Dit protocol biedt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van totale sideroforen, pyoverdine en pyochelin van Pseudomonas aeruginosa.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de productie van siderofoor van Pseudomonas aeruginosa
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) staat bekend om zijn productie van een breed scala aan virulentiefactoren om infecties in de gastheer tot stand te brengen. Een voorbeeld van zo'n mechanisme is het opruimen van ijzer door middel van de productie van sideroforen. P. aeruginosa produceert twee verschillende sideroforen: pyocheline, dat een lagere ijzerchelerende affiniteit heeft, en pyoverdine, dat een hogere ijzerchelaatvorming heeft. Dit rapport toont aan dat pyoverdine direct kan worden gekwantificeerd uit bacteriële supernatanten, terwijl pyochelin moet worden geëxtraheerd uit supernatanten voordat het kan worden gekwantificeerd.
De primaire methode voor het kwalitatief analyseren van de productie van siderofoor is de Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarplaattest. In deze test leidt het vrijkomen van CAS-kleurstof uit het Fe3+-Dye-complex tot een kleurverandering van blauw naar oranje, wat wijst op de productie van sideroforen. Voor de kwantificering van de totale sideroforen werden bacteriële supernatanten in gelijke verhoudingen gemengd met CAS-kleurstof in een microtiterplaat, gevolgd door spectrofotometrische analyse bij 630 nm. Pyoverdine werd direct gekwantificeerd uit het bacteriële supernatans door het in gelijke verhoudingen te mengen met 50 mM Tris-HCl, gevolgd door spectrofotometrische analyse. Een piek bij 380 nm bevestigde de aanwezigheid van pyoverdine. Wat Pyochelin betreft, was directe kwantificering van het bacteriële supernatans niet mogelijk, dus moest het eerst worden geëxtraheerd. Daaropvolgende spectrofotometrische analyse onthulde de aanwezigheid van pyocheline, met een piek bij 313 nm.
Inleiding
Organismen hebben ijzer nodig om verschillende vitale functies uit te voeren, zoals elektronentransport en DNA-replicatie1. Van Pseudomonas aeruginosa, een Gram-negatieve opportunistische ziekteverwekker, is bekend dat het een verscheidenheid aan virulentiefactoren bezit om infectie in de gastheer tot stand te brengen, waaronder siderofoor vorming2. Tijdens ijzerafbrekende omstandigheden geeft P. aeruginosa gespecialiseerde moleculen af, sideroforen genaamd, die ijzer uit de omgeving blussen. Sideroforen cheleren ijzer extracellulair en het resulterende ijzer-siderofoor complex wordt actief terug naar de celgetransporteerd 3.
Van P. aeruginosa is bekend dat het twee sideroforen produceert, pyoverdine en pyocheline. Van pyoverdine is bekend dat het een hogere ijzerchelaatstoornis heeft (1:1), terwijl van pyocheline bekend is dat het een lagere ijzerchelaatlaateenheid heeft (2:1)4. Pyochelin wordt ook wel een secundaire siderofoor genoemd omdat het een lagere ijzerchelaatiniteit heeft5. De productie en regulatie van sideroforen worden actief gecontroleerd door Quorum Sensing (QS)-systemen in P. aeruginosa6.
Naast het blussen van ijzer zijn sideroforen ook betrokken bij het reguleren van virulentiefactoren en spelen ze een actieve rol bij de vorming vanbiofilms7. Sideroforen vervullen aanvullende cruciale rollen, waaronder betrokkenheid bij celsignalering, verdediging tegen oxidatieve stress en het vergemakkelijken van interacties tussen microbiële gemeenschappen8. Sideroforen worden meestal gecategoriseerd op basis van de specifieke functionele groepen waardoor ze ijzer cheleren. De drie primaire bidentaatliganden in deze classificatie zijn catecholaat, hydroxamaat en α-hydroxycarboxylaat3. Pyoverdines zijn kenmerken van fluorescerende Pseudomonas-soorten zoals P. aeruginosa en P. fluorescens5. Ze bestaan uit een gemengde groene fluorescerende chromofoor gekoppeld aan een oligopeptide dat 6-12 aminozuren bevat. Verschillende niet-ribosomale peptidesynthetasen (NRP's) zijn betrokken bij hun synthese9. Vier genen die betrokken zijn bij de productie en regulatie van pyoverdine zijn pvdL, pvdI, pvdJ en pvdD10. Pyoverdine is ook verantwoordelijk voor infectie en virulentie bij zoogdieren11. Van P. aeruginosa is bekend dat het pyocheline produceert in matige ijzerbeperkende omstandigheden, terwijl pyoverdine wordt geproduceerd tijdens ernstige ijzerbeperkende omgevingen12. Twee operons die betrokken zijn bij de productie van pyochelin zijn pchDCBA en pchEFGHI13. Opgemerkt wordt dat pyocheline (catecholaat) in aanwezigheid van pyocyanine oxidatieve schade en ontsteking veroorzaakt en hydroxylradicalen genereert, die schadelijk zijn voor gastheerweefsels11.
De chroom-azurolsulfonaat-test (CAS) wordt algemeen gebruikt vanwege de volledigheid, hoge gevoeligheid en het grotere gemak in vergelijking met microbiologische tests, die, hoewel gevoelig, te specifiek kunnen zijn14. De CAS-test kan worden uitgevoerd op agaroppervlakken of in een oplossing. Het is afhankelijk van de kleurverandering die optreedt wanneer het ijzerion overgaat van zijn intens blauwe complex naar oranje. De CAS-colorimetrische test kwantificeert de uitputting van ijzer uit een Fe-CAS-surfactant ternair complex. Dit specifieke complex, bestaande uit metaal, organische kleurstof en oppervlakteactieve stof, heeft een blauwe kleur en vertoont een absorptiepiek bij 630 nm.
Dit rapport presenteert een methode voor de kwalitatieve detectie van de productie van sideroforen, waarbij men de productie van sideroforen op een agarplaat kan detecteren. Er wordt ook een methode gegeven voor de kwantitatieve schatting van de totale productie van sideroforen in een microtiterplaat en de detectie en kwantitatieve analyse van twee sideroforen, pyoverdine en pyocheline, van P. aeruginosa.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle bacteriële isolaten van P. aeruginosa zijn afkomstig van medische microbiologische laboratoria in Vadodara en Jaipur, India. Alle geselecteerde klinische isolaten werden behandeld in het Biosafety Cabinet (BSL2) en er werd de grootst mogelijke zorg besteed aan het hanteren van bacteriële isolaten tijdens de experimenten. De commerciële details van alle reagentia/oplossingen zijn te vinden in de materiaaltabel.
1. Bereiding van chroom-azurolsulfonaat (CAS)-kleurstof en agarmedia
- Bereid CAS-kleurstof (100 ml) met de volgende samenstelling:
- Los 60 mg CAS op in 50 ml gedestilleerd water (oplossing 1).
- Los 2,7 mg FeCl3·6H2O op in 10 ml 10 mM HCl (oplossing 2).
- Los 73 mg cetrimoniumbromide (HDTMA) op in 40 ml gedestilleerd water (oplossing 3).
- Meng Oplossing 1, Oplossing 2 en Oplossing 3 zorgvuldig. Bewaar het in een glazen fles.
- Bereid CAS-agar volgens de onderstaande stappen:
- Voeg 100 ml MM9-zoutoplossing toe aan 750 ml gedestilleerd water.
- Los 32,24 g piperazine-N,N'-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES) vrij zuur op.
- Voeg 15 g Agar-agar toe. Autoclaaf en laat afkoelen.
- Voeg 30 ml steriele Casaminozuuroplossing en 10 ml steriele 20% glucoseoplossing toe aan het mengsel.
- Voeg 100 ml CAS-kleurstof toe, meng en giet het in aseptische omstandigheden.
OPMERKING: Bereiding van MM9-media, Casaminozuuroplossing en 8-Hydroxyquinoline zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. PIPES-buffer is pH-gevoelig. Het lost pas op als de pH 5,6 is bereikt. Zorg ervoor dat de pH constant wordt gecontroleerd, want wanneer PIPES begint op te lossen in water, zal dit de pH verder verlagen. Extract Casaminozuur met hetzelfde volume van 3% 8-hydroxyquinoline opgelost in chloroform. Laat de niet-mengbare oplossing ongeveer 20 minuten op 4 °C staan en vang voorzichtig de bovenste fase van de oplossing op zonder de onderste fase te verstoren.
2. Kwalitatieve analyse van de productie van sideroforen
- Stel de OD600 nm in op 0,2 voor 24 uur gekweekte culturen van P. aeruginosa.
- Gebruik een steriele draadlus om de bacteriecultuur op een CAS-agarplaat te strepen.
- Incubeer bij 30 °C gedurende 24 uur.
OPMERKING: Peptonwatermedia of 0,8% normale zoutoplossing kunnen worden gebruikt om de bacteriecultuur te verdunnen. Als er na 24 uur geen bacteriegroei wordt waargenomen, incubeer dan CAS-platen gedurende 48 tot 72 uur.
3. Kwantitatieve schatting van het totale aantal sideroforen
- Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in Peptone-watermedia na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 nm en incubeer gedurende 48 uur bij 30 °C.
- Centrifugeer na 48 uur de bacteriecultuur bij 4650 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg na het centrifugeren 100 μL celvrij supernatans toe aan een microtiterplaat met 96 putjes en voeg er 100 μL CAS-kleurstof aan toe.
- Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voer na incubatie spectrofotometrische metingen uit bij 630 nm.
- Bereken de resultaten die zijn verkregen voor de kwantificering van de totale sideroforen als Percent Siderophore Unit (PSU).
OPMERKING: PSU kan worden berekend als: [(Ar - As)/Ar] x 100
waarbij: Ar = extinctie van de referentie bij 630 nm, As = extinctie van het celvrije supernatans van het monster. Ter referentie moet CAS-kleurstof worden toegevoegd aan niet-geïnoculeerde peptonwatermedia. Vul al het glaswerk, zoals reageerbuisjes, kolven, enz., gedurende 2 uur met 6 M HCl en spoel het tweemaal af met gedestilleerd water om eventuele sporen van ijzer te verwijderen.
4. Kwantitatieve schatting van pyoverdine
- Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in Peptone-watermedia na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 en incubeer gedurende 48 uur bij 30 °C.
- Meet na 48 uur de OD600 nm van de bacteriegroei voordat u verder gaat.
- Centrifugeer de bacteriecultuur bij 4650 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg na het centrifugeren 100 μL celvrij supernatans toe aan een microtiterplaat met 96 putjes en voeg er 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) aan toe.
- Voer spectrofotometrische metingen uit bij OD405 nm.
5. Pyochelin-extractie en spectrofotometrie
- Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in King's B-media (aanvullend bestand 1) na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 en incubeer gedurende 24 uur bij 30 °C.
- Neem na 24 uur 100 ml cultuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 4650 x g .
- Voeg na het centrifugeren 5 ml citroenzuur van 1 M toe aan het supernatant. Extraheer tweemaal met 50 ml ethylacetaat.
- Filtreer de organische fase met magnesiumsulfaat door een spuitfilter. Bewaar de gefilterde organische fase bij -20 °C.
- Voer spectrofotometrische metingen uit bij 320 nm.
OPMERKING: Aangezien pyochelin bij kamertemperatuur een zeer onstabiele verbinding is, voert u het extractieproces uit op ijs. Gebruik een steriele spuit van 50 ml voor het scheiden van het filter. Leg het wattenstaafje aan de punt van de spuit en voeg er 1 g magnesiumsulfaat aan toe. Bevestig een steriel spuitfilter aan de punt van de spuit en vang het filtraat op in een steriele buis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vóór de kwantificering van sideroforen uit klinische isolaten werd een kwalitatieve screening van de productie van sideroforen uitgevoerd om de productie van sideroforen te garanderen. Kwalitatieve detectie van sideroforen uit klinische isolaten werd waargenomen door strepen van bacteriën op CAS-agarplaten. Drie klinische isolaten, namelijk MR1, TL7, J3, samen met PAO1 (de referentiestam), werden geselecteerd voor de studie. Alle drie de klinische isolaten en PAO1 lieten positieve resulta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de totale sideroforen en twee verschillende sideroforen van P. aeruginosa, namelijk pyoverdine en pyochelin, te kwantificeren uit het bacteriële celvrije supernatant. In de CAS-agarplatentest vormen CAS-kleurstof en Fe3+-ionen een complex. Wanneer bacteriën sideroforen produceren, doven ze Fe3+-ionen van het CAS-Fe3+-complex, wat leidt tot een kleurverandering rond de bacteriegroei. Deze verandering resulteert in een duidelijke oranje h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Auteurs erkennen financiering van DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program en FIST. MR bedankt fellowship ontvangen van SHODH. HP bedankt fellowship ontvangen van CSIR.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referenties
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
