Engineering Tendon Assembloids om cellulaire overspraak bij ziekte en reparatie te onderzoeken

Samenvatting

Hier presenteren we een assembloid-modelsysteem om peescellulaire overspraak na te bootsen tussen het dragende peeskernweefsel en een extrinsiek compartiment met celpopulaties die worden geactiveerd door ziekte en letsel. Als belangrijke use case laten we zien hoe het systeem kan worden ingezet om ziekterelevante activering van extrinsieke endotheelcellen te onderzoeken.

Samenvatting

Pezen maken voortbeweging mogelijk door spierkrachten over te brengen op botten. Ze vertrouwen op een taaie peeskern die bestaat uit collageenvezels en stromale celpopulaties. Deze dragende kern wordt omsloten, gevoed en gerepareerd door een synoviaalachtige weefsellaag die het extrinsieke peescompartiment vormt. Ondanks dit geavanceerde ontwerp komen peesblessures vaak voor en is de klinische behandeling nog steeds afhankelijk van fysiotherapie en chirurgie. De beperkingen van beschikbare experimentele modelsystemen hebben de ontwikkeling van nieuwe ziektemodificerende behandelingen en terugval-preventieve klinische regimes vertraagd.

In vivo studies bij mensen zijn beperkt tot het vergelijken van gezonde pezen met zieke of gescheurde weefsels in het eindstadium die tijdens een hersteloperatie zijn bemonsterd en laten geen longitudinale studie van de onderliggende peesziekte toe. In vivo diermodellen bieden ook belangrijke beperkingen met betrekking tot ondoorzichtige fysiologische complexiteit, de ethische belasting voor de dieren en de hoge economische kosten die gepaard gaan met het gebruik ervan. Verder zijn in vivo diermodellen slecht geschikt voor het systematisch sonderen van geneesmiddelen en meercellige, multi-weefsel interactieroutes. Eenvoudigere in-vitromodelsystemen zijn ook tekortgeschoten. Een belangrijke reden is het niet adequaat repliceren van de driedimensionale mechanische belasting die nodig is om peescellen en hun functie zinvol te bestuderen.

Het nieuwe 3D-modelsysteem dat hier wordt gepresenteerd, verlicht een aantal van deze problemen door gebruik te maken van explantaties van de staartpeeskern van muizen. Belangrijk is dat deze explantaten gemakkelijk in grote aantallen toegankelijk zijn vanaf een enkele muis, 3D in situ laadpatronen op cellulair niveau behouden en een in vivo-achtige extracellulaire matrix hebben. In dit protocol worden stapsgewijze instructies gegeven over hoe explantaten van peeskernen kunnen worden uitgebreid met collageenhydrogels beladen met van spieren afgeleide endotheelcellen, van pezen afgeleide fibroblasten en van beenmerg afgeleide macrofagen om ziekte- en letselgeactiveerde celpopulaties in het extrinsieke peescompartiment te vervangen. Er wordt gedemonstreerd hoe de resulterende peesassemblages mechanisch of door middel van gedefinieerde micro-omgevingsstimuli kunnen worden uitgedaagd om opkomende meercellige overspraak tijdens ziekte en letsel te onderzoeken.

Inleiding

In hun functie van het overbrengen van spierkrachten naar de botten om beweging mogelijk te maken, worden pezen geconfronteerd met enkele van de meest extreme mechanische spanningen die in het menselijk lichaam voorkomen ^1,2,3. Als gevolg van vergrijzende samenlevingen, toenemende prevalentie van obesitas en de groeiende populariteit van mechanisch veeleisende sportactiviteiten, zal de prevalentie van peesaandoeningen en blessures naar verwachting stijgen in ontwikkelde landen ^4,5,6. De ontwikkeling van nieuwe evidence-based en ziektemodificerende behandelingsregimes om deze toename tegen te gaan, wordt belemmerd door beperkingen van de momenteel beschikbare modelsystemen ^1,7,8.

Idealiter zouden modellen voor het herstel van ziekten en verwondingen het mogelijk maken om te bestuderen hoe het doelorgaan een gedefinieerde set inputparameters (het imiteren van ziektetriggers, tabel 1) verwerkt tot meetbare outputparameters (die ziektekenmerken vertegenwoordigen, tabel 2) terwijl wordt gecontroleerd op verstorende factoren. Studies met behulp van dergelijke modelsystemen zouden dan in staat zijn om de (patho-)fysiologische processen die ten grondslag liggen aan het herstel van ziekten en letsels te identificeren en kennis te verwerven die kan worden benut om ziekte- en letselkenmerken in de klinieken te voorkomen of te verminderen. Door dit principe toe te passen op pezen, zou een bruikbaar modelsysteem centrale delen van de in vivo peesrespons op ziekte en letsel moeten recapituleren, die de volgende kenmerken omvatten: microschade, ontsteking, neovascularisatie, hypercellulariteit, versnelde matrixomzet en decompartimentering 9,10,11,12,13,14,15 . Aan de hand van deze kenmerken als basis kunnen de volgende vereisten voor een succesvol modelsysteem voor peesaandoeningen en blessureherstel worden afgeleid.

Mechanische overbelasting wordt verondersteld een centrale factor te zijn in peesletsel en ziektepathogenese en is dus een veelgebruikte experimentele benadering om microschade te veroorzaken¹⁶. Controleerbare mechanische belastbaarheid is daarom een belangrijke voorwaarde voor modellen voor het herstel van peesaandoeningen en blessures. Idealiter maakt het modelsysteem drie hoofdmodi mogelijk: enkelvoudig rekken tot beschadigen laden, vermoeidheidsbelasting en lossen ^8,17,18. Bij mechanische vervorming ervaren weefsel-residente cellen een complexe combinatie van trekkrachten, schuifkrachten (als gevolg van het glijden van collageenvezels rond de cellen) en compressiekrachten die optreden tijdens het ontladen of in de buurt van de enthesis^19,20. Modelsystemen moeten deze complexe belastingspatronen zo goed mogelijk nabootsen.

Een alternatieve manier om matrixmicroschade te introduceren is door gebruik te maken van biochemische stressoren die systemische aanleg voor peesaandoeningen en -letsel nabootsen, zoals (pro-)inflammatoire cytokines, oxidatieve stress of hoge glucoseconcentraties21,22,23. Bijgevolg is een controleerbare niche-micro-omgeving voordelig voor een modelsysteem voor het herstel van peesaandoeningen en blessures.

Een algemene voorwaarde voor modelsystemen om ontsteking, neovascularisatie en hypercellulariteit te kunnen recapituleren, is de selectieve aanwezigheid van celpopulaties die deze processen aansturen^. Voor ontstekingsprocessen omvatten deze populaties neutrofielen, T-cellen en macrofagen, terwijl endotheelcellen en pericyten nodig zouden zijn om neovascularisatie te bestuderen 25,26,27,28,29. Peesfibroblasten zijn niet alleen van vitaal belang voor peesherstel, maar zijn, als proliferatieve en migrerende cellen, ook gedeeltelijk verantwoordelijk voor de lokale hypercellulariteit die wordt waargenomen bij peesziekte 30,31,32,33,34,35,36.

Naast veranderingen in residente celpopulaties, is de samenstelling van de peesmatrix ook veranderd bij peesaandoeningen en -letsels 7,37,38,39,40. Om de juiste ziekterelevante micro-omgevingssignalen te presenteren, moeten modelsystemen in staat zijn om een extracellulaire matrixsamenstelling te integreren die is afgestemd op het beoogde ziekte- of letselstadium, bijvoorbeeld door relevante proportionele combinaties van collageen-1, collageen-3 en cellulair fibronectine⁴¹ mogelijk te maken.

De compartimentering van gezonde pezen in de peeskern en de extrinsieke compartimenten (d.w.z. endotenon, epitenon en paratenon) staat centraal in hun functie en is vaak verstoord bij zieke of gewonde pezen 1,42,43,44,45,46,47 . Het integreren van 3D-peescompartimentering in peesmodelsystemen is daarom niet alleen nodig om de processen die ten grondslag liggen aan de- en recompartimentering nauwkeuriger te simuleren, maar helpt ook om de juiste spatiotemporele gradiënten van cytokines en voedingsstoffen vast te stellen^48,49.

Ten slotte is modulariteit een andere centrale troef van modelsystemen, die onderzoekers in staat stelt om de juiste relatieve bijdrage van en wisselwerking tussen de eerder beschreven stressoren tijdens de onderzochte processen te combineren ^8,17.

Naast het selecteren van de optimale invoermodaliteiten, is een belangrijke stap het kunnen meten, observeren en volgen van veranderingen in de resulterende output. De mechanische eigenschappen van het modelsysteem (d.w.z. teenlengte, lineaire elastische modulus, maximale trekspanning, maximale trekspanning, vermoeiingssterkte en spanningsontspanning) staan hier centraal, omdat ze de hoofdfunctie van de pees karakteriseren 50,51,52. Om deze functionele veranderingen te koppelen aan veranderingen op weefselniveau, is het belangrijk om methoden mogelijk te maken voor het detecteren van (collageen) structurele matrixschade en het volgen van proliferatie en rekrutering van ziekte- en herstelrelevante celpopulaties 30,53,54,55,56,57,58,59,60.

Om opkomende cel-cel en cel-matrix overspraak te bestuderen, moet men in staat zijn om eiwitten in voldoende hoeveelheden te isoleren of te markeren voor kwantificering (d.w.z. ELISA, proteomics, immunohistochemie, flowcytometrie)14,21,61,62. Populatie- of op zijn minst compartimentspecifieke genexpressie-analyse zou ook mogelijk moeten zijn (d.w.z. fluorescentie-geactiveerde celsortering [FACS], single-cell/bulk RNA-sequencing en real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR))21,24,27,63. Het modelsysteem moet het mogelijk maken om zoveel mogelijk van de bovengenoemde outputparameters op hetzelfde monster en op meerdere monsters te meten op een manier die snel genoeg is om studies met een hoge doorvoer te ontsluiten.

Van de modelsystemen die momenteel beschikbaar zijn om menselijke peesaandoeningen en letselherstel te bestuderen, is het menselijk lichaam zelf natuurlijk het meest representatief. Het is ook het minst verenigbaar met experimentele interventie. Terwijl patiënten met acute peesblessures overvloedig beschikbaar zijn voor klinische onderzoeken, zijn patiënten met vroege tendinopathie (de meest voorkomende peesziekte) grotendeels symptoomvrij en blijven ze vaak klinisch onopgemerkt totdat ernstigere veranderingen zich manifesteren 14,64,65. Dit maakt het moeilijk om het kritieke moment vast te stellen waarop de homeostase van de pees ontspoort en de mechanismen achter deze ontsporing 16,66,67,68,69. Bovendien is het extraheren van biopsieën uit gezonde pezen ethisch uitdagend, omdat dit kan leiden tot aanhoudende schade. Hamstringpeesresten van voorste kruisbandreconstructiechirurgie worden vaak gebruikt als gezonde controles, maar verschillen aantoonbaar in functie, mechanische eigenschappen, celpopulaties en matrixsamenstelling in vergelijking met de rotator cuff, achillespees en patellapezen die vaak worden aangetast door peesaandoeningen en -letsel 70,71,72,73.

In vivo diermodellen zijn toegankelijker en handelbaarder, maar het gebruik ervan legt een aanzienlijke ethische last op voor de dieren en economische kosten voor de onderzoekers. Bovendien ontwikkelen de meeste populaire modeldieren niet spontaan tendinopathische laesies (d.w.z. ratten, muizen, konijnen) of missen ze de primers en genetisch gemodificeerde stammen die nodig zijn om de meercellige communicatieroutes te volgen die erbij betrokken zijn (d.w.z. paarden, konijnen).

Eenvoudige 2D in vitro modelsystemen bevinden zich aan de andere kant van het spectrum van complexiteit/traceerbaarheid en maken een gecontroleerde, tijdbesparende studie van specifieke intercellulaire communicatieroutes beter mogelijk als reactie op een beter controleerbare reeks triggers ^8,74. Deze vereenvoudigde systemen slagen er echter vaak niet in om de multidimensionale mechanische belasting (d.w.z. spanning, compressie en afschuiving) te recapituleren die centraal staat in de peesfunctionaliteit. Bovendien hebben de (te) hoge stijfheid van weefselkweekplastic de neiging om alle matrixsignalen te negeren die worden geleverd door coatings die bedoeld zijn om de ziektetoestand van belang na te bootsen^75,76.

Om dit nadeel te ondervangen, zijn steeds geavanceerdere weefsel-gemanipuleerde 3D-modelsystemen ontwikkeld om een belastbare matrix te bieden waarvan de samenstelling op zijn minst gedeeltelijk kan worden afgestemd op de gewenste ziektetoestand 77,78,79. Toch hebben deze systemen niet alleen moeite om de complexe in vivo extracellulaire matrixsamenstellingen en cellulaire belastingspatronen nauwkeurig te repliceren, maar missen ze over het algemeen de belastbaarheid op lange termijn en de compartimentele interfaces die nodig zijn om de cross-compartimentele communicatieroutes te bestuderen die peesaandoeningen en blessureherstel coördineren 48,49,80.

Ex vivo pees-explantatiemodelsystemen hebben het duidelijke voordeel van een ingebouwde in vivo-achtige matrixsamenstelling die pericellulaire niches, cross-compartimentele barrières en spatiotemporele cytokine/nutriëntengradiënten omvat en complexe belastingspatronen recapituleert wanneer ze worden uitgerekt⁸. Als gevolg van grootte-afhankelijke diffusielimieten voor voedingsstoffen zijn explantaten uit grotere diermodellen (d.w.z. paarden) moeilijk in leven te houden voor de langetermijnstudie van peesaandoeningen en blessureherstel 81,82,83. Ondertussen zijn kleinere explantaten van muizensoorten (d.w.z. achillespees, patellapees) een uitdaging om reproduceerbaar af te klemmen en mechanisch te belasten. Hun grootte beperkt ook de hoeveelheid materiaal die kan worden verzameld voor uitlezingen op cel-, eiwit- en genniveau zonder monsters te bundelen en de doorvoer te verminderen. In die zin bieden muizenstaartpeesfascikels het potentieel om high-throughput studie van peesaandoeningen en letselherstel te ontsluiten, aangezien ze in grote hoeveelheden direct beschikbaar zijn bij een enkele muis, de complexe in vivo pericellulaire matrixsamenstelling behouden en cellulaire belastingspatronen recapituleren. Tijdens het extractieproces verliezen ze echter het grootste deel van hun extrinsieke compartiment en de daarin aanwezige vasculaire, immuun- en fibroblastpopulaties waarvan nu wordt aangenomen dat ze peesaandoeningen veroorzaken en herstellen ^8,18.

Om deze kloof te overbruggen, is een modelsysteem ontwikkeld dat de voordelen van explantaten van de staartpees van muizen combineert met de voordelen van modelsystemen op basis van 3D-hydrogel. Dit modelsysteem bestaat uit een met cellen beladen (collageen-1) hydrogel die rond de staartpees wordt gegoten^84,85. In dit artikel worden de noodzakelijke productiestappen in detail gegeven, naast nuttige uitlezingen die kunnen worden verkregen door kernexplantaten (intrinsiek compartiment) samen te kweken in een met endotheelcellen beladen type-1 collageenhydrogel (extrinsiek compartiment).

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten (Kanton Zürich licentienummers ZH104-18 en ZH058-21). Een overzicht is weergegeven in figuur 1.

1. Isolatie van peesassemblagecomponenten van muizen van 12-15 weken oud (d.w.z. B6/J-Rj)

1. Euthanaseer de muizen door middel van CO₂ -gasgeïnduceerde verstikking. Om de opbrengst te maximaliseren, mag u niet meer dan 3 muizen tegelijk verwerken en onmiddellijk na de euthanasie doorgaan met de celisolatie.
2. Zorg voor overlijden door bilaterale inductie van pneumothorax.
3. Steriliseer de muizenhuid met 80% ethanol en verplaats de muis naar een steriele bioveiligheidskap.
4. Isoleer de explantatie van de staartpeeskern.
   1. Gebruik een scalpel (nr. 21) om de staart van de muis te scheiden door deze aan de basis af te snijden.
   2. Begin bij het puntje van de staart, pak het vast met het pincet en beweeg het om de huid te breken. Trek vervolgens het pincet voorzichtig weg van de staart om de peeskernexplantaties bloot te leggen.
   3. Plaats de peeskernexplantaten in het standaard kweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 1% niet-essentiële aminozuren) en scheid ze van het weggetrokken staartgedeelte met een vers scalpelmesje (nr. 21).
   4. Herhaal stap 1.4.2. en 1.4.3. totdat de hele staart is bewerkt en de peesexplantaties korter worden dan 25 mm.
   5. Snijd de geïsoleerde kernexplantaties in stukken van 25 mm lang met een vers scalpelmesje (nr. 21).
   6. Meet de gemiddelde diameter van de kernexplantaten met een lichtmicroscoop die is aangesloten op beeldanalysesoftware via een bevestigbare digitale camera met C-bevestiging.
      1. Gebruik aanwijzen en klikken om het lijnmeetgereedschap aan de rechterkant te selecteren.
      2. Meet de explantatiediameter op drie verschillende locaties en bereken hun gemiddelde diameter.
      3. Om het opspannen en mechanisch testen later te vergemakkelijken, mag u alleen te werk gaan met kernexplantaties met een gemiddelde diameter van meer dan 100 μm.
   7. De ontlading in combinatie met de blootstelling aan standaard kweekomstandigheden (37 °C, 20% O₂, serumsuppletie) verandert de genexpressie binnen 6 uur na isolatie en resulteert in afbraak binnen 7 dagen²¹. Om te beginnen met een quasi-homeostatische toestand, produceert u de peesassemblages en start u de experimenten onmiddellijk na de isolatie van de peeskern.
   8. Afhankelijk van de experimentele opstelling zijn gedevitaliseerde peeskernexplantaten nodig als controlegroep. Om de explantatie van de peeskern te devitaliseren, vriest u ze 5 seconden in een kleine container gevuld met vloeibare stikstof in met een pincet en ontdooit u ze vervolgens 5 seconden bij kamertemperatuur (RT). Herhaal deze vries-dooicyclus 3 keer en ga verder met stap 4 ("Klemmen van de kernexplantatie").
      LET OP: Vloeibare stikstof kan koude brandwonden, verstikking veroorzaken en bros veel gewone materialen. Gebruik alleen containers die zijn ontworpen voor vloeistoffen met een lage temperatuur en draag beschermende kleding (d.w.z. gelaatsscherm, geschikte handschoenen, gesloten schoenen).
5. Isoleer peesfibroblasten.
   1. Gebruik een scalpel (nr. 21) om een transversale incisie te maken in het midden van de voet van de muis. Maak twee sneden loodrecht op de voet langs de zijkanten van de achterpoten en tot aan de heupen vanaf elk uiteinde van deze incisie.
   2. Gebruik het pincet om de uitgesneden huidflap aan de voet te fixeren en verwijder de huid die de kuitspieren bedekt. Wanneer u endotheelcellen van dezelfde muis isoleert, verwijdert u in plaats daarvan alle huid.
   3. Scheid de achillespees van het calcaneusbeen met een vers scalpelmesje (nr. 21). Fixeer het losse uiteinde van de achillespees met het pincet en scheid het andere uiteinde van de gastrocnemiusspier.
   4. Was de achillespees eenmaal in PBS en gebruik de scalpel (nr. 21) om al het resterende spierweefsel te verwijderen totdat alleen het witte peesweefsel overblijft. Als endotheelcellen uit dezelfde muis worden geïsoleerd, laat u de achillespees in PBS en gaat u verder met stap 1.6. eerste.
   5. Bundel de achillespezen van één dier in een plastic buis van 15 ml met 10 ml peesverteringsmedium (DMEM/F12 + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 2 mg/ml collagenase 1) en verteer gedurende 6-8 uur bij 37 °C onder langzame, constante beweging met behulp van een orbitale schudder met lage snelheid bij 15 rpm.
   6. Centrifugeer de verteerde peesoplossing bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT, zuig het supernatant op en resuspendeer in 8 ml standaardkweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 1% niet-essentiële aminozuren) en kweek gedurende 7 dagen in een T25-kweekkolf onder standaardkweekomstandigheden (37 °C, 20 % Ø₂) zonder mediawissel. Wissel daarna één keer per week van media.
   7. Splits de cellen bij 80% confluentie in een T150-kweekkolf (1:6). Vries de cellen in bij doorgang 2 in 2 ml steriel gefilterd vriesmedium (70% DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO) verdeeld over twee cryobuizen van 1,5 ml en bewaar ze op -80 °C tot verder gebruik. Gebruik trypsine om de cellen uit het weefselkweekplastic te verwijderen.
6. Isoleer van spieren afgeleide endotheelcellen.
   1. Als peesfibroblasten niet geïsoleerd zijn van dezelfde muis, begin dan met stap 1.5.1 en 1.5.2.
   2. Gebruik een schaar om de achterpoten van het lichaam te scheiden door bij het heupgewricht te knippen.
   3. Was de achterpoten eenmaal in koude PBS (~ 4 °C), verwijder de spieren (quadriceps femoris, extensor digitorum longus, soleus en gastrocnemius) met een scalpel (nr. 21) en plaats de spieren in een petrischaal op ijs.
   4. Gebruik een vers scalpelmesje (nr. 21) om het spierweefsel in stukjes kleiner dan 1^mm3 te hakken terwijl u de petrischaal op ijs houdt.
   5. Bundel het gehakte spierweefsel van beide achterpoten in een plastic buis van 50 ml met 12,5 ml spierverteringsmedium (PBS + 2 mg/ml collagenase IV + 2 mg/ml dispase II + 2 mM CaCl₂).
   6. Plaats de plastic buis gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Schud de oplossing krachtig en plaats deze nog eens 10 minuten terug. Herhaal dit totdat de oplossing homogeen blijkt te zijn en er alleen (witte) stukjes pees en fascia overblijven (ca. 4 x 10 min). Ga ondertussen verder met de isolatie van de peesfibroblasten of de isolatie van de macrofagen.
   7. Voeg 12,5 ml koude PBS + 10% FBS toe aan de plastic buis om de spijsvertering te stoppen.
   8. Gebruik een pipethouder op batterijen die is uitgerust met een pipet van 50 ml om de suspensie uit de plastic buis op te zuigen. Rust de plastic buis uit met een celzeef van 400 μm en filter de suspensie om vuil te verwijderen. Herhaal het proces met een celzeef van 100 μm.
   9. Centrifugeer de gefilterde suspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer in 10 ml koud PBS + 10% FBS en centrifugeer opnieuw.
   10. Resuspenderen in 8 ml endotheelkweekmedium (1:1 mengsel van DMEM/F12 en de endopan 3-kit + 10 E/ml heparine + 20% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 30 mg/ml endotheliaal groeisupplement) aangevuld met puromycine (4 mg/ml) voor populatieselectie.
   11. Zaai de cellen van één muis in een T25-kweekkolf die vooraf gedurende 2 uur bij 37 °C is bedekt met 2 ml van een steriele 0,2% gelatineoplossing en vervolgens een nacht bij RT is gedroogd nadat de overtollige oplossing is verwijderd. Bereid de kolven de dag voor de isolatie voor.
   12. Verwijder na 24 uur in standaardkweekomstandigheden (37 °C, 20% O₂) het puromycine-supplementmedium, was de aangehechte cellen eenmaal met PBS en kweek ze in 8 ml endotheelkweekmedium.
   13. Breng de cellen 1:5 bij 80% confluentie over in met gelatine beklede kolven en gebruik ze in experimenten tot P2. Gebruik een andere oplossing voor celloslating dan trypsine (Materiaaltabel) om de cellen uit het weefselkweekplastic te verwijderen en vries ze niet in.
7. Isoleer van beenmerg afgeleide macrofagen.
   1. Als peesfibroblasten of endotheelcellen niet uit dezelfde muis zijn geïsoleerd, voer dan eerst de stappen 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 en 1.6.3 uit.
   2. Na het verwijderen van de huid, de pees en de spierweefsels, wast u de overgebleven botten (dijbeen en scheenbeen) eenmaal in koude PBS (~4 °C).
   3. Plaats de botten in verse koude PBS (~4 °C) en gebruik een scalpel (nr. 21) om de epifysen geleidelijk weg te snijden totdat het beenmerg bloot komt te liggen. Het verschijnt als een rode stip aan beide zijden van het bot.
   4. Rust een spuit uit met een injectienaald van 0,4 mm x 25 mm (G27) en vul deze met 10 ml macrofaagkweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 1% niet-essentiële aminozuren).
   5. Houd het ene bot na het andere boven een plastic buisje van 50 ml, steek de injectienaald ongeveer 1 mm diep in het blootliggende beenmerg aan de bovenkant en spoel het beenmerg eruit door de spuit te legen. Het weggespoelde beenmerg verschijnt als een roodachtige buisachtige structuur wanneer het in het medium wordt gesuspendeerd.
   6. Los het beenmerg op door het herhaaldelijk voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipetpunt van 1 ml. Gebruik een pipethouder op batterijen die is uitgerust met een pipet van 50 ml om de celsuspensie door een celzeef van 100 μm terug in de plastic buis van 50 ml te filteren en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij RT bij 350 x g .
   7. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 10 ml lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC) en centrifugeer opnieuw op 350 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   8. Resuspendeer de pellet in 5 ml macrofaagkweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 1% niet-essentiële aminozuren) en zaai het in onbehandelde petrischaaltjes met een diameter van 100 mm (5-8 x 10,⁶ cellen per schaaltje).
   9. Voeg na 4 uur 5 ml macrofaagkweekmedium aangevuld met 40 ng/ml macrofaagkoloniestimulerende factor (m-CSF) toe aan het celkweekmedium zonder m-CSF (1:1-mengsel) om tot een eindconcentratie van 20 ng/ml m-CSF te komen.
   10. Gebruik de cellen na 6 dagen in experimenten of vries ze in tot verder gebruik. Gebruik een andere oplossing voor celloslating dan trypsine (Materiaaltabel) om de cellen uit het weefselkweekplastic te verwijderen.
       OPMERKING: Eenmaal geïsoleerd, zetten de cellen niet meer uit. De hier beschreven celisolatiemethoden werken ook met muizen en ratten buiten de aangegeven leeftijdscategorie.
8. Om het fenotype van de geïsoleerde celpopulaties met flowcytometrie te verifiëren, gaat u verder met stap 6.3.4.

2. Collageenisolatie van Wistar- of Sprague-Dawley-ratten

1. Volg het isolatieprotocol dat elders in detail wordt beschreven⁸⁶. Het werkt ook bij muizen, zij het met een veel lagere opbrengst.
2. Bepaal de concentratie van de resulterende oplossing met een hydroxyproline-assay, beoordeel de zuiverheid met SDS-page en bewaar de oplossing bij 4 °C tot gebruik in de experimenten.

3. Productie van de componenten van het kweeksysteem

1. 3D-print de klemhouders, het montagestation en de kamermallen.
   1. Laad het bijgevoegde .stl-bestand (aanvullend bestand 1) voor de klemhouders, het montagestation en de kamermallen in de snijsoftware. Als u de objectnummers naar wens wilt aanpassen, gebruikt u aanwijzen en klikken om objecten te selecteren en kopiëren en plakken om ze te vermenigvuldigen.
   2. Druk op G-code exporteren (Ctrl-R) om de G-code te genereren en vervolgens te exporteren (Ctrl-G).
   3. Laad de G-code in een 3D-printer.
   4. Gebruik ongekleurde, biocompatibele filamenten voor het printproces (d.w.z. polymelkzuur).
   5. Snijd schroefdraad van 3 mm in de gaten van de clamphouder die de schroeven zal dragen met behulp van een draadafsnijder (aanvullende vijl 2 en aanvullende vijl 3, gaten 1 en 3).
   6. Steek roestvrijstalen paspennen in het gat aan de achterkant van de clamphouder (aanvullende vijl 2 en aanvullende vijl 3, gat 4).
   7. Steriliseer de klemhouders en het montagestation minimaal 1 uur voor gebruik met UV-licht. Gebruik 3D-geprinte klemhouders niet opnieuw.
   8. U kunt ook de klemhouders en het montagestation met polyetherimide produceren met behulp van de bijgevoegde plannen (aanvullend bestand 2, aanvullend bestand 3 en aanvullend bestand 4), wat duurder is maar betere sterilisatiemethoden (dwz autoclaveren) en herhaald gebruik mogelijk maakt.
2. Giet de kamers met behulp van de 3D-geprinte mallen.
   1. Vul de kamervormen met siliconen.
   2. Ontgas de siliconen in een vacuümkamer (90 mbar) gedurende 30 min.
   3. Laat de oplossing een nacht bij RT polymeriseren of op een kookplaat bij 70 °C gedurende 1 uur, afhankelijk van de hittebestendigheid van de filamenten die voor de mallen worden gebruikt.
   4. Verwijder voorzichtig de gepolymeriseerde kamers uit de mallen en snijd overtollige siliconen weg met een scalpel (nr. 21).
   5. OPTIONEEL: Als de assemblages en dus de omringende kamers mechanisch moeten worden belast, versterk dan de gaten in de siliconenkamers met holle buizen van roestvrij staal.
3. Bewerk de metalen klemmen uit roestvrij staal met behulp van het bijgevoegde plan (aanvullend bestand 5).
4. Was voor elk gebruik de roestvrijstalen klemmen, de polyetherimide klemhouders, de schroeven en de siliconenkamer.
   1. Sonicaat gedurende 10 minuten in 80% ethanol (EtOH) en 20% omgekeerde osmose water (ROW).
   2. Sonicaat gedurende 10 minuten in 50% EtOH en 50% Isopropanol.
   3. Spoel 3x uit met ROW.
   4. Sonicaat gedurende 10 minuten in 0,5% alkalisch reinigingsconcentraat (d.w.z. 3 ml in 600 ml ROW).
   5. Sonicaat gedurende 10 minuten in 0,5% alkalisch reinigingsconcentraat.
   6. Laat 0,5% alkalisch reinigingsconcentraat inwerken tijdens het schudden gedurende 1 uur en 50 minuten.
   7. Spoel 3x uit met ROW.
   8. Sonicaat gedurende 10 minuten in RIJ.
   9. Laat de componenten aan de lucht drogen en autoclaveren in een autoclaaf.

4. Klemmen van de kernexplantaties

1. Plaats bijpassende klemhouders samen met elk een metalen klem in het montagestation.
2. Leg natte geautoclaveerde stukjes papier (4 mm x 25 mm) op de metalen klemmen en knip het papier vervolgens langs de binnenranden van de klemmen af met een scalpel (nr. 21). Knip 2 extra, kleinere stukjes papier (4 mm x 1,5 mm) weg van een ander stuk papier en houd ze nat.
3. Plaats met een puntig pincet 8 kernexplantaten op het papier tussen de metalen klemmen met hun eindpunten op de metalen klemmen.
4. Bedek de eindpunten van de kernexplantaten met de klaargemaakte kleinere stukjes papier (4 mm x 1,5 mm) en plaats er vervolgens metalen klemmen op. Gebruik een schroevendraaier en de kleine schroeven (M3 x 6 mm) om de kernexplantaties tussen de metalen klemmen en de klemhouder te bevestigen.
5. Breng de geklemde kernexplantaten voorzichtig over in de siliconenkweekkamers en vul deze kamers met 2 ml standaard celkweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 1% niet-essentiële aminozuren).
6. OPTIONEEL: Als de assemblages/de omringende kamers mechanisch moeten worden belast, bevestig ze dan met extra schroeven (M3 x 16 mm) in gat 3 (aanvullende vijl 2 en aanvullende vijl 3, gat 3).

5. Voorbereiding en gieten van collageenhydrogel

1. Verwijder de doelcellen uit het weefselkweekplastic met celloslatingsoplossing, centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 400 x g bij RT en resuspendeer ze in 1 ml standaardkweekmedium.
2. Voor één assembloid zijn 10 μL PBS (20x), 1,28 μL 1 M NaOH (125x), 8,72 μL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O, 23x), 80 μL collageen-1 (2,5x of 1,6 mg/ml definitief) en 100 μL (2x) standaard kweekmedia (voor kern// celvrije assembloids) of celsuspensie vereist. Bereid deze componenten voor in twee afzonderlijke oplossingen en meng ze pas vlak voor het gieten.
   1. Crosslinking-oplossing: Bundel de PBS, de NaOH, de ddH₂0 en de celsuspensie van maximaal 12 assembloids (+10% veiligheidsmarge) in een crosslinking-oplossing en bewaar deze in een plastic buis van 15 ml op ijs. Pas de concentratie van de celsuspensie aan om de volgende eindconcentraties te bereiken na het mengen van de twee oplossingen: 250.000 cellen/ml peesfibroblasten, 500.000 cellen/ml spierafgeleide endotheelcellen of 370.000 cellen/ml beenmerg-afgeleide macrofagen.
   2. Collageen-1-oplossing: Pool de collageen-1-oplossing die nodig is voor maximaal 12 assembloids (+10% veiligheidsmarge) in een andere plastic buis van 15 ml en bewaar deze op ijs.
3. Zodra de vernettingsoplossing en de collageen-1-oplossing klaar zijn op ijs, zuigt u het celkweekmedium op uit de kweekkamers die de geklemde kernexplantaten bevatten.
4. Voeg de collageen-1-oplossing toe aan de vernettingsoplossing met een pipet van 1000 μL en meng de twee oplossingen door snel op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren. Bedek de afzonderlijke peeskernexplantaten met 200 μL van de gemengde oplossing door deze in de groeven te pipetteren die door de siliconenkamers worden geleverd.
5. Laat de hydrogels 50 minuten polymeriseren bij 37 °C.
6. Vul de siliconen kweekkamers voorzichtig met 1,5 ml van het betreffende co-cultuurmedium door het in de hoeken van de kamers te pipetteren.
   1. Vul voor de kern // cocultuur van fibroblasten DMEM/F12, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 1% amfotericine, 200 μM L-ascorbinezuur, 20 ng/ml macrofaag-koloniestimulerende factor.
   2. Vul voor de cocultuur van de kernmacrofagen DMEM/F12, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline/streptomycine, 1% amfotericine, 200 μM L-ascorbinezuur, 20 ng/ml macrofaag-koloniestimulerende factor.
   3. Vul voor co-cultuur van kerncellen // endotheelcellen een 1:1-mengsel van DMEM/F12 en de endopan 3-kit + 10 E/ml heparine + 20% FBS + 1% penicilline/streptomycine + 1% amfotericine + 30 mg/ml endotheelgroeisupplement.
7. Kweek de assembloids in de kweekomstandigheden die geschikt zijn voor de hypothese. Om bijvoorbeeld een laesie-achtige niche-omgeving na te bootsen, kweekt u ze bij 37 °C en 20% O₂. Verander het kweekmedium twee keer in 1 week. Om infecties te voorkomen, plaatst u de kamers in een grote petrischaal of een steriele doos voordat u ze in een couveuse plaatst.
   OPMERKING: De kweektijd is afhankelijk van de hypothese en de co-cultuuropzet. Kern // fibroblast assembloids in een laesie-achtige niche-omgeving worden bijvoorbeeld mechanisch onstabiel na ongeveer 3 weken.

6. Beschikbare uitleesmethoden

1. Voer fluorescentiemicroscopie uit, inclusief levensvatbaarheids- en morfologietests.
   1. Over het algemeen kunnen de assembloids worden afgebeeld als volledige mounts. Om dit te doen, verwijdert u de assembloids van de klemmen door ze met een schaar dicht bij de klemmen af te knippen en over te brengen naar een plaat met 12 putjes.
   2. Was de assembloids een keer met PBS.
   3. Als er een levensvatbaarheidsanalyse wordt uitgevoerd, kleurt u elke assembloid met 100 μL 4 x 10⁻⁶ M ethidiumhomodimeer in PBS (EthD-1) gedurende 20 minuten bij 37 °C in het donker.
   4. Was de assembloids 3x met PBS en fixeer ze vervolgens met 500 μL 4% formaldehyde elk gedurende 20 minuten op RT.
      LET OP: 4% formaldehyde heeft allergene, kankerverwekkende en mutagene effecten, is giftig voor de voortplanting en kan ontwikkelingstoxiciteit (reprotoxisch) of schade aan organen veroorzaken. Draag beschermende kleding en handschoenen, oogbescherming en een masker of andere ademhalingsbescherming.
   5. Was de assembloids 3x met PBS en ga verder met het kleuringsprotocol naar keuze. Een selectie van kleuringen is eerder beschreven^84,85.
      OPMERKING: Vermijd kleuringen die fluoroforen gebruiken met een emissiegolflengte die dicht bij die van collageen autofluorescentie ligt (ongeveer 480 nm).
2. Voer volgens de instructies van de fabrikant compartimentspecifieke RNA-isolatie uit voor RT-qPCR of genoombrede RNA-sequencing.
   1. Verwijder de assembloids met een schaar van de klemmen.
   2. OPTIONEEL: Gebruik een pincet om de kernexplantaten te scheiden van het extrinsieke hydrogelcompartiment.
   3. Pool 20-24 20 mm kernexplantaten of 2 celbeladen collageenhydrogels om voldoende hoeveelheden RNA te isoleren.
   4. Gebruik 1 ml koude trizol en mechanische verstoring (d.w.z. metalen kralen of cryogeen slijpen) om de extracellulaire matrix van de gepoolde kernexplantaten of de gepoolde collageenhydrogels te vernietigen.
      LET OP: Orale, dermale en inhalatietoxiciteit. Veroorzaakt huid- en oogirritatie. Hanteer alleen met handschoenen en in een chemische veiligheidskast.
   5. Ga verder met RNA-isolatie uit het cellysaat met behulp van standaard RNA-extractiekits zoals eerder beschreven of zoals beschreven in de instructies van de fabrikant^84,85.
3. Compartimentspecifieke flowcytometrie.
   1. Verwijder de assembloids met een schaar van de klemmen.
   2. OPTIONEEL: Gebruik het pincet om de kernexplantaten te scheiden van het extrinsieke hydrogelcompartiment.
   3. Verteer compartimenten in 1 ml PBS met collagenase I (3 mg/ml) en dispase II (4 mg/ml) gedurende 4 uur bij 37 °C onder constante agitatie.
   4. Centrifugeer de verteerde oplossing bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT en zuig het supernatant op.
   5. Resuspendeer de pellet in 100 μL FACS-buffer (1% FBS in PBS) die de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen naar keuze bevat. Een selectie van werkende fluorofoor-geconjugeerde antilichamen is eerder beschreven^84,85.
   6. Incubeer de kleuroplossing gedurende 30 minuten bij RT.
   7. Verdun de kleuroplossing met 1,4 ml FACS-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT.
   8. Resuspendeer de pellet in 350 μL FACS-buffer en filtreer de oplossing door een 100 μm nylon zeefkap voordat u deze analyseert met de flowcytometer naar keuze volgens de instructies van de fabrikant.
4. Analyseer de supernatant.
   1. Vervang het co-kweekmedium 3 dagen voor het verzamelen van het supernatans door serumvrij co-cultuurmedium.
   2. Voer onmiddellijke en vertraagde analyse uit van de verrijkte, onverdunde supernatans met enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) en mesoschaalontdekking (MSD) testkits. Bewaar het supernatans voor de vertraagde analyse in plastic buisjes van 1,5 ml bij -80 °C.
5. Beoordeel de mechanische eigenschappen van de assembloid.
   1. Gebruik een op maat gemaakt rekapparaat om mechanische krachten uit te oefenen en mechanische eigenschappen te meten²². De roestvrijstalen paspennen en de roestvrijstalen schroeven maken de klemmen ook aan andere rekinrichtingen te bevestigen.
   2. Aangezien de mechanische eigenschappen van de assembloid grotendeels worden bepaald door die van de ingebedde kernexplantatie ¹⁸, moet u de mechanische eigenschappen van de kernexplantatie meten voordat deze in een hydrogel wordt ingebed om het risico te verkleinen dat de vers gegoten hydrogel tijdens het meetproces wordt vernietigd.

Resultaten

Isolatie van componenten (Figuur 1 en Figuur 2)
Voordat de kernexplantaten en celpopulaties in assembloid-cocultuur worden gebruikt, moeten deze componenten onder de microscoop worden gecontroleerd (Figuur 1). Kernexplantaten moeten een uniforme diameter hebben (100-200 μm) en geen zichtbare knikken of rimpels. Endotheelcellen moeten een langwerpige vorm vertonen in contact met andere cellen, wat ze niet hebben wanneer ze met een te lage dichtheid worden gezaaid vanwege een lage aanvangsopbrengst van de isolatie. In dit geval nemen de endotheelcellen een meer ronde vorm aan met cytoskeletale extensies en prolifereren ze aanzienlijk langzamer. Splits ze 1:5 na 7-10 dagen. Peesfibroblasten geïsoleerd uit de achillespezen nemen een meer ronde morfologie aan in vergelijking met hun menselijke tegenhangers binnen 1-2 passages (elk 10-14 dagen) toen ze 1:6 werden gesplitst. Macrofagen zijn veel kleiner dan fibroblasten of endotheelcellen en vermenigvuldigen zich niet na de isolatie. Afhankelijk van de batch kan hun vorm variëren van piramidaal tot rond.

De fenotypes van de cellulaire componenten werden geverifieerd met flowcytometrie. Een geconjugeerd CD31-antilichaam werd gebruikt als marker voor endotheelcellen (figuur 2A). Bij het instellen van de fluorescentiedrempel op basis van een ongekleurd controlemonster (grijs) werden 90,1% van passage 1 (P1) en 48,7% van passage 2 (P2) endotheelcellen geïdentificeerd als CD31-positief. Een genetisch gemodificeerde muizenlijn die de peesfibroblastmarker Scleraxis samen met een groen fluorescerend eiwit (ScxGFP) en een geconjugeerd CD146-antilichaam tot expressie brengt, werd gebruikt om de peesfibroblasten te karakteriseren (Figuur 2B)^35,60. Na één passage (P1) was 37,3% van de fibroblasten ScxGFP⁺CD146^-, 0,2% ScxGFP+CD146⁺, 4,3% ScxGFP-CD146⁺ en 58% ScxGFP-CD146^-. Na twee passages (P2) daalde het percentage ScxGFP⁺CD146-cellen tot 27,6%, het percentage ScxGFP+CD146^+-cellen tot 6,9%, het percentage ScxGFP-CD146^+-cellen tot 10,6% en het percentage ScxGFP-CD146-cellen daalde tot 54,9%. Om de macrofagen te identificeren en te karakteriseren, werd een F4/80-antilichaam gebruikt in combinatie met een CD86- en een CD206-antilichaam (Figuur 2C). Na isolatie en kweek was 96,4% van de van het beenmerg afgeleide cellen F4/80-positief. Van deze F4/80-positieve cellen was 8,6% CD206⁺CD86^-, 23,6% CD206⁺CD86⁺, 28,3% CD206-CD86⁺ en 39,4% CD206-CD86^-. De snelheid van het verknopen van collageen kan van batch tot batch variëren en moet worden getest voordat met experimenten wordt begonnen.

Assembloid uiterlijk (Figuur 3)
In laesieachtige kweekomstandigheden (36 °C, 20% O₂) bleef de explantatiekern mechanisch rekbaar, veranderde niet van uiterlijk en bleef gedurende ten minste 21 dagen visueel te onderscheiden en fysiek te scheiden van de omringende hydrogel (figuur 3A,B). De omringende hydrogel werd in de loop van de tijd verdicht, waarbij de verdichtingssnelheid afhankelijk was van de celpopulatie die erin werd gezaaid. Van achillespees afgeleide fibroblasten trokken hun omringende hydrogel het snelst samen en deden dit radiaal wanneer ze in een hydrogel rond een kernexplantatie werden gegoten en in alle richtingen wanneer dat niet het geval was (Figuur 3B,C). Aanvankelijk werden celvrije hydrogels die rond een kern werden geplaatst, ook verdicht. Deze samentrekking werd waarschijnlijk veroorzaakt door migrerende cellen uit de kernexplantatie, wat wijst op een dynamische cross-compartimentele interface. Aangezien celvrije hydrogels zonder ingebedde kern niet detecteerbaar verdichten, lijkt de bijdrage van door waterverlies veroorzaakte krimp verwaarloosbaar te zijn (Figuur 3B en aanvullend dossier 6).

Een gebrek aan hydrogelverdichting kan daarom worden gebruikt om fouten in de assemblage op te sporen (d.w.z. lage celconcentraties) en moet worden gecontroleerd voordat wordt doorgegaan met duurdere uitleesmethoden. Bij het vaststellen van deze methode waren veelgemaakte fouten bij het verlagen van de celconcentratie onder meer het afsterven van cellen in de extrinsieke hydrogel omdat ze te lang in de relatief harde verknopingsoplossing werden gelaten (hoge pH, lage temperatuur) en het drogen van kernexplantaten omdat de tijd tussen mediumaspiratie en hydrogelinjectie te lang was, of omdat de kernexplantatie te hoog was vastgeklemd om in het collageen te worden ingebed.

Confocale fluorescentiemicroscopie: levensvatbaarheids- en morfologieanalyse (Figuur 3)
Eenmaal verwijderd van de klemmen met een schaar (Figuur 3B), kunnen assembloids worden bevestigd, gekleurd en afgebeeld met een confocale microscoop als geheel zonder secties. Hier werden kern // endotheelcel, kern // macrofaag en kern // fibroblast assembloids gekleurd met DAPI (NucBlue) en Ethidium Homodimer (EthD-1) om de levensvatbaarheid te analyseren en DAPI en F-actine om morfologie en celverspreiding in de 3D-collageenhydrogel te analyseren (Figuur 3D). De levensvatbaarheid van kernassemblages // endotheelcellen (figuur 3E) werd gekwantificeerd en bleek over het algemeen lager te zijn na assemblage van assemblages dan eerder gerapporteerd voor kernassemblage // macrofaag en kern // fibroblastassemblages⁸⁴. De levensvatbaarheid bleef echter stabiel tijdens de assembloidcultuur tot ten minste dag 7.

Mechanisch geïnduceerde microschade en meting van mechanische eigenschappen (figuur 4)
De schroeven en pennen die aan de klemhouders zijn bevestigd, maken het mogelijk om geklemde assemblages te bevestigen aan uniaxiale rekinrichtingen. Het hier op maat gemaakte rekapparaat is uitgerust met een 10 N load cell en is beschreven in eerdere publicaties (Figuur 4A)²². Alle monsters werden voorafgaand aan de metingen vooraf geconditioneerd met vijf rekcycli tot 1% rek.

Het registreren van de volledige spannings-rekcurve van kernexplantaten of assembloids (figuur 4B) zou kwantificering van de lineaire elastische modulus (α), de maximale spanning (β) en de maximale rek (у) mogelijk maken. Het beschadigt echter ook onomkeerbaar de kernexplantatie of het assemblooïde, waardoor het onmogelijk is om de longitudinale ontwikkeling van de maximale spanning (β) en de maximale rek (у) voor dezelfde monsters te beoordelen (figuur 4B). Hier werd de lineaire elastische modulus gebruikt als maat voor het vermogen van het monster om krachten te weerstaan, aangezien deze meting vereist dat het monster wordt uitgerekt tot slechts 2% rek, waarvan eerder is aangetoond dat het geen permanente verlagingen van de lineaire elastische modulus¹⁸ veroorzaakt. In het bijzonder werden kern// endotheelcelassemblages blootgesteld aan de klemprocedure tot 2% rek (ongeveer het einde van het lineaire elastische gebied) of 6% rek (ongeveer de maximale rek). De resulterende microschade werd beoordeeld door de lineaire elastische modulus voor en na de procedure te meten (figuur 4C).

In overeenstemming met eerder uitgevoerde experimenten waarbij gebruik werd gemaakt van explantaten met monocultuurkernen, behielden kern// endotheelcelassemblages hun lineaire elastische modulus gedurende ten minste 14 dagen wanneer ze werden gekweekt in quasi-homeostatische nicheomstandigheden (29 °C, 3% O₂) en werden blootgesteld aan stammen die niet hoger waren dan 2%^18,21. Wat mechanische basislijnstimulatie betreft, leek de statische rek die door de klemmen werd aangelegd, voldoende de oorspronkelijke rekniveaus na te bootsen die in vivo door peeskerneenheden werden ervaren om katabole processen te voorkomen die over het algemeen worden geassocieerd met het ontladen van de matrix⁸⁷. De progressieve en statistisch significante afname van de lineaire elastische modulus die wordt waargenomen in kern// endotheelcelassemblages die zijn blootgesteld aan een spanning van 6%, kan inderdaad worden toegeschreven aan de ontlading van de matrix als gevolg van mechanisch geïnduceerde microschade aan de matrix.

Bij het uitvoeren van deze experimenten is het belangrijk om het uitdrogen van de assembloid te voorkomen. Hier werden ze ingekapseld in geautoclaveerd en bevochtigd papier, maar andere methoden zouden ook levensvatbaar kunnen zijn, afhankelijk van hun compatibiliteit met het gebruikte rekapparaat. Aangezien de wrijving tussen de metalen klemmen en de kernexplantatie beperkt is, voegt u tijdens het klemmen kleine stukjes papier toe tussen het metaal en de kernexplantatie om slippen te voorkomen en het rekproces nauwlettend in de gaten te houden om explantaten en assembloids van de uitgegleden kern te detecteren en uit te sluiten.

Compartiment-specifieke transcriptoom- en assembloid-specifieke secretoomanalyse (Figuur 5 en Figuur 6)
In de eerste reeks kernmonocultuurexperimenten die hier worden gepresenteerd, werd de stabiliteit van kerngenexpressie na explantatie-isolatie beoordeeld om isolatie los te koppelen van experimentele effecten (Figuur 5A). Hoewel hogere duplicaataantallen nodig zijn voor precieze conclusies, nam de expressie van Vegfa en Mmps sterk toe in vers geïsoleerde kernexplantaten binnen enkele uren na de explantatie-isolatie wanneer gekweekt in laesie-achtige niche-omstandigheden (37 °C, 20% O₂).

Neovascularisatie is een centraal kenmerk van peesziekte en -herstel dat gedeeltelijk kan worden aangedreven door endotheelcellen die worden geactiveerd door pro-angiogene factoren (d.w.z. vasculaire endotheliale groeifactor, Vegfa) die worden uitgescheiden door de peeskern onder hypoxie⁸⁸. Bij onderzoek van de eerste stap van deze mogelijke overspraak (Figuur 5B) bleek dat de expressie van zowel Vegfa als de hypoxiemarker koolzuuranhydrase 9 (Ca9) statistisch significant verhoogd bleek te zijn bij explantaten die monocultuur hadden ondergaan onder lage zuurstofspanning (3% O₂) in tegenstelling tot explantaten die waren gekweekt onder hoge zuurstofspanning (20% O₂). Ondertussen leek de lagere zuurstofspanning geen veranderingen te veroorzaken in de expressie van peesfibroblastmarkers zoals Scleraxis (Scx) en collageen-1 (Col1a1). Samen identificeren deze resultaten kernresidente cellen als plausibele bijdragers aan pro-angiogene signalering in een hypoxische niche.

Vervolgens werd de activering van endotheelcellen door pro-angiogene kernsignalering beoordeeld in core // endotheelcel assembloid co-cultuur onder hoge (20% O₂) en lage (3% O₂) zuurstofspanning. Gelukkig maakt de modulaire samenstelling van assembloids compartimentspecifieke transcriptoomanalyse na kweek mogelijk door de kernexplantatie fysiek te scheiden van de extrinsieke collageenhydrogel (Figuur 6A). In de kernexplantatie (Figuur 6D) werd opnieuw bevestigd dat de expressie van Vegfa toenam bij lage zuurstofspanning, hoewel het effect op andere hypoxische markers zoals Fgf2 minder duidelijk was en hogere replicatiegetallen vereist voor precieze conclusies. Bovendien was de expressie van pro-inflammatoire markers zoals Tnf-α en markers voor afbraak van extracellulaire matrix zoals Mmp3 in de kern verminderd onder lage zuurstofspanning. In de extrinsieke hydrogel die aanvankelijk was ingezaaid met endotheelcellen (Figuur 6E), verminderde de aanwezigheid van een explantatie (aC) van een levende kern de Vegfa-expressie bij lage zuurstofspanning, maar niet bij hoge zuurstofspanning. Bovendien verminderde de aanwezigheid van een gedevitaliseerde (dC) kernexplantatie onder lage zuurstofspanning ook de Vegfa-expressie niet. Onder lage zuurstofspanning was de expressie van Tnf-α in de extrinsieke hydrogel vergelijkbaar rond aC/dC, maar nam toe onder hoge zuurstofspanning rond explantaten met levende kern. Fgf2-expressie was onder alle omstandigheden verminderd in vergelijking met de extrinsieke met endotheelcellen beladen hydrogel die rond een gedevitaliseerde kernexplantatie werd gekweekt onder hoge zuurstofspanning, maar het meest onder lage zuurstofspanning. Mmp3-expressie was het hoogst rond levende kernexplantaten onder hoge zuurstofspanning en het laagst rond gedevitaliseerde kernexplantaten onder lage zuurstofspanning. Over het algemeen lijken de co-gekweekte endotheelcellen te reageren op zowel de actieve kernexplantatie, die in staat is om overspraak als variaties in zuurstofniveaus te initiëren. Een uitgebreidere transcriptoomanalyse zou de opheldering van hun respectieve bijdragen vergemakkelijken.

De modulariteit van het assembloid-systeem maakt de integratie mogelijk van genetisch gemodificeerde cellen die fluorescerende reportergenen bevatten. Hier werden endotheelcellen geïsoleerd uit Pdgfb-iCreER mG-muizen⁸⁹ in het hydrogelcompartiment gezaaid. Deze cellen brengen samen de endotheelcelmarker bloedplaatjes-afgeleide groeifactor subeenheid b (Pdgfb) tot expressie naast het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP), waardoor Pdgfb-expressieve endotheelcellen groen lijken onder de microscopie (Figuur 6C). Met behulp van deze methode werd bevestigd dat de aanwezigheid van endotheelcellen die Pdgfb tot expressie brengen, gedurende 7 dagen in kweek (37 °C) werd gehandhaafd en onafhankelijk bleek te zijn van zuurstofspanning (20% O₂ vergeleken met 3% O₂).

Om het secretoom van assembloiden te analyseren, werd het kweekmedium dat respectievelijk werd gebruikt voor kern // celvrije en kern // fibroblast, kern // macrofaag of kern // cocultuur van endotheelcellen vervangen door zijn serumvrije tegenhanger drie dagen voordat het supernatans dat nu verrijkt was met het secretoom werd opgezogen en ingevroren (Figuur 6A). Deze verrijkingstijd was voldoende om cytokines zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) te detecteren met een MSD-test, zoals hier wordt getoond voor kernexplantaten en kern// fibroblastassembloids gekweekt in laesie-achtige niche-omstandigheden (Figuur 6B).

Belangrijke overwegingen bij het analyseren van de secretomen en transcriptomen van kernexplantaten en assembloids betreffen het gebruik van de juiste controles. Vers geïsoleerde kernexplantaten hebben een beperkte waarde, omdat vooral hun expressie van Vegfa en Mmps binnen enkele uren na de isolatie sterk toeneemt (Figuur 5A). Op tijd afgestemde explantaten omgeven door een aanvankelijk celvrije hydrogel zijn geschikter als controles voor de genexpressie van het kerncompartiment. Voor de extrinsieke hydrogel zijn met cellen beladen hydrogels gekweekt zonder een kernexplantatie inferieure controles in vergelijking met met cellen beladen hydrogels die worden gekweekt rond gedevitaliseerde kernexplantaten (aanvullend bestand 7), voornamelijk omdat ze samenpersen tot ronde vormen in plaats van langwerpige hydrogels die de celmorfologie sterk veranderen (Figuur 3A).

Figuur 1: Isolatie en assemblage van assemblagecomponenten om in vivo overspraak te modelleren. Explantaten van de peeskern werden uit muizenstaarten gehaald, doorgesneden en vastgeklemd. Beenspieren van muizen (d.w.z. quadriceps femoris (QF), gastrocnemius (G) en tibialis anterior (TA)) werden verteerd om endotheelcellen te isoleren die vervolgens werden gekweekt op weefselkweekplastic. De achillespezen (AT) werden ook verteerd om peesfibroblasten te isoleren, die vervolgens werden gekweekt op weefselkweekplastic. Het beenmerg van het scheenbeen en het dijbeen werd uit de botten gespoeld. Vervolgens werden de geïsoleerde monocyten gekweekt op weefselkweekplastic en gedifferentieerd in naïeve macrofagen. De lichtmicroscopiebeelden (10x) tonen het uiterlijk van kernexplantaten, endotheelcellen, peesfibroblasten en macrofagen vlak voor hun integratie in assembloids. Tijdens de assemblage werden de op plastic gekweekte cellen in suspensie gebracht en vervolgens gezaaid in een collageen-1-oplossing (1,6 mg/ml). Vervolgens werd het cel-hydrogelmengsel rond de geklemde kernexplantatie gegoten en gedurende 50 minuten bij 37 °C gepolymeriseerd voordat het kweekmedium werd toegevoegd. De kweekomstandigheden werden geregeld via de klemmen (mechanische spanning) en de instellingen van de incubator (zuurstofconcentratie, temperatuur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Karakterisering van cellulaire assemblagecomponenten. (A) Representatieve flowcytometrische analyse van van spieren afgeleide endotheelcellen na één passage (P1, bovenste rij) en twee passages (P2, onderste rij). De tellingen voor ongekleurde (grijze) en CD31-gekleurde (groene) cellen werden genormaliseerd naar modaal. De percentages worden gegeven voor de CD31-gekleurde groep. (B) Representatieve flowcytometrische analyse van van de achillespees afgeleide fibroblasten na één passage (P1, bovenste rij) en twee passages (P2, onderste rij). De assen rapporteren fluorescentie-intensiteiten van ongekleurde cellen (grijs) en cellen die beide ScxGFP tot expressie brengen en gekleurd zijn met CD146-antilichamen (regenboogkleuren). (C) Representatieve flowcytometrische analyse van van beenmerg afgeleide macrofagen na kweek. In de bovenste rij werden de tellingen voor niet-gekleurde (grijze) en F4/80-gekleurde (groene) cellen genormaliseerd naar modaal. De percentages zijn gegeven voor de groep met F4/80-kleuring. De grafiek in de onderste rij rapporteert fluorescentie-intensiteiten van ongekleurde cellen (grijs) en de F4/80⁺ subset van cellen gekleurd met CD206-antilichamen en CD86-antilichamen (regenboogkleuren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Assembloid beeldvorming en uiterlijk. (A) Representatieve foto's genomen op dag 0 (d0) en dag 21 (d21) van de kweek (37 °C, 20% O₂) tonen een multidimensionale samentrekking van een hydrogel die extrinsieke fibroblasten bevat zonder een ingebedde kernexplantatie en een sterke radiale verdichting van een hydrogel die extrinsieke fibroblasten bevat rond een kernexplantatie. (B) Representatieve foto's genomen op dag 21 (d21) van de kweek (37 °C, 20% O₂) tonen verschillen in verdichtingssnelheid tussen celvrije hydrogels, celvrije hydrogels die rond een kernexplantatie zijn gegoten en met peesfibroblasten beladen hydrogels die rond een kernexplantatie zijn gegoten. (C) De representatieve lichtmicroscopiebeelden (10x) genomen op dag 0 (d0) en dag 21 (d21) van de kweek (37 °C, 20% O₂) duiden op longitudinale veranderingen in de aanwezigheid van celpopulaties en de verdichtingssnelheid van de collageenhydrogel (HG) rond de kernexplantatie (E) in de kern // celvrije en kern // fibroblast assembloid cocultuur. De schematische weergave geeft de verschillen weer in hydrogelverdichting tussen kern // celvrije assembloid en kern // fibroblast assembloid co-cultuur. (D) Representatieve confocale microscopiebeelden gemaakt op dag 7 (d7) van kern // endotheelcel, kern // macrofaag en kern // fibroblast assembloid cocultuur (37 °C, 20 % O₂). Afbeeldingen in de linker rij tonen assembloids met celkernen die blauw zijn gekleurd (DAPI) en dode cellen die roze zijn gekleurd (Ethidium homodimeer-1). De andere twee rijen tonen assembloids met celkernen in blauw gekleurd (DAPI) en actinefilamenten in groen (F-actine). (E) Boxplots die de gekwantificeerde levensvatbaarheid weergeven van kern// endotheelcelassemblages op dag 1 (d1) en dag 7 (d7) van co-cultuur. N = 5. De bovenste en onderste scharnieren komen overeen met het eerste en derde kwartiel (25e^en 75e^percentiel ) en het middelste met de mediaan. Snorharen strekken zich uit van het bovenste/onderste scharnier tot de grootste/kleinste waarde niet verder dan 1,5 keer de interkwartielafstand. P-waarden: ^n.s.p > 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Mechanische stimulatie van assembloids en meting van assembloid mechanische eigenschappen. (A) Grafische weergave van het op maat gemaakte rekapparaat bestaande uit de klemhouderplatforms, een krachtsensor en een stappenmotor. De fotografische afbeelding toont een assembloid die met klemmen op het rekapparaat is gemonteerd. Het deksel van een plastic buis van 15 ml (Ø: 17 mm) die wordt gebruikt voor kalkaanslag. (B) Grafiek met representatieve spannings-/rekcurven voor kernexplantaten (lichtblauw) en assembloids (lichtrood). De lineaire elastische modulus (α), maximale spanning (β) en maximale rek (у) kunnen uit de gegevens worden geëxtraheerd om de kernexplantatie of assembloid mechanisch te karakteriseren. (C) Grafiek met de lineaire elastische modulus (Emod) van kern// endotheelcelassemblages die gelijktijdig zijn gekweekt (29 °C, 3% O₂) gedurende een tijdsverloop van 14 dagen nadat ze zijn vastgeklemd (ononderbroken lijn), vastgeklemd en uitgerekt tot 2% L_0-rek (stippellijn), of geklemd en uitgerekt tot 6% L_0-rek (stippellijn) aan het begin van het experiment. N = 5. De datapunten werden genormaliseerd naar de initiële modulus lineaire elastische modulus vóór het uitrekken en worden allemaal weergegeven als gemiddelde (±sem). P-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Veranderingen in het kerntranscriptoom na isolatie en kweek onder verschillende nichecondities. (A) Spreidingsdiagram dat de vouwveranderingen in Vegfa-, Mmp13- en Mmp3-genexpressie weergeeft in monocultuur (37 °C, 20% O₂) muizenkern explantatie 2 uur, 4 uur, 6 uur en 8 uur na isolatie van de staart. De vouwveranderingen op de respectievelijke tijdstippen werden 2 uur na de isolatie genormaliseerd naar de genexpressie. N = 2. (B) Boxplots die de vouwveranderingen in Ca9-, Vegfa-, Scx- en Col1a1-genexpressie weergeven in kernexplantaten die monocultuur hebben ondergaan onder lage zuurstofspanning (3% O₂), genormaliseerd en vergeleken met die in monocultuur onder hoge zuurstofspanning (20% O₂). N = 5-6. De bovenste en onderste scharnieren van de boxplots komen overeen met het eerste en derde kwartiel (25e^en 75e^percentiel ) en het middelste met de mediaan. Snorharen strekken zich uit van het bovenste/onderste scharnier tot de grootste/kleinste waarde niet verder dan 1,5 keer de interkwartielafstand. Datapunten die worden gebruikt voor normalisatie worden weergegeven als zwarte stippen en afzonderlijke datapunten als rode stippen. P-waarden: **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Assembloid-specifiek secretoom- en compartiment-specifieke transcriptoomanalyse. (A) Representatieve foto van de assembloid op dag 7 (d7), toen secretoom- en transcriptoommonsters werden genomen, en weergave van de onderliggende workflow. (B) VEGF-concentratie (pg/ml) in het supernatans van kern// celvrije en kern // fibroblastassembloids na 7 dagen cocultuur (37 °C, 20% O₂) afgebeeld als boxplots. N = 6. (C) Representatieve confocale microscopiebeelden van kern// endotheelcelassemblages na 7 dagen cocultuur (37 °C) onder hoge zuurstofspanning (20% O₂) en lage zuurstofspanning (3 % O₂). Celkernen worden blauw gekleurd (DAPI) en de ingebedde endotheelcellen brengen samen met het versterkte groen fluorescerende eiwit (EGFP) tot expressie naast de endotheelcelmarker van bloedplaatjes afgeleide groeifactor subeenheid b (Pdgfb). De stippellijn geeft het compartiment aan tussen de kernexplantatie (E) en de met endotheelcellen beladen hydrogel (HG). (D) Spreidingsdiagram met de vouwveranderingen in Vegfa-, Tnf-α-, Fgf2- en Mmp3-genexpressie in het kerncompartiment van kern// endotheelcelassemblages die samen zijn gekweekt onder lage zuurstofspanning (3% O₂) genormaliseerd en vergeleken met die gekweekt onder hoge zuurstofspanning (20% O₂). N = 2. (E) Spreidingsdiagram met de vouwveranderingen in Vegfa-, Tnf-α-, Fgf2- en Mmp3-genexpressie in het extrinsieke compartiment van kern// endotheelcelassemblages met een levende kern (aC) of een gedevitaliseerde kern (dC) die samen wordt gekweekt onder hoge zuurstofspanning (20% O₂) en lage zuurstofspanning (3% O₂). De vouwveranderingen in de respectievelijke omstandigheden werden genormaliseerd naar het extrinsieke compartiment van een kern // endotheelcelassemblage met een gedevitaliseerde kern (dC) die mede werd gekweekt onder hoge zuurstofspanning (20% O₂). N = 3-4. In B komen de bovenste en onderste scharnieren van de boxplots overeen met het eerste en derde kwartiel (25e^en 75e^percentiel) en het middelste met de mediaan. Snorharen strekken zich uit van het bovenste / onderste scharnier tot de grootste / kleinste waarde niet verder dan 1,5 keer de interkwartielafstand. Uitschieters worden weergegeven als zwarte stippen. P-waarden: *p < 0,05. In D en E worden de datapunten die worden gebruikt voor normalisatie weergegeven als zwarte stippen en worden afzonderlijke datapunten weergegeven als rode stippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Inputvereisten voor modelsystemen voor peesaandoeningen en -blessures. Een lijst met triggers en secundaire drivers van primaire peesaandoeningen die zijn afgestemd op een selectie van inputparameters waarvan de tractabiliteit centraal staat bij het modelleren van peesaandoeningen en -letsels. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Outputvereisten voor modelsystemen voor peesaandoeningen en -letsels. Een selectie van kenmerken van peesaandoeningen die overeenkomen met een selectie van outputparameters waarvan de kwantificeerbaarheid centraal staat voor de interpretatie van peesaandoeningen en blessuremodelgedrag. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: .stl-bestand voor de klemhouders, het montagestation en de kamermallen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Plan van de rechter klemhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Plan van de linker klemhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Plattegrond van het montageplatform Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Plan van metalen klemmen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Afbeelding van celvrije hydrogelkrimp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: Afbeelding van een gedevitaliseerde kernexplantatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Over het algemeen heeft het hier gepresenteerde assemblagemodelsysteem verschillende kritieke stappen om te benadrukken. Ten eerste is het modelsysteem slechts zo goed als de kwaliteit van de componenten. Het is van vitaal belang om de kernexplantatie en de te zaaien celpopulaties onder de microscoop te controleren voordat het assemblageproces wordt gestart. Het is eveneens belangrijk om het fenotype van de geïsoleerde celpopulaties ten minste één keer te verifiëren met flowcytometrie. Vooral wanneer een nieuwe partij collageen-1 voor het eerst wordt gebruikt, is het voordelig om de verknopingssnelheid in een proefrun te controleren voordat er cellen in worden ingebed. De assemblage vereist veel handmatige handelingen, wat het risico op infecties verhoogt. Om het risico op infecties te minimaliseren, werkt u in een steriele bioveiligheidskap met laminaire luchtstroom, wisselt u de handschoenen vaak uit en ontsmet u de handschoenen en de werkruimte met 80% ethanol. Gebruik om vergelijkbare redenen de 3D-geprinte klemhouders niet meer dan één keer. Vóór het inbeddingsproces zelf is het belangrijk om alle hydrogelcomponenten (verknopingsoplossing, collageen-1-oplossing) op ijs te houden om voortijdige verknoping te voorkomen. Daarom moet men snel werken zodra de cellen aan de verknopingsoplossing zijn toegevoegd om de celdood te beperken als gevolg van de hoge pH en lage temperatuur van de verknopingsoplossing. Om uitdrogingsgerelateerde celdood in de kernexplantatie te voorkomen, moet het medium dat de vastgeklemde kernexplantaten bedekt, onmiddellijk opzuigen voordat de verknopingsoplossing wordt gemengd met de collageen-1-oplossing. Om de centrale plaatsing van de kernexplantatie in de hydrogel te garanderen, is het ideaal om de hydrogel rond een geklemde kernexplantatie te gieten die licht gespannen is. Gebruik hiervoor de paspen en de boutschroef M3 x 16 mm om de klemhouders te bevestigen aan een (3D-geprinte) platenset met gaten op de juiste lengtes. Na de polymerisatietijd van 50 minuten kan de ingebedde kernexplantatie opnieuw worden gedespannen, afhankelijk van de gewenste kweekomstandigheden. De hoeveelheid spanning die de assembloid ervaart tijdens het kweken heeft een grote invloed op de experimentele resultaten en moet uniform worden gehouden voor alle monsters en omstandigheden²¹.

Niettemin is de grote impact van mechanische (ont)belasting op experimentele uitkomsten een belangrijk voordeel van het assembloidmodel ten opzichte van de meeste weefselgemanipuleerde alternatieven, vooral omdat de gehandhaafde matrixsamenstelling van de kernexplantatie ook de complexe in vivo belastingspatronen op cellulair niveau⁹⁰ zou moeten nabootsen. Hoewel in de praktijk tot nu toe alleen de meting van de lineaire elastische modulus, de maximale trekspanning en de maximale trekspanning van assembloids is aangetoond, zijn elders protocollen voor vermoeiingssterkte en spanningsrelaxatiemetingen beschreven voor peeskernexplantaten en zouden deze van toepassing moeten zijn op de assembloids^91,92. Naast de in vivo-achtige laadpatronen is de modulariteit op meerdere niveaus van de assembloid waarschijnlijk het grootste voordeel. Dankzij de individuele kweekkamers kan voor elk monster afzonderlijk een controleerbare set nichecondities worden ingesteld (d.w.z. temperatuur, zuurstofspanning, glucoseconcentratie, suppletie, stimulatoren, remmers en statische rek met een plaat). Vervolgens zijn de matrixstijfheid en matrixsamenstelling van het extrinsieke compartiment aanpasbaar via de hydrogelsamenstelling en zouden ze bijvoorbeeld de impact van een steeds ziekere weefselmicro-omgeving kunnen bestuderen door meer collageen-3 en cellulair fibronectine 93,94,95 op te nemen. De beoordeelde celpopulaties in het extrinsieke compartiment zijn gemakkelijk aanpasbaar door te selecteren welke cellen moeten worden gezaaid, maar kunnen ook worden gemodificeerd in de explantatie van de peeskern door gebruik te maken van gevestigde genetisch gemodificeerde cellijnen en muislijnen (d.w.z. ScxLin-celdepletie)⁹⁶. De verschillende matrix en celsamenstelling van de twee compartimenten zorgt verder voor een unieke gecompartimenteerde 3D-structuur die een ander kenmerk van de centrale pees^{is 1,30,46}.

Bij het gebruik van dit systeem is het belangrijk om rekening te houden met de gevolgen van de modulariteit van het systeem voor de granulariteit van de uitkomstparameters. Hoewel celproliferatie en rekrutering voor elk compartiment afzonderlijk kunnen worden beoordeeld, zijn de mechanische eigenschappen, secretoomcomponenten en afbraakproducten momenteel alleen meetbaar voor de volledige assemblage. Wat de doorvoer betreft, kan één goed opgeleide persoon tot 50 assembloids op een normale werkdag bereiden, met als belangrijkste knelpunt de klemprocedure. Hoewel sommige van de uitleesmethoden elkaar uitsluiten, is het mogelijk om mechanische eigenschappen en secretoomcomponenten herhaaldelijk op hetzelfde monster te beoordelen, evenals de samenstelling van de celpopulatie (flowcytometrie), celtranscriptoom (RT-qPCR, RNA-sequencing) of matrix- en celdistributie (immunocytochemie/fluorescentiemicroscopie) op eindpunten. In eerdere publicaties zijn deze methoden ingezet om intercellulaire, cross-compartimentele interacties in kern // fibroblast en kern // macrofaagassemblages blootgesteld aan een laesie-achtige niche uitgebreid te karakteriseren^84,85. In dit werk is het vermogen van het assemblagemodelsysteem onderzocht om de cross-compartimentele wisselwerking tussen de kern en extrinsieke endotheelcellen onder verschillende micro-omgevingsstimuli te onderzoeken.

De modulariteit van het modelsysteem maakt toekomstige verfijning van de methode mogelijk, wat nodig is om de volgende beperkingen van de huidige ontwerpiteratie te overwinnen. De flowcytometrische analyse die in dit werk wordt gepresenteerd en de onlangs gepubliceerde single-cell RNA-sequencinggegevens onthulden dat de tenocyten die in de peeskern wonen en de van de achillespees afgeleide populaties heterogener zijn dan eerder werd aangenomen 24,34,59,84,97. Bovendien vervaagt het migratiegedrag van aanvankelijk in de kern of hydrogel aanwezige celpopulaties de compartimentering van assembloiden tijdens de kweek. Beide factoren samen maken het een uitdaging om transcriptomische verschillen toe te schrijven aan specifieke celtypen en om proliferatie- en migratiegebaseerde processen te scheiden. Deze beperking kan worden overwonnen door de inputpopulatie te verfijnen met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op basis van de cellulaire samenstelling van gezonde of zieke pezen die in recente in vivo studies zijn gekarakteriseerd, de uitlezing te verbeteren door single-cell RNA-sequencing te implementeren en proliferatiemarkers zoals een EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) kleuring tijdens microscopie te integreren.

De assembloids die hier worden gepresenteerd, hebben ook een zwak punt gemeen met de meeste momenteel beschikbare in-vitrosystemen die zieke organen simuleren die zijn losgekoppeld van de rest van het lichaam^98,99. Het op kweekkamers gebaseerde platform dat hier wordt gebruikt, positioneert het modelsysteem echter goed voor integratie in een multi-orgaanplatform waar assembloids die verschillende organen nabootsen, worden aangesloten en interacties tussen organen kunnen worden bestudeerd.

In de kern is het modelsysteem gebaseerd op positionele knaagdierpezen, wat resulteert in zijn eigen unieke reeks nadelen. Ten eerste wordt de vertaalbaarheid van de resultaten belemmerd door wildtype muizen die geen peesziekten ontwikkelen of eraan lijden ^8,100,101. Het integreren van weefsels en cellen van mensen of nieuw ontwikkelde muizenstammen die aspecten van peesaandoeningen vertonen, zou dit probleem kunnen verlichten¹⁰². De overstap naar een op mensen gebaseerde assemblage is bijzonder interessant, omdat het studies mogelijk zou maken met van patiënten afkomstige weefsels van verschillend zieke pezen (d.w.z. tendinitis, tendinose of peritendinitis) en zelfs therapieresistente donoren die meer gepersonaliseerde behandelingsprogramma's zouden kunnen ontgrendelen. Ten tweede zijn explantaten van muizenstaartpees niet bijzonder goed bestand tegen door overbelasting veroorzaakte microschade, wat de toepasbaarheid van het modelsysteem voor de studie van acute peesschade beperkt.

Om al deze redenen bevinden explantatie// hydrogel-assembloids zich in een uitstekende positie om de biologie van peeskernen, matrixstructuur-functie-interacties en cross-compartimentele interacties tussen specifieke celpopulaties te bestuderen als reactie op niche-geïnduceerde microschade. Inzichten uit deze vrij high-throughput studies kunnen richting geven aan in vivo onderzoek en de ontwikkeling van behandelingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.4 mm x 25 mm injectienaald (G27)	Sterican	9186174
3D printfilament: Heldere polymelkzuur prusament	Prusa	NA
4% formaldehyde	Roti-Histofix	P087.4
Accutase celdetacheringsoplossing	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amphotericine	VWR	L0009-100
Aankoppelbare digitale C-mount camera: Moticam 2	Motic	NA
Boulonschroef M3 x 16 mm, roestvrij staal	RS PRO	1871235
Boulonschroef M3 x 6 mm, roestvrij staal	RS PRO	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 antilichaam: PE anti-muis	BioLegend	134703
CD206 antilichaam: Alexa Fluor 488 anti-muis	BioLegend	141709
CD31 antilichaam: Alexa Fluor 488 anti-muis	BioLegend	102413
CD86 antilichaam: PE anti-muis	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Gedialyseerde foetaal bovien serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Plooischroef, 3 mm x 16 mm, roestvrij staal	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 siliconen	KauPO	09301-004-000001
Endopan 3 Kit	Pan-Biotech	P04-0010K
Endothelecelgroeisuplement	Lonza	CC-3162
Eppendorf safe-lock kunststof buizen (1,5 mL)	Eppendorf	30121023
Ethidium homodimeer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 antilichaam: Apc/fire 750 anti-muis	BioLegend	123151
Falcon kunststof buis (15 mL)	Corning	352096
Falcon kunststof buis (50 mL)	Corning	352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Gelatine	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkalisch reinigingsconcentraat	Sigma	Z805939-1EA
Heparine	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Hydroxyproline assay	Sigma-Aldrich	MAK008
Beeldanalyse software: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
L-Ascorbinezuurfosfaatmagnesiumzout n-Hydraat	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM niet-essentiële aminozuren	Sigma	7002231
Muis macrofaag-stimulerende factor (m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
MSD assay	Mesoscale Discovery	various
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nylon gaas zeefdop, 100 µm	Corning	734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer	Prusa	i3 MK3S
Penicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), ph 7.4, steriel, 10 L	Gibco	10010001
Puromycine	Gibco	A1113803
RBC lysis buffer	VWR	786-650
Recombinant m-CSF	PeproTech	315-02
RNA extractiekit: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Slicing software: PrusaSlicer	Prusa	NA	Versie 2.6.0 of hoger
Sterile celzeef 100 µm	Fisherbrand	22363549
Chirurgisch scalpelmes nr. 21	Swann-Morton	307
Trizol reagens	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsine-EDTA (0,5 %)	Gibco	15400054