maar het is belangrijk op te merken dat, omdat capacitatie wordt gemedieerd door lipidenuitwisselingen en de vloeibaarheid van micro- en macrodomeinen, men in gedachten moet houden dat fysiologisch relevante capacitatie en acrosoomexocytose temperatuurafhankelijke processen zijn. - Monteer het schaaltje met het sperma op de microscoop (voorverwarmd tot 37 °C).
- Prikkel de GCaMP3 met behulp van een 488 nm laserlijn en bekijk met een 505-550 nm banddoorlaat (BP) filter. Prikkel de mCherry met behulp van een 555 nm laserlijn en bekijk met een 575-615 nm BP-filter.
- Gebruik een micromanipulator (het wordt aanbevolen om de manipulator te bevestigen aan de luchttafel waarop de microscoop is opgesteld.), plaats de punt van het capillair ongeveer 100 μm opzij en 5-10 μm boven het vlak van de betreffende cel.
OPMERKING: De stimulerende oplossingen worden gemaakt in een concentratie van 3-5x de normale concentratie om de snelle diffusie in het volume tussen het capillair en de cel te compenseren. - Start de beeldvormingssequentie op de microscoop.
- Breng zaadcellen in beeld met een hoge framesnelheid, bij voorkeur >10 frames/s. Hier werd een resonantiescanner gebruikt die beeldvorming met 33 ms/frame mogelijk maakt.
- Tien seconden na het starten van de beeldacquisitie op de microscoop, activeert u het eencellige afgiftesysteem om de 10 seconden trek van het stimulerende middel te starten.
- Beeldcellen voor een duur van 10-15 min.
- Gebruik het afgiftesysteem met één cel om meerdere cellen van een enkele schaal af te beelden volgens de locaties in figuur 1B.
OPMERKING: Onbehandeld/niet-gestimuleerd sperma onder de microscoop zou overwegend rood moeten lijken, met een lage intensiteit van het groene signaal. Spermakoppen moeten aan het dekglaasje worden bevestigd en levend sperma kan worden geïdentificeerd aan de hand van hun bewegende staarten. In sperma dat AE ondergaat, zal het groene signaal van GCaMP3 in eerste instantie toenemen, en zowel het rode signaal van mCherry als het groene signaal van GCaMP3 zullen verdwijnen als AE volledig is, zoals geïllustreerd in figuur 2. De vermindering van mCherry-fluorescentie biedt een meer specifieke indicator van het tijdstip waarop AE begint, omdat veranderingen in Ca2+- concentraties voortdurend veranderingen in de GCaMP3-fluorescentie-intensiteit zullen veroorzaken.
6. Beeld- en data-analyse
OPMERKING: Offline beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ (zie Tabel met materialen). Eerder werden verschillende tussenstappen gerapporteerd in het proces dat leidde tot AE, waaronder acrosomale calciumstijging (ACR) en volledige membraanfusie. Dit laatste leidt tot het verlies van mCherry-fluorescentie en vertegenwoordigt daarom volledige AE. In sommige cellen worden signalen waargenomen die lijken op pre-spike foot events (PSF) bij het gebruik van amperometrische benaderingen in onderzoeken naar exocytose (zie2 voor meer details). Er zijn verschillende optionele methoden beschikbaar voor het analyseren van de ruwe AcroSensE-gegevens om ACR, AE en de tussenstappen ervan te kwantificeren. Hieronder worden enkele van de basisanalysemethoden beschreven.
- Afhankelijk van de specifieke bestandsextensie van het microscoopsysteem, gebruikt u het gereedschap voor gesplitste kanalen (Image > Colors > Split Channels) om afzonderlijke vensters te genereren voor de GCaMP3- en mCherry-kanalen.
- Synchroniseer de afzonderlijke vensters met behulp van de tool "Venster synchroniseren" (Analyseer > Hulpprogramma's > Synchroniseer Windows).
- Selecteer een interessegebied (ROI) rond de spermakop in het rode kanaal om het acrosoomgebied op te nemen (Figuur 3A,B). Met de synchronisatietool kan dezelfde gebiedsselectie automatisch worden toegepast op het groene kanaal, waarin het sperma nog te zwak is om zichtbaar te zijn.
- Kies de plug-in "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) of "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) om de verandering in fluorescentie-intensiteit uit te zetten als functie van frames/tijd voor elk van de twee kanalen.
- Kopieer gegevens naar spreadsheetsoftware (bijv. Microsoft Excel) voor plotten en verdere analyse.
OPMERKING: Zodra de gegevens naar een spreadsheet zijn gekopieerd, kunnen meerdere parameters worden geëxtraheerd voor analyse, waaronder de volgende, zoals geïllustreerd in afbeelding 4.- Fusion Pore (FP) starttijd: meet de tijd vanaf tijdstip 0 tot het tijdstip waarop het GCaMP3-signaal begint te stijgen. Deze parameter geeft de vertraging aan tussen de stimulatie en de ACR-respons van het sperma.
- AE-starttijd: meet de tijd vanaf tijdstip 0 tot het tijdstip waarop het mCherry-signaal begint te vervallen. Deze parameter geeft de vertraging aan tussen de stimulatie en de AE-respons van het sperma. Deze parameter kan ook worden gebruikt om de vertraging tussen FP-vorming en AE-respons te berekenen.
- Piek FP-amplitude: meet het fluorescentiesignaal van de basis tot de piek van de GCaMP3-signaalstijging. Deze parameter geeft de totale toename van de ACR-respons aan.
- Verliessnelheid van mCherry: bepaal deze parameter door een lineaire of een exponentiële fit op het gedeelte van het mCherry-signaalverlies (zoals aangegeven door "helling" in figuur 4B).
NOTITIE: U kunt ook de vervalsnelheid bepalen met behulp van de restsignaalmethode (R) op verschillende tijdstippen (bijv. R60: duurtijd in seconden tot een restsignaal van 60% vanaf de basislijn van het mCherry-signaal). Deze parameter kan worden gebruikt om de snelheid te kwantificeren waarmee het acrosomale gehalte bij AE wordt verspreid. - Signaalafname voor mCherry-verlies: bepaal het verschil in amplitude tussen de baseline mCherry-fluorescentie-intensiteit en het signaal na AE. Deze parameter geeft de totale hoeveelheid acrosomale inhoud aan die op AE is verspreid.
- Teken de veranderingen in fluorescentie (F) voor zowel het rode als het groene kanaal als onbewerkte gegevens, of normaliseer ze met de initiële fluorescentie (F0) en druk ze uit als ΔF/F0. Dit laatste zorgt voor een betere visualisatie van de veranderingen in zowel rood als groen op een enkel perceel (zie bijvoorbeeld figuur 3D en figuur 3H).
OPMERKING: Ten slotte kunnen de verschillende gemeten parameters worden vergeleken tussen verschillende omstandigheden om de relatie tussen veranderingen in de acrosomale calciumconcentratie en AE te bepalen. Voor voorbeelden van verschillende experimentele conditievergelijkingen, zie referentie2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 geeft een vereenvoudigde illustratie van de opeenvolging van fluorescentieveranderingen die worden verwacht na de succesvolle stimulatie van sperma. Het bovenste paneel van figuur 2 illustreert de veranderingen in de intensiteit van de GCaMP3-fluorescentie, waarbij het signaal aanvankelijk zwak is (de baseline acrosomale calciumconcentraties zijn lager dan GCaMP3 KD), en bij het binnendringen van calciumionen via fusieporiën neemt de fluorescen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een op microscopie gebaseerde methode beschreven om het nieuw gegenereerde AcroSensE-muismodel te gebruiken voor real-time, single-cell monitoring en analyse van het samenspel tussen acrosomale calciumdynamiek en tussenstappen die leiden tot AE. Samen met direct beschikbare genetische benaderingen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of genbewerking, bieden dit model en deze methode een krachtig systeem om de rol te bestuderen van verschillende componenten en routes die deelnemen aan spermasignal...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen auteurs die belangenconflicten te melden hebben met betrekking tot dit werk.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies R01-HD093827 en R03-HD090304 (A.J.T).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100x olie objectief | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrine | Sigma | C0926 | |
| 35 mm dekglasschaaltje, 1,5 dikte | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL ronde bodembuis | Falcon | 352054 | |
| Borosilicaat glas capillairen | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocale microscoop | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Geleid tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Melkzuur | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscoop Incubatie Systemen | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipet Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Kunststof overdrachtpipet | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyrowijnzuur | Sigma | 107360 | |
| Single cell leveringssysteem | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
Referenties
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868(2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273(2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
