Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar transgenexpressie met hoge doorvoer mogelijk maken met behulp van geautomatiseerde vloeistofbehandeling voor geëtioleerde maïsbladprotoplasten

968 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65989

⸱

16 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Syngenta Crop Protection, LLC

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de totstandbrenging van een gerandomiseerde transfectielay-out met behulp van een geautomatiseerde vloeibare verwerker, een protoplastisolatieprotocol voor geëtioleerd maïsblad en een transfectieprocedure met 96 putjes met behulp van een vloeibare verwerker.

Samenvatting

Op het gebied van plantenbiotechnologie is de afgelopen jaren opmerkelijke vooruitgang geboekt, waardoor een revolutie teweeg is gebracht in het vermogen om planten voor verschillende doeleinden te manipuleren en te manipuleren. Naarmate het onderzoek op dit gebied echter in diversiteit toeneemt en steeds geavanceerder wordt, wordt de behoefte aan vroege, efficiënte, betrouwbare en high-throughput transiënte screeningoplossingen om strategieën te verfijnen die tot stabiele transformatie leiden, duidelijker. Één methode die in recente jaren opnieuw is opgedoken is het gebruik van installatieprotoplast, waarvoor de methoden van isolatie en transfectie in talrijke soorten, weefsels, en ontwikkelingsstadia beschikbaar zijn. Dit werk beschrijft een eenvoudig geautomatiseerd protocol voor de gerandomiseerde bereiding van plasmide in een plaat met 96 putjes, een methode voor de isolatie van geëtioleerd maïsbladprotoplast en een geautomatiseerde transfectieprocedure. De toepassing van geautomatiseerde oplossingen in de plantenbiotechnologie, geïllustreerd door deze nieuwe protocollen voor vloeistofbehandeling voor de transfectie van plantenprotoplast, vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van handmatige methoden. Door gebruik te maken van automatisering kunnen onderzoekers gemakkelijk de beperkingen van traditionele methoden overwinnen, de efficiëntie verbeteren en de wetenschappelijke vooruitgang versnellen.

Inleiding

De transfectie van de protoplast van de installatie, de introductie van vreemd genetisch materiaal in plantaardige cellen die van celwanden worden ontdaan, is een cruciale techniek en omvat in de laatste halve eeuw talrijke soorten ter ondersteuning van het onderzoek naar plantenbiotechnologie. Het gebruik van deze methoden kan echter pijnlijk en beperkt in omvang zijn, zelfs met miljoenen protoplasten die per isolatie worden geproduceerd. De traditionele methodes van de transfectie van installatieprotoplast zijn vaak arbeidsintensief, tijdrovend, vatbaar voor variabiliteit, en technisch veeleisend, leidend tot nichesystemen met lage reproduceerbaarheid1. Het potentieel dat de afgelopen jaren door geautomatiseerde oplossingen is geïntroduceerd, verlicht echter de mogelijkheid om deze 60-jarige jonge techniek nieuw leven in te blazen 2,3. Met het potentieel van het automatiseren van cruciale maar repetitieve stappen zoals materiaalvoorbereiding, poly-ethyleenglycol (PEG) incubatie en daaropvolgende afgifte van transfectiereagens, kunnen onderzoekers de fysieke behandelingsvereisten en andere potentiële bronnen van menselijke fouten aanzienlijk verminderen4. Bovendien zorgen de nauwkeurige controle en uniformiteit die worden geboden door geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen voor consistente en reproduceerbare transfectieresultaten.

Terwijl de protoplastisolatie een nauwgezet proces is dat het hakken, de vertering, de incubatie, de filtratie, en de centrifugatie impliceert, is het transfectiegedeelte van deze protocollen op maat gemaakt voor geautomatiseerde vloeibare handlers. De procedure voor de meeste protocollen van de protoplasttransfectie is PEG-gemedieerd, en het mengen van de geïsoleerde protoplast in de aanwezigheid van PEG en gezuiverd plasmide-DNA voor een bepaalde duur bij een precieze concentratie (afhankelijk van de soort en het weefsel) laat deze cellen toe om het plasmide-DNA op te nemen5. Deze transfectie wordt gevolgd door een reeks wasstappen, die culmineren in een nachtelijke incubatie6. Na de incubatietijd, als alles goed is ontworpen en geleverd, resulteert het experiment in de uitdrukking van de component van interesse en/of het potentieel van het evalueren van verschillende regulerende componenten7. Alle aspiratie-, doseer- en roer-/mengstappen die bij deze procedure horen, worden normaal gesproken afgehandeld door een handmatige pipet. Het met de hand uitvoeren van een dergelijk protocol, één individuele reactie per keer, is arbeidsintensief en introduceert onnodige variatie tussen monsters, terwijl ook de capaciteit wordt beperkt die op een bepaald moment kan worden geëvalueerd. Geautomatiseerde protocollen voor de manipulatie van zoogdier- of insectencellen en chemische synthese in de farmaceutische industrie zijn al enkele jaren in de praktijk 4,8,9. Het gebruik van protoplast en protocollen met betrekking tot de geautomatiseerde behandeling van vloeibare stoffen van plantaardig materiaal zijn in opkomst 10,11,12,13.

De goedkeuring van geautomatiseerde vloeistofbehandelingsprotocollen voor de transfectie van plantprotoplast is veelbelovend voor onderzoekstoepassingen. Onderzoekers kunnen grotere genetische bibliotheken verkennen, in een versneld tempo screenen op specifieke genfuncties en complexe genetische interacties met betrekking tot plantenstress uitgebreider onderzoeken14. De schaalbaarheid van geautomatiseerde benaderingen waarbij gebruik wordt gemaakt van pods met 96 putjes in combinatie met fluorescentiescreening maakt experimenten met hoge doorvoer mogelijk en stelt wetenschappers in staat snel gegevens en inzichten te genereren die de vooruitgang in de plantenbiotechnologie kunnen stimuleren11. Met deze toename van de doorvoer, die leidt tot het genereren van honderden, zo niet duizenden datapunten, moet er echter een aanvullende kwaliteitscontrole zijn die rekening houdt met eventuele bronnen van fouten die de resultaten kunnen verwarren15. Een element dat in tal van wetenschappelijke disciplines is geïdentificeerd als een bijdragende factor, is het randeffect. Sommige mitigerende strategieën zullen de beste plaat voorstellen om te gebruiken of de ruimte tussen de putten of de buitenste putten met water te vullen om dit fenomeen te bestrijden16,17. Deze strategieën voegen echter tijd toe, en als een specifiek wegwerpartikel niet beschikbaar is, is de enige optie om genoegen te nemen met minder of uit te stellen. Als alternatief is het kijken naar strategieën die dit effect verklaren via een blokkeringsschema geen concessie aan doorvoer of vertraging van de uitvoering.

Dit geëtioleerde protocol voor protoplast van maïsbladeren en de twee geautomatiseerde methoden die in Figuur 1 worden geïllustreerd, proberen de variabiliteit aan te pakken die inherent is aan protoplastexperimenten door meerdere delen van de canonieke protoplastmethode te automatiseren, de toewijzing van plasmidemateriaal aan het vat dat wordt gebruikt voor transfectie, en de transfectie zelf. Deze methoden worden gedemonstreerd voor het geëtioleerde protoplastplatform van maïsbladeren, aangezien het een goed gekarakteriseerd, eenvoudig en efficiënt protoplastplatform is. Alle stappen die binnen worden beschreven, zijn onmiddellijk toegankelijk voor de protocollen van de protoplasttransfectie, die gelijkaardige of de zelfde bufferoplossingen gebruiken. Alvorens deze technieken worden toegepast, moet echter speciale aandacht worden besteed aan de unieke kenmerken van het weefsel en de soort van de protoplastbron. Deze verbeteringen door automatisering vereenvoudigen de voorbereiding van materiaal voor individuele experimenten en verbeteren de doorvoer aanzienlijk, van één-voor-één sequentiële transfectie tot 96 gelijktijdig behandelde transfecties. Dit werk zal ook rechtvaardiging aantonen voor het gebruik van gerandomiseerde onvolledige blokken om rekening te houden met positionele vertekening van de plaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. De totstandbrenging van de transfectieplaat

  1. Lay-out van het dek maken: Om een randomisatiemethode voor DNA-platen te maken, opent u de software voor vloeistofverhandeling. Klik op de knop Nieuwe methode in de menubalk om een nieuwe methode te maken. Voeg de regel Instrumentinstelling toe tussen de regels Start en Finish door op de knop Instrumentinstelling op het linkerdeelvenster te drukken.
    OPMERKING: Relevante schermafbeeldingen die samen met dit geautomatiseerde protocol volgen, zijn te vinden in Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Afbeelding 2 en Aanvullende Afbeelding 3.
  2. Klik op de regel Instrumentinstelling , zoek het juiste labware in het categoriemenu van Labware en sleep ze naar de deklay-out zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 1.
    NOTITIE: Als het laboratoriummateriaal nog niet eerder is gedefinieerd, moet het volgens de specificaties van de fabrikant in de vloeistofverwerker worden geprogrammeerd, maar dergelijke instructies vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol.
  3. Overdracht van bestandsinstelling: Druk op de knop Overdracht van bestand op de stappenpaletten en plaats de regel Overdracht van bestand onder de regel Instrumentinstelling. Zorg ervoor dat de keuze en vervanging van de punt zijn zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 3.
  4. Controleer of Bestand een veldnamenrij heeft en controleer of de kolominformatie correct is.
  5. Druk op het brongebied om het te activeren en klik op de bronplaat in de lay-out van het dek, definieer de doelplaat en voer de hoeveelheid DNA in die moet worden gepipetteerd.
  6. Druk op de knop Aanpassen om de pipetteertechniek in detail te definiëren, zoals het aanraken van de tip op de muur.
  7. Specificeer de hoeveelheid plasmide-DNA die moet worden overgedragen. Dit protocol gebruikt 20 μL van 1 μg/μL plasmide-DNA per transfectie (put).
    OPMERKING: de hoeveelheid plasmide-DNA die naar de transfectieplaat vóór de protoplasttransfectie wordt overgebracht, zal afhangen van het protoplastplatform dat wordt gebruikt.
  8. Maak een overdracht van bestand .csv document.
    1. Dit document bestaat uit twee kolommen. Bereid de eerste kolom voor, d.w.z. de kolom Van, die de locatie van het voorraadplasmide-DNA in het buizenrek aangeeft, d.w.z. voor monster 1; dit zou goed zijn A01. Aangezien deze overdracht drie keer plaatsvindt (drie herhalingen), moeten drie rijen A01 aanduiden in de kolom Van.
    2. Bereid de tweede kolom voor, d.w.z. Naar kolom, die wordt gebruikt om de bestemmingsput van de plasmideconstructie van de plaat met 96 putjes te specificeren. Monster 1 (A01) kan bijvoorbeeld B02, D04 en H07 zijn. Sla dit op als een .csv bestand om compatibel te zijn met de liquid handler-software.
  9. Voordat u het protocol uitvoert, controleert u of de dekposities zijn geladen, of het laboratoriummateriaal correct is gedefinieerd, het randomisatiedocument putlocaties bevat voor al het monster-DNA in het buizenrek en of er voldoende plasmidemonster in de buizen is om het protocol uit te voeren.
  10. Vouw het menu Bestandseigenschappen van de stap Overdracht uit bestand uit, selecteer het .csv bestand dat is gemaakt en voer het protocol uit.
  11. Bedek transfectieplaten met een aluminiumfoliezegel wanneer het protocol met succes is voltooid. Bewaar transfectieplaten bij -20 °C tot ze klaar zijn voor gebruik. De geïsoleerde geëtioleerde maïsbladprotoplast wordt in stap 3.3 aan deze transfectieplaat toegevoegd.

2. Geëtioleerde isolatie van protoplast van maïsbladeren

  1. Om te beginnen met de isolatie van geëtioleerde maïsbladprotoplast, moet een protoplast-compatibele genetische achtergrond worden verkregen, zoals NP222 die hier werd gebruikt18. Bereid slechts 3 buffers voor, namelijk MMg-, W5- en WI-buffers, vermeld in tabel 1 voor het begin van het experiment en houd deze op 4 °C. Bereid de spijsverteringsoplossing en PEG op de dag van het experiment voor de beste resultaten.
  2. Oppervlak steriliseren 25 zaden door ze eerst onder te dompelen in een 25% commerciële bleekoplossing en ze ongeveer 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur op een roterende platformschudder te schudden.
  3. Spoel de zaden na het roeren grondig af met steriel water (DI). Herhaal de spoelstap 5x. Drink de zaden een nacht in steriel water bij kamertemperatuur.
  4. Zaai het zaad de volgende dag op vochtige, geautoclaveerde grond. Voeg droge kleikorrels toe om overtollig vocht uit de grond af te voeren om schimmelbesmetting te voorkomen.
  5. Kweek de maïszaailingen in een 16 uur durende lichte groeikamer bij 28 °C (relatieve vochtigheid (RV) van 30%) gedurende ongeveer 3 dagen totdat het coleoptiel 1-2 cm boven de grond is en breng ze vervolgens over naar een donkere kamer met dezelfde temperatuur en RV gedurende nog eens 5 - 7 dagen.
  6. Oogst het eerste echte bladweefsel door het net boven de eerste kraag af te knippen.
  7. Oppervlak steriliseer het bladweefsel kort in 25% handelsbleekmiddel en 250 μL 20% Tween 20-oplossing gedurende 1 minuut. Spoel het bladmateriaal 5x grondig af met gedemineraliseerd water.
  8. Dep het maïsbladweefsel (voorzichtig) droog met pluisvrije tissues en verwijder met een scherp mes ~1,5 cm van zowel de punt als de basis van elk bladblad.
  9. Snijd het resterende bladweefsel in smalle (0,5 mm - 1 mm) dwarsstroken en plaats deze in een petrischaaltje van 100 x 25 mm.
  10. Filtreer en steriliseer 25 ml van de digestieoplossing door een spuitfilter van 0,22 μm rechtstreeks in het petrischaaltje met het gesneden weefsel.
  11. Infiltreer het bladweefsel vacuüm met digestieoplossing door gedurende 30 minuten vacuüm toe te passen bij kamertemperatuur in een vacuümexsiccator bij een druk van ongeveer -75 mbar.
    OPMERKING: De vacuümdruk in huis voor tal van academische en particuliere laboratoria zou voldoende moeten zijn voor deze stap.
  12. Plaats op een roterende platformschudder en schud op 25 °C in het donker bij 60 RPM gedurende 2,5 tot 3 uur. Als er nog 10 minuten over zijn tot het einde van de spijsverteringsperiode, verhoog dan de snelheid tot 90 RPM.
  13. Giet de digestieoplossing en al het onverteerde plantmateriaal door een trechter bovenop een zeeffilter van 40 μm in een buis van 50 ml.
  14. Centrifugeer de oplossing in de buis van 50 ml bij 150 x g gedurende 4 minuten om de protoplast te pelleteren. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 10 - 15 ml MMg Buffer-oplossing.
  15. Herhaal de centrifugatie en verwijder de supernatant. Resuspendeer in een verse MMg-buffer van 5 - 10 ml.
  16. Meet met een hemocytometer zorgvuldig de dichtheid van de geïsoleerde protoplast. Resuspendeer tot een dichtheid van ongeveer 5 x 105 protoplasten per ml.
  17. Laat het isolaat ~30 minuten op ijs rusten voorafgaand aan de transfectie. Bereid gedurende deze tijd de PEG-oplossing voor. Los PEG volledig op in een oplossing met behulp van een waterbad van 37 °C en laat het daar staan tot transfectie.

3. Geautomatiseerde protoplasttransfectie

OPMERKING: Stappen 3.6 tot en met 3.15 worden volledig beheerd door de geautomatiseerde vloeistofbehandelingsler, met uitzondering van de twee gebruikerspauzes bij stap 3.10 en 3.13, die handmatige centrifugatie vereisen. Relevante schermafbeeldingen die samen met dit geautomatiseerde protocol volgen, zijn te vinden in het supplement, Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Figuur 3, Aanvullende Figuur 4 en Aanvullende Figuur 5.

  1. Bereid de deklay-out van de vloeibare handler voor transfectie voor volgens de protoplasttransfectiemethode die in de volgende stappen wordt beschreven. Monteer de volgende materialen: Bestemmingsplaat (in dit geval een zwarte plaat met 96 putjes met een doorzichtige microplaat aan de onderkant voor fluorescentiemeting), een doos met automatiseringstips met brede boring van 25 - 250 μl voor de PEG-aspiratiestap, vijf dozen met 25 - 250 μL pipetautomatiseringstips voor de resterende vloeistofbehandelingsstappen, drie plastic troggen als reagensreservoirs, een lege plaat met 96 putjes voor afvalinzameling, resterende wasoplossingen voor transfectiebuffers, W5 en WI.
  2. Onmiddellijk voordat de transfectieprocedure begint, steriliseert de filter de PEG-oplossing door een 0,22 μm steriele wegwerpvacuümfiltereenheid in een verse buis van 50 ml.
  3. Van de protoplast die in MMg-buffer is geresuspendeerd, voegt u 100 μL (ongeveer 50.000 protoplast) toe aan elk putje van de voorbereide, ontdooide transfectieplaat. Giet hiervoor de protoplastbevattende bufferoplossing in een steriele trog van 10 ml en gebruik een meerkanaalspipet. Blijf de trog voorzichtig roeren om te voorkomen dat de protoplast tijdens deze handmatige overdrachtsstap uit de oplossing bezinkt.
  4. Giet de PEG-oplossing in de aangewezen trog en leg de transfectieplaat neer, die nu protoplast en plasmide-DNA bevat die transfectieplaat bevat, bereid met behulp van stap 1, op de gespecificeerde locatie volgens de deklay-out.
  5. Om een protoplasttransfectiemethode tot stand te brengen, opent u de software van de vloeibare handler en voert u de hieronder beschreven stappen uit.
    1. Labware tussen decks verplaatsen: Vervang de lege tipbox op de tiplaadvloer door een nieuwe met behulp van de opdracht Labware verplaatsen. Selecteer de decks Van en Naar in de configuratieweergave .
    2. Voor volumes van meer dan 200 μL: Vervang de tips niet tussen de transfers. Laad tips voor de eerste overdrachtsstap en ontlaad na de laatste overdrachtsstap, waarvoor de opties voor laden/lossen correct moeten worden gespecificeerd voor elke overdrachtsstap, zoals in aanvullende afbeelding 3.
  6. De totstandbrenging van de deklay-out: Net als de methode voor het maken van transfectieplaten, om een DNA geautomatiseerde transfectiemethode te creëren, opent u de software voor vloeistofverwerkers. Klik op de knop Nieuwe methode in de menubalk om een nieuwe methode te maken. Voeg de regel Instrumentinstelling toe tussen de start- en eindlijn door op de knop Instrumentinstelling in het linkerdeelvenster te drukken. Maak een deklay-out volgens de deklay-out die wordt weergegeven in aanvullende afbeelding 1.
  7. Cel/DNA-menging: Voeg een stap toe om protoplast en DNA te mengen voordat PEG wordt toegevoegd met behulp van de Device Action-knop en het instellen van het apparaat (shakeing automated labware positioner of ALP), schudsnelheid (1500 rpm) en tijd om te schudden (10 s).
  8. PEG toevoeging en het mengen: Om de transfectie te initiëren, voegt een stap van de Overdracht toe om 110 μL PEG van PEG-reservoir toe te voegen gebruikend een pipet van 96 peulen. Zorg ervoor dat de juiste bron- en bestemmingsposities zijn geprogrammeerd volgens de gespecificeerde lay-out van het dek. Programmeer de overdrachtsstap om PEG op 1 mm van de bodem van het reservoir aan te zuigen en deponeer de PEG op 3 mm van de bodem van de plaat met 96 putjes die het protoplast/DNA-mengsel bevat. Voeg nog een schudstap toe na het toevoegen van PEG door de eerder geprogrammeerde stappen te kopiëren en te plakken.
  9. PEG-incubatie: Voeg een pauzestap toe door de pauzeknop te selecteren, selecteer de shaker en voer de vooraf bepaalde incubatietijd in, die begint met PEG-toevoeging.
    OPMERKING: De timer voor de pauze loopt door, tenzij er onderbrekingen of verstoringen van het lichtgordijn zijn die kunnen leiden tot een foutmelding. Zorg ervoor dat als manipulatie van het kaartspel nodig is, deze berichten worden gewist voordat u wegloopt.
  10. W5-buffer toevoeging/menging: Voeg drie lijnen van Overdracht van 200 μL toe om een totaal van 600 μL W5-buffer over te brengen naar de transfectieplaat om de PEG-incubatiereactie te doven. Volg de W5-buffertoevoeging door te schudden en een gebruikerspauze in te stellen om centrifugatie van de transfectieplaat mogelijk te maken.
  11. Gebruikerspauze 1: Centrifugeer de protoplasttransfectieplaat op 100 x g gedurende 4 minuten. Breng de transfectieplaat, nu met gepelleteerd protoplast, terug naar de juiste dekpositie. Voeg gebruikerspauze toe door op de knop Pauzeren te klikken, behalve nu met de optie Het hele systeem pauzeren en de berichtoptie weergeven .
    OPMERKING: De pop-up met het pauzebericht moet worden gewist voordat de vloeistofhandler verder gaat met de rest van het protocol.
  12. Verwijdering van supernatant: Voeg twee lijnen Transfer toe om 400 μL supernatans te verwijderen en over te brengen naar de afvalplaat. Om celaspiratie tijdens het verwijderen van het bovenstaande te voorkomen, stelt u de afstand vanaf de bodem in op 6 mm.
  13. WI toevoeging/menging Voeg 3 lijnen van Transfer toe om 580 μL WI-buffer over te brengen naar de transfectieplaat. Voeg nog een schudstap toe na WI-toevoeging door de eerder geprogrammeerde stappen te kopiëren en te plakken. Ga verder met de volgende gebruikerspauze.
  14. Pauze 2 van de gebruiker: Centrifugeer de protoplasttransfectieplaat op 100 x g gedurende 4 min. Breng de transfectieplaat, nu met gepelleteerd protoplast, terug naar de juiste dekpositie.
  15. Verwijdering van supernatant: Voeg vier transferlijnen toe om 680 μL supernatans te verwijderen en over te brengen naar de afvalplaat. Om celaspiratie tijdens het verwijderen van het bovenstaande te voorkomen, stelt u de afstand vanaf de bodem in op 6 mm.
  16. Overdracht van protoplasten naar microplaat: De uiteindelijke overdracht van dit protocol bestaat uit twee overdrachtsstappen van 150 μL. Vóór elke afzonderlijke stap worden protoplasten herhaaldelijk aangezogen met 50 μl/s op 2 mm vanaf de bodem van de transfectieplaat en gedoseerd bij 3 mm. Breng vervolgens, met behulp van dezelfde pipetpunten, over naar de microplaat van de bestemming.
    OPMERKING: Het aanzuigen en doseren van buffervolume boven de korrel voorafgaand aan overdracht naar de microplaat zal alle resterende protoplasten verstoren die op de bodem van de transfectieplaat zijn gepelleteerd om ervoor te zorgen dat er geen monsterverlies is. Aangezien randomisatie werd uitgevoerd tijdens de creatie van de transfectieplaat, concludeert dit het geautomatiseerde protocol.
  17. Incubeer de microtiterplaat 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur in het donker vóór de eerste fluorescentiemeting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om observationele gegevens te verkrijgen die ondersteunen dat randeffecten de responsmetingen kunnen beïnvloeden; Een pilotstudie werd uitgevoerd om die vermoedens te bevestigen. Voor deze studie werden de bovenstaande methoden toegepast op drie replicatie van 96-putjes platen met slechts één behandelingsniveau; alle protoplasten werden getransfecteerd met behulp van pSYN1125019, een plasmide dat ZsGreen constitutief tot expressie brengt, met als doel aan te tonen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het automatiseren van de creatie van transfectieplaten en de isolatie van geëtioleerde maïsbladprotoplast met een geautomatiseerde transfectie. Voor de succesvolle voltooiing van het gedeelte van de vertaling van de plaatverwezenlijking van het protocol, vereist het een geautomatiseerde robot voor vloeistofbehandeling die is uitgerust met een 8-kanaals pod. Voor het transfectieprotocol, wordt een pod met 96 putjes aanbevolen voor volledige en u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs zijn in dienst van Syngenta, een internationaal landbouwbiotechnologiebedrijf, dat routinematig transformatietechnologie gebruikt voor het genereren van transgene (GM) eigenschapsproducten.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de vele wetenschappers van Syngenta bedanken die dit werk en ons team dagelijks ondersteunen. Speciale erkenning moet worden gegeven aan de familie en vrienden wier vaak onzichtbare steun cruciaal is voor het voortdurende succes van het Transient Assay Team.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(2)β-mercaptoethanol SigmaM6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateSigma69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterileFisher22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS.4mL WellFisher12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide BoreFisher14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, rackedFisher14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum DesiccatorsFisher08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm Fisher13-374-16
Biomek FXPBeckman Coulter902508
Calcium chloride dihydrateSigmaC5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer Fisher50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, ConcentratedFisherNC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standardFisher07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
D-Mannitol SigmaM9546
Fisherbrand 60mL Plastic SyringeFisher14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40umFisher22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325FisherFB0875711
Magnesium chloride hexahydrateSigmaM2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES.22umFisherSLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45umFisherSLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PESFisherSCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000 Sigma81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix Wyatt QuarlesGP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back.009RDFisher12-640
Research Products International Corp Cellulase RSFisher50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10Fisher50-213-444
Sodium chlorideSigmaS7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested Hummert11635000
Tween-20 SigmaP1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plugVWR97058-164

Referenties

  1. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Prog Mol Biol Transl Sci. 149, 1-26 (2017).
  2. Torres-Acosta, M. A., Lye, G. J., Dikicioglu, D. Automated liquid-handling operations for robust, resilient, and efficient bio-based laboratory practices. Biochem Eng J. 188, 108713(2022).
  3. Cocking, E. C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
  4. Genzen, J. R., et al. Challenges and opportunities in implementing total laboratory automation. Clin. Chem. 64 (2), 259-264 (2018).
  5. Reed, K. M., Bargmann, B. O. R. Protoplast regeneration and its use in new plant breeding technologies. Front Genome Ed. 3, 734951(2021).
  6. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  7. Yang, Y., et al. Synthetic promoter screening using Poplar mesophyll protoplast transformation. Bio Protoc. 13 (8), e4660(2023).
  8. Estes, S., Melville, M. Mammalian cell line developments in speed and efficiency. AdvBiochem Eng Biotechnol. 139, 11-33 (2014).
  9. Possee, R. D., et al. Generation of baculovirus vectors for the high-throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1115-1122 (2008).
  10. Xu, Y., et al. Protoplasts: small cells with big roles in plant biology. Trends Plant Sci. 27 (8), 828-829 (2022).
  11. Rigoulot, S. B., et al. Automated, high-throughput protoplast transfection for gene editing and transgene expression studies. Methods Mol Biol. 2653, 129-149 (2023).
  12. Occhialini, A., et al. High-throughput transfection and analysis of Soybean (Glycine max) protoplasts. Methods Mol Biol. 2464, 245-259 (2022).
  13. Lenaghan, S. C., Stewart, C. N. Jr An automated protoplast transformation system. Methods Mol Biol. 1917, 355-363 (2018).
  14. Gilliard, G., et al. Protoplast: A valuable toolbox to investigate plant stress perception and response. Front Plant Sci. 12, 749581(2021).
  15. Marx, V. Plants: A toolbox of cell-asbed assays. Nat. Methods. 13, 551-554 (2016).
  16. Mansoury, M., et al. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  17. Maxwell, C. B., et al. The edge effect in high-throughput proteomics: A cautionary tale. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (6), 1065-1072 (2023).
  18. Zhong, H., et al. Advances in Agrobacterium-mediated maize transformation. Methods Mol Biol. 1676, 41-59 (2018).
  19. Wenck, A., et al. Reef-coral proteins as visual, non-destructive reporters for plant transformation. Plant Cell Rep. 22 (4), 244-251 (2003).
  20. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jian, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physiol Plant. 36, 1271-1281 (2014).
  21. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149 (3), 1231-1239 (2009).
  22. Coy, M. R., Abbitt, S. E., Frank, M. J. Protoplast isolation and transfection in Maize. Methods Mol Biol. 2464, 91-104 (2022).
  23. Jessop-Fabre, M. M., Sonnenschein, N. Improving Reproducibility in Synthetic Biology. Front Bioeng Biotechnol. 7 (18), (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

High-throughputscreeningisolatie van protoplastentransfectie van protoplastenplantbiotechnologie96-wells plaattransiënte expressieplasmidepreparatie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.