Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de productie van siderofoor van Pseudomonas aeruginosa

Milan Rathod; Hiral Patel; Devarshi Gajjar

doi:10.3791/65980

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de productie van siderofoor van Pseudomonas aeruginosa

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 maart 2024

Milan Rathod¹ , Hiral Patel¹ , Devarshi Gajjar¹

¹Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van totale sideroforen, pyoverdine en pyochelin van Pseudomonas aeruginosa.

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) staat bekend om zijn productie van een breed scala aan virulentiefactoren om infecties in de gastheer tot stand te brengen. Een voorbeeld van zo'n mechanisme is het opruimen van ijzer door middel van de productie van sideroforen. P. aeruginosa produceert twee verschillende sideroforen: pyocheline, dat een lagere ijzerchelerende affiniteit heeft, en pyoverdine, dat een hogere ijzerchelaatvorming heeft. Dit rapport toont aan dat pyoverdine direct kan worden gekwantificeerd uit bacteriële supernatanten, terwijl pyochelin moet worden geëxtraheerd uit supernatanten voordat het kan worden gekwantificeerd.

De primaire methode voor het kwalitatief analyseren van de productie van siderofoor is de Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarplaattest. In deze test leidt het vrijkomen van CAS-kleurstof uit het Fe³⁺-Dye-complex tot een kleurverandering van blauw naar oranje, wat wijst op de productie van sideroforen. Voor de kwantificering van de totale sideroforen werden bacteriële supernatanten in gelijke verhoudingen gemengd met CAS-kleurstof in een microtiterplaat, gevolgd door spectrofotometrische analyse bij 630 nm. Pyoverdine werd direct gekwantificeerd uit het bacteriële supernatans door het in gelijke verhoudingen te mengen met 50 mM Tris-HCl, gevolgd door spectrofotometrische analyse. Een piek bij 380 nm bevestigde de aanwezigheid van pyoverdine. Wat Pyochelin betreft, was directe kwantificering van het bacteriële supernatans niet mogelijk, dus moest het eerst worden geëxtraheerd. Daaropvolgende spectrofotometrische analyse onthulde de aanwezigheid van pyocheline, met een piek bij 313 nm.

Inleiding

Organismen hebben ijzer nodig om verschillende vitale functies uit te voeren, zoals elektronentransport en DNA-replicatie1. Van Pseudomonas aeruginosa, een Gram-negatieve opportunistische ziekteverwekker, is bekend dat het een verscheidenheid aan virulentiefactoren bezit om infectie in de gastheer tot stand te brengen, waaronder siderofoor vorming². Tijdens ijzerafbrekende omstandigheden geeft P. aeruginosa gespecialiseerde moleculen af, sideroforen genaamd, die ijzer uit de omgeving blussen. Sideroforen cheleren ijzer extracellulair en het resulterende ijzer-siderofoor complex wordt actief terug naar d....