Een eenvoudige manchettechniek voor linkerlongtransplantatie bij muizen

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een manchettechniek voor een linkerlongtransplantatiemodel van een muis. Deze techniek is gedurende meerdere jaren ontwikkeld en heeft goed gepresteerd, waardoor hij effectief van pas kwam in immunologisch onderzoek.

Samenvatting

In het afgelopen decennium heeft ons laboratorium aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het ontwikkelen en verfijnen van gevasculariseerde longtransplantatiemodellen bij muizen met behulp van een efficiënte en zeer betrouwbare "manchettechniek" van transplantatie. Dit artikel beschrijft een geavanceerde en uitgebreide methode voor orthotope longtransplantatie in een gevasculariseerd orthotopisch longmodel, dat het meest fysiologische en klinisch relevante model van longtransplantatie bij muizen tot nu toe vertegenwoordigt. Het transplantatieproces bestaat uit twee verschillende fasen: donoroogst en daaropvolgende implantatie in de ontvanger. De methode is met succes onder de knie en met enkele maanden voldoende training kan een bekwame beoefenaar de procedure in ongeveer 90 minuten van huid op huid uitvoeren. Verrassend genoeg nadert het overlevingspercentage tijdens de perioperatieve periode, zodra individuen de initiële leercurve hebben overwonnen, bijna 100%. Het muismodel maakt het mogelijk om meerdere in de handel verkrijgbare transgene en mutante muizenstammen te gebruiken, waardoor tolerantie en afstoting kunnen worden bestudeerd. Bovendien maken de unieke kenmerken van dit model het een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van tumorbiologie en immunologie.

Inleiding

Hoewel er vervangende therapieën, zoals dialyse en ventriculaire hulpmiddelen, bestaan voor mensen met nier- en hartfalen, blijft longtransplantatie de primaire behandelingsoptie voor patiënten die lijden aan longziekte in het eindstadium. Deze procedure dient als de enige levensreddende keuze voor personen met de diagnose longfibrose¹. Bovendien wordt het gebruikt om de levensduur te verlengen van mensen die te maken hebben met obstructieve longziekten in het eindstadium, zoals emfyseem, evenals mensen met etterende aandoeningen zoals cystische fibrose¹.

Hoewel de overlevingspercentages op korte termijn zijn verbeterd als gevolg van technische verfijningen, verbeteringen in de perioperatieve zorg en vooruitgang in immunosuppressie, zijn de langetermijnresultaten na longtransplantatie duidelijk inferieur aan die van andere solide organen. Het totale overlevingspercentage van vijf jaar van slechts 50% voor ontvangers van een longtransplantaat is veel lager dan voor degenen die hart-, nier- of levertransplantaten krijgen¹. Ons team en anderen hebben vermoed dat de reden voor een dergelijke discrepantie het gebrek is aan klinisch relevante biologische modellen om routes die leiden tot afstoting en/of tolerantie van longtransplantaten volledig te begrijpen, aangezien experimentele manipulatie van fysiologisch relevante muismodellen aanzienlijk heeft bijgedragen aan de overleving op lange termijn van andere vaste of cellulaire allotransplantaten².

Voorafgaand aan de ontwikkeling van het orthotope longtransplantatiemodel bij muizen, vertrouwden onderzoekers op grotere diermodellen voor hun studies. Deze grotere modellen hadden echter beperkingen, waaronder een gebrek aan transgene mutanten die nodig waren voor het onderzoeken van mechanistische vragen³. Bovendien hadden studies bij ratten te maken met vergelijkbare beperkingen⁴, en niet-gevasculariseerde heterotope tracheale transplantatiemodellen bij muizen waren ook beperkt tot hun bruikbaarheid⁵. Onderzoek heeft het belang aangetoond van het gebruik van gevasculariseerde transplantatiemodellen in plaats van niet-gevasculariseerde transplantatiemodellen in verschillende orgaansystemen. Niet-gevasculariseerde transplantaten van neonataal hartweefsel die in de oorschelp van ontvangende muizen worden ingebracht, hebben bijvoorbeeld geen directe interactie met het vasculaire endotheel en de bloedbaan van de ontvanger. Daarom zijn ze beperkt in hun relevantie in vergelijking met gevasculariseerde menselijke harttransplantaten⁶. Op een vergelijkbare manier verschilt het heterotope tracheale transplantatiemodel, dat geen vascularisatie en beluchting heeft, significant van menselijke longtransplantaties, met name in de waargenomen luchtwegveranderingen in kleine luchtwegen na transplantatie. Bovendien weerspiegelt het snelle begin van fibrotische occlusie in heterotope tracheale allotransplantaten geen waarnemingen in menselijke longen of in gevasculariseerde longtransplantaten bij grotere dieren of ratten⁷.

In ons onderzoekslaboratorium werd de creatie van het orthotope longtransplantatiemodel bij muizen geïnspireerd op het orthotope enkelvoudige longtransplantatiemodel dat is vastgesteld bij ratten ^8,9. In tegenstelling tot mensen hebben muizen en ratten slechts één kwab in hun linkerlong, die slechts vijfentwintig procent van de totale longmassa uitmaakt. Deze functie maakt de succesvolle uitvoering van linkerlongtransplantatie in muizenmodellen mogelijk zonder dat ondersteuning van de bloedsomloop nodig is^10,11. In de loop van de tijd hebben we technische wijzigingen in het model aangebracht en in deze context worden de belangrijkste stappen toegelicht die het uitvoeren van de procedure vergemakkelijken.

Naast de implicaties voor onderzoek naar transplantatie-immunobiologie, biedt het orthotope longtransplantatiemodel bij muizen een robuust instrument voor het onderzoeken van de rol van pulmonale niet-hematopoëtische stromale cellen in verschillende ziekteprocessen. Dit gebeurt omdat een mutante syngene enkelvoudige longtransplantatie leidt tot een bijna volledige vervanging van hematopoëtische cellen door van de ontvanger afgeleide cellen, terwijl niet-hematopoëtische stromale cellen afkomstig blijven van de donor. Bijgevolg kan een "chimeer orgaan" worden gecreëerd zonder bestraling van de gastheer of longspecifieke expressie van een transgen¹². Bovendien kan de inheemse long aan de andere kant functioneren als een interne controle binnen hetzelfde dier zonder wijdverspreide veranderingen in het immuunsysteem van de gastheer te veroorzaken. Dit model is veelbelovend voor het bevorderen van onderzoek naar longtransplantatie en andere ziekteroutes waarbij pulmonale stromale cellen betrokken zijn.

Protocol

Alle diergerelateerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en kregen goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Maryland, Baltimore. Het wordt aanbevolen om mannelijke, 8-12 weken (20-25 g), BALB/c-muizen als donor en C57BL/6-muizen als ontvanger te gebruiken. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Tabel met materialen).

1. Voorbereiding van bronchiale en vasculaire manchetten

timing: 10 min (voor drie manchetten)

1. Bereid de bronchiale manchet voor met behulp van een angiokatheter van 18 G en de pulmonale veneuze manchet met behulp van een angiokatheter van 20 G met een lengte van 1 mm (exclusief de verlengingshendel) (zie materiaaltabel). Gebruik een #11 scalpel en de metalen naald van de angiokatheter die als snijoppervlak dient (Figuur 1).
2. Bereid de manchet van de longslagader op dezelfde manier voor met behulp van een angiokatheter van 24 G met een lengte van 0,6 mm (zie materiaaltabel).
   OPMERKING: De algemene basisprincipes van de manchettechniek voor het maken van microvasculaire anastomosen zijn als volgt: bij het vaststellen van microvasculaire anastomosen voor longtransplantatie bij muizen worden specifieke manchettechnieken gebruikt vanwege de kleine omvang van de bloedvaten. In tegenstelling tot grotere bloedvaten, die direct kunnen worden gehecht, vereisen de microscopisch kleine bronchiale en vasculaire verbindingen een aparte methode. Het fundamentele principe is het passeren van het donorvat door een stijve ronde manchet die iets groter is dan het vat zelf.

2. Donorprocedure

tijdsduur: 10-15 min

1. Dien een intraperitoneale (i.p.) injectie toe van 50 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine (zie materiaaltabel) om de donormuis te verdoven (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
2. Nadat u voor voldoende anesthesie hebt gezorgd door in de tenen te knijpen, scheert u de donormuis en plaatst u deze in rugligging onder de operatiemicroscoop met een vergroting van 10x.
3. Injecteer 50 μl heparine (zie tabel met materialen) door de penisader (figuur 2A).
4. Snijd de luchtpijp af en breng een angiokatheter van 20 G in en omcirkel deze vervolgens met een 6-0 zijden hechtdraad (zie materiaaltabel). Sluit de katheter aan op het beademingsapparaat (Figuur 2B).
5. Voer een middellijn abdominale incisie uit (laparotomie) en maak een circumferentiële incisie in het middenrif (Figuur 2C).
6. Voer een middellijn sternotomie¹² uit en plaats twee tangen aan weerszijden van het borstbeen voor hemostase en terugtrekking van de botranden (Figuur 2D).
7. Verwijder de thymus en snijd de rechter en linker atriale aanhangsels weg om de ontluchting van eventuele afvoer uit de longen te vergemakkelijken.
8. Injecteer 3 ml koude, in de handel verkrijgbare conserveringsoplossing van 4 °C (zie materiaaltabel) rechtstreeks in de rechterventrikel of wortel van de longslagader, met behulp van een naald van 27 g op een spuit van 3 ml om al het bloed uit de longen te spoelen.
   OPMERKING: Intraventriculaire of longslagaderinjectie kan letsel aan de donorlong veroorzaken. Het is van cruciaal belang om tijdens het spoelen voldoende ventilatie te handhaven om een gelijkmatige verdeling van de conserveringsoplossing te garanderen.
9. Klem de luchtpijp proximaal vast en verdeel de luchtpijp vervolgens distaal. Ontleed vervolgens de luchtpijp caudaal en posterieur¹².
10. Verwijder het hart-longblok en breng het over naar een klein petrischaaltje, steriel en bekleed met gaasje bevochtigd met een koude conserveringsoplossing. Plaats deze petrischaal vervolgens in een grotere gevuld met ijs (Figuur 2E).
11. Om het linker hilum bloot te leggen, plaatst u een klein gaasje op zowel het linker- als het rechterlongweefsel om het terug te trekken (Figuur 2F).
12. Scheid de hilaire structuren voorzichtig van elkaar met behulp van een gebogen tang met precisie. Ontleed de linker longslagader (PA) van de bronchiën (Figuur 2G). Ontleed vervolgens de longader (PV), gelegen in het meest caudale aspect van het hilum van de bronchus op een vergelijkbare manier (Figuur 2H).
    1. Knip de PA en PV op de langst mogelijke lengte voor een goede manchet. Probeer te voorkomen dat u overtollig vet of lymfoïde weefsel wegsnijdt, omdat dit de cuffing-stap moeilijk kan maken.
13. Plaats de PV-manchet ongeveer 2 mm boven de longslagader met behulp van de stabilisatie clamp en steek vervolgens de PV in de manchet. Vouw de PV over de manchet, waardoor het endotheeloppervlak bloot komt te liggen (Figuur 2I). Zet het vast rond de manchet met 10-0 hechtdraad (2 knopen) (Figuur 2J).
14. Verdeel de PA weg van het hilum en plaats de manchet op dezelfde manier op de PA.
    OPMERKING: Snijd in dit stadium geen bronchus. Zorg er in plaats daarvan voor dat u de bronchiën vlak voor de implantatie vastmaakt om te voorkomen dat de conserveringsoplossing op het moment van opslag in de luchtwegen terechtkomt. Dompel het longblok onder in de conserveringsoplossing bij een temperatuur van 4 °C.

3. Procedure voor de begunstiging

tijdsduur: 50-60 min

1. Verdoof de ontvangende muis met een mengsel van ketamine (50 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) (intraperitoneaal) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Scheer vervolgens de linkerborst en intubeer¹².
2. Voer de intubatie uit onder direct zicht door de tong voorzichtig uit de mond terug te trekken en daardoor de stembanden bloot te leggen. Voer dit uit onder de snijscoop met 10x vergroting. Intubeer het dier door een angiokatheter van 20 G x 1,25 inch rechtstreeks tussen de stembanden in te brengen.
3. Plaats het dier in de rechter laterale decubituspositie en reinig de borstwand met 70% ethanol. (Figuur 3A).
4. Gebruik een schaar om de huid in te snijden en voltooi de linker thoracotomie volledig met elektrocauter (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Om bloedverlies van de borstwand tijdens deze stap tot een minimum te beperken, gebruikt u elektrocauterisatie voor alle delen van deze dissectie. De huid moet worden gedroogd na het afvegen met ethanol, omdat elektrocauterisatie in combinatie met ethanol een brandrisico met zich meebrengt.
5. Ga de kist binnen vanuit de^3e of 4e^intercostale ruimte en plaats twee kistretractors (zie materiaaltabel) (Figuur 3B).
6. Na de thoracotomie brengt u de muis over naar rugligging. Buig het lichaam van de ontvangende muis lichtjes om de linkerborst dichter bij de bediener te brengen, waardoor het zicht op de hilum wordt verbeterd voor een betere zichtbaarheid en toegankelijkheid.
7. Plaats een rechthoekige slagadertang (6 inch) op de linkerlong van de ontvanger en trek de long voorzichtig terug. Het maakt de blootstelling van het voorste hilum mogelijk, wat verdere chirurgische toegang en manipulatie vergemakkelijkt (Figuur 3C).
8. Ontleed de longslagader (PA) van de bronchiën met behulp van een gebogen dissectietang en zorg ervoor dat het vat niet scheurt. De optimale dissectielocatie is het middelste deel en een afstand van 2 mm is voldoende (Figuur 3D).
9. Ontleed PV van bronchiën op een vergelijkbare manier (Figuur 3E).
10. Om de luchtstroom en de bloedstroom van de linkerlong van de ontvanger te belemmeren, plaatst u een aneurysma-microclip (zie materiaaltabel) aan de basis van het hilum (Figuur 3F).
11. Maak een kleine V-vormige incisie bij de longslagader (PA) en longader (PV) van de ontvanger met behulp van een microschaar. Verwijd de bronchiale en vasculaire openingen voorzichtig met een rechte of gebogen tang om een geschikte opening te genereren voor het plaatsen van de donormanchetten.
12. Spoel voorzichtig met verdunde heparine (heparine: zoutoplossing = 1:9) om bloed te verwijderen.
13. Plaats 10-0 nylon om de PA en laat deze los (om de manchetten in een later stadium vast te zetten).
14. Snijd vervolgens de donorbronchiën door en boeien deze op dezelfde manier als de PA en PV. Gooi het rechter long-hartblok van de donor weg.
15. Houd de linkerlong van de ontvanger vast, plaats de donorlong op de intrektang en bedek deze met een klein vochtig gaasje.
    OPMERKING: De linkerlong van de ontvanger moet in positie worden gehouden om spanning uit te oefenen op de hilum van de ontvanger, waardoor het anastomoseproces wordt vergemakkelijkt.
16. Leg de gecuffde hilaire structuren aan de voorkant bloot en begin de anastomosen door de donor in de ontvangende longslagader (PA) te plaatsen terwijl u de manchet inferieur vasthoudt. Op dit punt zal de PA van de donor enige rek ervaren (Figuur 3G).
17. Zodra de donorlongslagader (PA) in de ontvangende PA is geplaatst, zet u de structuren vast door een microclip over de manchetverlenging te plaatsen. Bevestig vervolgens de eerder geplaatste 10-0 nylon hechtdraad rond de ontvangende longslagader (PA) en manchet met twee knopen (zie afbeelding 3H). Maak ten slotte de microclip los van de verlengmanchet.
18. Plaats de PV van de donor op dezelfde manier in de PV van de ontvanger (Figuur 3I).
19. Steek de donorbronchus in de ontvangende bronchus en zorg ervoor dat de donorbronchus enigszins wordt uitgerekt (Figuur 3J). Laat de microclip op het hilum los om de perfusie en ventilatie te herstellen (Figuur 3K).
20. Breng in de borstholte de donorlong in en snijd de linkerlong van de ontvanger weg door de resterende stukken van de longslagader (PA), longader (PV) en bronchiën anterieur door te snijden (Figuur 3L). Gooi de linkerlong van de ontvanger weg.
21. Sluit de borstkas met behulp van 6-0 PDS-hechtdraad (zie Tabel met materialen), waardoor één rib onder en één rib boven de thoracotomie-incisie wordt vastgezet. Vlak voordat u de kist sluit, geeft u het dier een grote ademteug om de resterende lucht uit de kist te verdrijven.
    OPMERKING: In tegenstelling tot het rattenmodel is het niet nodig om borstbuisjes in muizen in te brengen.
22. Hecht de huid en het onderliggende onderhuidse weefsel met behulp van een continue subcuticulaire 6-0 zijden hechtdraad (zie materiaaltabel).

4. Herstel van dieren

tijdstip: 12 uur

1. Laat het dier 's nachts herstellen met onbeperkte toegang tot voedsel en water op de IC voor kleine dieren (draagbare intensive care voor dieren, zie materiaaltabel).
2. Dien buprenorfine elke 12 uur subqutanaal (0,5-1 mg/kg) toe om postoperatieve pijn te minimaliseren.

Resultaten

Op basis van de ervaring met dit model in de afgelopen 10 jaar, hebben personen met elementaire microchirurgische vaardigheden doorgaans een leercurve van ongeveer 50 dieren nodig. Zodra de vaardigheid is bereikt, duren de donorprocedures doorgaans 15-30 minuten, terwijl de ontvangerprocedures ongeveer 60 minuten duren. Na de initiële leercurve is de perioperatieve mortaliteit meestal erg laag.

In Figuur 4A,B laat de longmorfologie zeven dagen na de implantatie van de linkerlongen van de Balb/cJ-donor in C57/B6J-ontvangers zien dat muizen die werden behandeld met co-stimulerende blokkade een bewaarde, normale morfologie vertoonden. Daarentegen vertoonden muizen zonder immunosuppressie tekenen van afstoting.

In Figuur 4C,D vertoonde de H&E-kleuring van met co-stimulerende blokkade behandelde muizen minimale immunoreactiviteit, wat wijst op immuuntolerantie. Daarentegen vertoonden muizen zonder immunosuppressie prominente lymfatische infiltratie, wat wijst op een afstotingsreactie.

Figuur 1: Creatie van manchetten. Met behulp van mes #11, (A) zijn vasculaire en bronchiale manchetten gemaakt met een verlengde manchet om de plaatsing te vergemakkelijken. (B) 18 G/20 G/24 G-katheters werden gebruikt voor broncho's/longader/longslagader (van links naar rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Donoroperatie. De donorprocedure verloopt met heparine-injectie via de penisader (A), intubatie (B), dissectie van het middenrif (C) en een sternotomie op de middellijn (D). Het uitgesneden longblok (E) werd vochtig gehouden met guaze pads bedekt (F). Het hilum wordt ontleed, te beginnen met de donorplumonaire slagader (G), longader (H). Het bloedvat werd door het lumen van de manchet gegrepen en vervolgens over de manchet gevouwen, waardoor het endotheel-/epitheeloppervlak (I) bloot kwam te liggen. Vervolgens werd het vastgemaakt met 10-0 nylon hechtdraad rond de manchet (2 knopen) (J). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bewerking van de ontvanger. De ontvangende procedure gaat verder met endotracheale intubatie, rechter laterale decubituspositie (A) en een linker thoracotomie (B). De linkerlong van de ontvanger wordt losgemaakt van de aanhechtingen in het vooraanzicht (C) en de longslagader (D), longader (E) en bronchiën worden ontleed. Proximale controle van het recipiente hilum wordt verkregen met een aneurysmaclip (F). De gecuffde donorlongslagader wordt via een V-vormige 1/3 arteriotomie (G) in de longslagader van de ontvangende donor ingebracht en het handvat van de manchet wordt bediend door een tweede aneurysmacclip om de manchet stabiel te houden en vervolgens vastgezet met een 10-0 nylon stropdas (2 knopen) (H). De^2e clip werd verwijderd en dezelfde procedure werd gevolgd voor de longader (I) en bronchiën (J). De 1e^{clip werd} verwijderd om de longreperfuse (K) te laten. de long wordt opgeblazen en vervolgens weer in de borstkas geplaatst (L). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Morfologie en histologie van de getransplanteerde long. Zeven dagen na implantatie van de linkerlongen van de Balb/cJ-donor in C57/B6J-ontvangers, vertoonden muizen die werden behandeld met co-stimulerende blokkade een bewaarde, normale morfologie (A). Daarentegen vertoonden muizen die niet met immunosuppressie werden behandeld tekenen van afstoting (B). H&E-kleuring van de met co-stimulerende blokkade behandelde muizen toonde minimale immunoreactiviteit, wat wijst op immuuntolerantie (C). Met niet-immunosuppressie behandelde muizen vertoonden prominente lymfatische infiltratie, wat wijst op een afstotingsreactie (D). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De manchettechniek voor muizen linkerlongtransplantatie vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in transplantatieonderzoek^10,11. Kritieke stappen zijn onder meer nauwkeurige en nauwgezette dissectie van de hilaire structuur en veilige anastomosen. Aanpassingen kunnen worden aangebracht om aan experimentele behoeften te voldoen, maar er is een leercurve bij betrokken. Onze groep heeft de positie van de muis van de ontvanger aangepast van achterwaarts naar vooraan, waardoor een beter zicht op de heuvel wordt verkregen door de muis van de ontvanger te buigen, wat de leercurve verkort.

Beperkingen zijn onder meer uitdagingen met muizen buiten het gespecificeerde gewichtsbereik en de behoefte aan bekwame chirurgen met eerdere ervaring in microchirurgie. Om het risico op transplantatelectase te verkleinen, wordt sterk aangeraden om na implantatie positieve eind-expiratoire druk (PEEP) toe te passen en te zorgen voor de juiste toediening van pijnstillers. Om veneuze scheuren te voorkomen, wordt aanbevolen een kleinere manchetmaat (22 G) te gebruiken. Om arteriële torsie te voorkomen, wordt bovendien voorgesteld om de beweging van het transplantaat na de voorbereiding tot een minimum te beperken en uiterst voorzichtig te zijn bij het aanpassen van de oriëntatie van de long van de donor tijdens de anastomoseprocedure.

Ondanks beperkingen overtreft de gevasculariseerde benadering van de methode niet-gevasculariseerde modellen en biedt het een betere fysiologische relevantie. Het overwint ook tekortkomingen van heterotope tracheale modellen⁷, waardoor het een ideaal model is voor de studie van transplantatieimmunobiologie en ziekteprocessen. De transformatieve functie van het model maakt de geleidelijke vervanging van donorhematopoëtische cellen door gastheercellen mogelijk, waardoor onderzoek naar ziekte en maligniteit wordt vergemakkelijkt¹². Bovendien biedt het inzicht in de bijdragen van pulmonale stromale cellen, essentieel voor het begrijpen van longpathofysiologie en gerichte therapieën.

Over het algemeen is de manchettechniek veelbelovend voor het bevorderen van onderzoek in transplantatiebiologie, longziekten en immunologie, met mogelijke toepassingen op diverse gebieden. Onderzoekers moeten rekening houden met de leercurve en het aanpassingsvermogen aan specifieke onderzoeksbehoeften. We streven ernaar de efficiëntie en het succes van de procedure te verbeteren door praktische aanpassingen aan te brengen, zoals het herpositioneren van het dier na thoracotomie voor een beter chirurgisch zicht. Hoewel de kerntechniek hetzelfde blijft, kunnen deze verbeteringen het proces aanzienlijk vergemakkelijken, vooral voor tijdige longanastomose in experimentele omgevingen. Dit artikel geeft waardevolle tips voor betere techniekprestaties in het veld.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10-0 Nylon suture	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 braided silk suture	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Polydioxanone PDS II suture and	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Ethanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Adson forceps	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Balb/c mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8–12 weeks; Male
Bipolar coagulator	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8–12 weeks; Male
Clear chlorhexidine	Hibiclens, Mölnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocautery	Bovie
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Mouse Ventilator VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	settings 3L O2/minute, respiratory rate 130 bpm, 0.4 cc tidal volume
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/mL
Injection grade normal saline	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamine	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pediatric Forceps Right-Angled Jaws	Medline, Northfield, IL,	MDS1247714	Extra Fine, Overall Length 5 1/2" (14cm)
Medline High Temperature Cautery,W/ Fine Tip	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscope Leica M80 F12 Floor Stand	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Moria extra fine spring scissors	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Isoflurane Vaporizer	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex low-potassium dextran glucose solution	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Electrolyte preservation solution
polystyrene petridishes	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 and 00649-11	150 × 25 mm and 60 × 25 mm
S&T SuperGrip Forceps straight and angled tip	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Small animal retraction system	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	tapered mini cotton tipped 3 inch applicators
sterile Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2419Z
Surflo etfe IV Catheter, Yellow, 24 G x 0.75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Surflo etfe IV Catheter; Green, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Surflo etfe IV Catheter; Pink, 20 G x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
ThermoCare Small Animal ICU System,	A to Z Vet Supply, Dresden, TN	008679	10 mg/kg
Xylazine	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Temporary Aneurysm Clips	Medline, Northfield, IL,	ESCT001