Onderzoek naar transgenexpressie met hoge doorvoer mogelijk maken met behulp van geautomatiseerde vloeistofbehandeling voor geëtioleerde maïsbladprotoplasten

Summary

Dit protocol beschrijft de totstandbrenging van een gerandomiseerde transfectielay-out met behulp van een geautomatiseerde vloeibare verwerker, een protoplastisolatieprotocol voor geëtioleerd maïsblad en een transfectieprocedure met 96 putjes met behulp van een vloeibare verwerker.

Abstract

Op het gebied van plantenbiotechnologie is de afgelopen jaren opmerkelijke vooruitgang geboekt, waardoor een revolutie teweeg is gebracht in het vermogen om planten voor verschillende doeleinden te manipuleren en te manipuleren. Naarmate het onderzoek op dit gebied echter in diversiteit toeneemt en steeds geavanceerder wordt, wordt de behoefte aan vroege, efficiënte, betrouwbare en high-throughput transiënte screeningoplossingen om strategieën te verfijnen die tot stabiele transformatie leiden, duidelijker. Één methode die in recente jaren opnieuw is opgedoken is het gebruik van installatieprotoplast, waarvoor de methoden van isolatie en transfectie in talrijke soorten, weefsels, en ontwikkelingsstadia beschikbaar zijn. Dit werk beschrijft een eenvoudig geautomatiseerd protocol voor de gerandomiseerde bereiding van plasmide in een plaat met 96 putjes, een methode voor de isolatie van geëtioleerd maïsbladprotoplast en een geautomatiseerde transfectieprocedure. De toepassing van geautomatiseerde oplossingen in de plantenbiotechnologie, geïllustreerd door deze nieuwe protocollen voor vloeistofbehandeling voor de transfectie van plantenprotoplast, vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van handmatige methoden. Door gebruik te maken van automatisering kunnen onderzoekers gemakkelijk de beperkingen van traditionele methoden overwinnen, de efficiëntie verbeteren en de wetenschappelijke vooruitgang versnellen.

Introduction

De transfectie van de protoplast van de installatie, de introductie van vreemd genetisch materiaal in plantaardige cellen die van celwanden worden ontdaan, is een cruciale techniek en omvat in de laatste halve eeuw talrijke soorten ter ondersteuning van het onderzoek naar plantenbiotechnologie. Het gebruik van deze methoden kan echter pijnlijk en beperkt in omvang zijn, zelfs met miljoenen protoplasten die per isolatie worden geproduceerd. De traditionele methodes van de transfectie van installatieprotoplast zijn vaak arbeidsintensief, tijdrovend, vatbaar voor variabiliteit, en technisch veeleisend, leidend tot nichesystemen met lage reproduceerbaarheid¹. Het potentieel dat de afgelopen jaren door geautomatiseerde oplossingen is geïntroduceerd, verlicht echter de mogelijkheid om deze 60-jarige jonge techniek nieuw leven in te blazen ^2,3. Met het potentieel van het automatiseren van cruciale maar repetitieve stappen zoals materiaalvoorbereiding, poly-ethyleenglycol (PEG) incubatie en daaropvolgende afgifte van transfectiereagens, kunnen onderzoekers de fysieke behandelingsvereisten en andere potentiële bronnen van menselijke fouten aanzienlijk verminderen⁴. Bovendien zorgen de nauwkeurige controle en uniformiteit die worden geboden door geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen voor consistente en reproduceerbare transfectieresultaten.

Terwijl de protoplastisolatie een nauwgezet proces is dat het hakken, de vertering, de incubatie, de filtratie, en de centrifugatie impliceert, is het transfectiegedeelte van deze protocollen op maat gemaakt voor geautomatiseerde vloeibare handlers. De procedure voor de meeste protocollen van de protoplasttransfectie is PEG-gemedieerd, en het mengen van de geïsoleerde protoplast in de aanwezigheid van PEG en gezuiverd plasmide-DNA voor een bepaalde duur bij een precieze concentratie (afhankelijk van de soort en het weefsel) laat deze cellen toe om het plasmide-DNA op te nemen⁵. Deze transfectie wordt gevolgd door een reeks wasstappen, die culmineren in een nachtelijke incubatie⁶. Na de incubatietijd, als alles goed is ontworpen en geleverd, resulteert het experiment in de uitdrukking van de component van interesse en/of het potentieel van het evalueren van verschillende regulerende componenten⁷. Alle aspiratie-, doseer- en roer-/mengstappen die bij deze procedure horen, worden normaal gesproken afgehandeld door een handmatige pipet. Het met de hand uitvoeren van een dergelijk protocol, één individuele reactie per keer, is arbeidsintensief en introduceert onnodige variatie tussen monsters, terwijl ook de capaciteit wordt beperkt die op een bepaald moment kan worden geëvalueerd. Geautomatiseerde protocollen voor de manipulatie van zoogdier- of insectencellen en chemische synthese in de farmaceutische industrie zijn al enkele jaren in de praktijk ^4,8,9. Het gebruik van protoplast en protocollen met betrekking tot de geautomatiseerde behandeling van vloeibare stoffen van plantaardig materiaal zijn in opkomst 10,11,12,13.

De goedkeuring van geautomatiseerde vloeistofbehandelingsprotocollen voor de transfectie van plantprotoplast is veelbelovend voor onderzoekstoepassingen. Onderzoekers kunnen grotere genetische bibliotheken verkennen, in een versneld tempo screenen op specifieke genfuncties en complexe genetische interacties met betrekking tot plantenstress uitgebreider onderzoeken¹⁴. De schaalbaarheid van geautomatiseerde benaderingen waarbij gebruik wordt gemaakt van pods met 96 putjes in combinatie met fluorescentiescreening maakt experimenten met hoge doorvoer mogelijk en stelt wetenschappers in staat snel gegevens en inzichten te genereren die de vooruitgang in de plantenbiotechnologie kunnen stimuleren¹¹. Met deze toename van de doorvoer, die leidt tot het genereren van honderden, zo niet duizenden datapunten, moet er echter een aanvullende kwaliteitscontrole zijn die rekening houdt met eventuele bronnen van fouten die de resultaten kunnen verwarren¹⁵. Een element dat in tal van wetenschappelijke disciplines is geïdentificeerd als een bijdragende factor, is het randeffect. Sommige mitigerende strategieën zullen de beste plaat voorstellen om te gebruiken of de ruimte tussen de putten of de buitenste putten met water te vullen om dit fenomeen te bestrijden^16,17. Deze strategieën voegen echter tijd toe, en als een specifiek wegwerpartikel niet beschikbaar is, is de enige optie om genoegen te nemen met minder of uit te stellen. Als alternatief is het kijken naar strategieën die dit effect verklaren via een blokkeringsschema geen concessie aan doorvoer of vertraging van de uitvoering.

Dit geëtioleerde protocol voor protoplast van maïsbladeren en de twee geautomatiseerde methoden die in Figuur 1 worden geïllustreerd, proberen de variabiliteit aan te pakken die inherent is aan protoplastexperimenten door meerdere delen van de canonieke protoplastmethode te automatiseren, de toewijzing van plasmidemateriaal aan het vat dat wordt gebruikt voor transfectie, en de transfectie zelf. Deze methoden worden gedemonstreerd voor het geëtioleerde protoplastplatform van maïsbladeren, aangezien het een goed gekarakteriseerd, eenvoudig en efficiënt protoplastplatform is. Alle stappen die binnen worden beschreven, zijn onmiddellijk toegankelijk voor de protocollen van de protoplasttransfectie, die gelijkaardige of de zelfde bufferoplossingen gebruiken. Alvorens deze technieken worden toegepast, moet echter speciale aandacht worden besteed aan de unieke kenmerken van het weefsel en de soort van de protoplastbron. Deze verbeteringen door automatisering vereenvoudigen de voorbereiding van materiaal voor individuele experimenten en verbeteren de doorvoer aanzienlijk, van één-voor-één sequentiële transfectie tot 96 gelijktijdig behandelde transfecties. Dit werk zal ook rechtvaardiging aantonen voor het gebruik van gerandomiseerde onvolledige blokken om rekening te houden met positionele vertekening van de plaat.

Protocol

1. De totstandbrenging van de transfectieplaat

1. Lay-out van het dek maken: Om een randomisatiemethode voor DNA-platen te maken, opent u de software voor vloeistofverhandeling. Klik op de knop Nieuwe methode in de menubalk om een nieuwe methode te maken. Voeg de regel Instrumentinstelling toe tussen de regels Start en Finish door op de knop Instrumentinstelling op het linkerdeelvenster te drukken.
   OPMERKING: Relevante schermafbeeldingen die samen met dit geautomatiseerde protocol volgen, zijn te vinden in Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Afbeelding 2 en Aanvullende Afbeelding 3.
2. Klik op de regel Instrumentinstelling , zoek het juiste labware in het categoriemenu van Labware en sleep ze naar de deklay-out zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 1.
   NOTITIE: Als het laboratoriummateriaal nog niet eerder is gedefinieerd, moet het volgens de specificaties van de fabrikant in de vloeistofverwerker worden geprogrammeerd, maar dergelijke instructies vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol.
3. Overdracht van bestandsinstelling: Druk op de knop Overdracht van bestand op de stappenpaletten en plaats de regel Overdracht van bestand onder de regel Instrumentinstelling. Zorg ervoor dat de keuze en vervanging van de punt zijn zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 3.
4. Controleer of Bestand een veldnamenrij heeft en controleer of de kolominformatie correct is.
5. Druk op het brongebied om het te activeren en klik op de bronplaat in de lay-out van het dek, definieer de doelplaat en voer de hoeveelheid DNA in die moet worden gepipetteerd.
6. Druk op de knop Aanpassen om de pipetteertechniek in detail te definiëren, zoals het aanraken van de tip op de muur.
7. Specificeer de hoeveelheid plasmide-DNA die moet worden overgedragen. Dit protocol gebruikt 20 μL van 1 μg/μL plasmide-DNA per transfectie (put).
   OPMERKING: de hoeveelheid plasmide-DNA die naar de transfectieplaat vóór de protoplasttransfectie wordt overgebracht, zal afhangen van het protoplastplatform dat wordt gebruikt.
8. Maak een overdracht van bestand .csv document.
   1. Dit document bestaat uit twee kolommen. Bereid de eerste kolom voor, d.w.z. de kolom Van, die de locatie van het voorraadplasmide-DNA in het buizenrek aangeeft, d.w.z. voor monster 1; dit zou goed zijn A01. Aangezien deze overdracht drie keer plaatsvindt (drie herhalingen), moeten drie rijen A01 aanduiden in de kolom Van.
   2. Bereid de tweede kolom voor, d.w.z. Naar kolom, die wordt gebruikt om de bestemmingsput van de plasmideconstructie van de plaat met 96 putjes te specificeren. Monster 1 (A01) kan bijvoorbeeld B02, D04 en H07 zijn. Sla dit op als een .csv bestand om compatibel te zijn met de liquid handler-software.
9. Voordat u het protocol uitvoert, controleert u of de dekposities zijn geladen, of het laboratoriummateriaal correct is gedefinieerd, het randomisatiedocument putlocaties bevat voor al het monster-DNA in het buizenrek en of er voldoende plasmidemonster in de buizen is om het protocol uit te voeren.
10. Vouw het menu Bestandseigenschappen van de stap Overdracht uit bestand uit, selecteer het .csv bestand dat is gemaakt en voer het protocol uit.
11. Bedek transfectieplaten met een aluminiumfoliezegel wanneer het protocol met succes is voltooid. Bewaar transfectieplaten bij -20 °C tot ze klaar zijn voor gebruik. De geïsoleerde geëtioleerde maïsbladprotoplast wordt in stap 3.3 aan deze transfectieplaat toegevoegd.

2. Geëtioleerde isolatie van protoplast van maïsbladeren

1. Om te beginnen met de isolatie van geëtioleerde maïsbladprotoplast, moet een protoplast-compatibele genetische achtergrond worden verkregen, zoals NP222 die hier werd gebruikt¹⁸. Bereid slechts 3 buffers voor, namelijk MMg-, W5- en WI-buffers, vermeld in tabel 1 voor het begin van het experiment en houd deze op 4 °C. Bereid de spijsverteringsoplossing en PEG op de dag van het experiment voor de beste resultaten.
2. Oppervlak steriliseren 25 zaden door ze eerst onder te dompelen in een 25% commerciële bleekoplossing en ze ongeveer 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur op een roterende platformschudder te schudden.
3. Spoel de zaden na het roeren grondig af met steriel water (DI). Herhaal de spoelstap 5x. Drink de zaden een nacht in steriel water bij kamertemperatuur.
4. Zaai het zaad de volgende dag op vochtige, geautoclaveerde grond. Voeg droge kleikorrels toe om overtollig vocht uit de grond af te voeren om schimmelbesmetting te voorkomen.
5. Kweek de maïszaailingen in een 16 uur durende lichte groeikamer bij 28 °C (relatieve vochtigheid (RV) van 30%) gedurende ongeveer 3 dagen totdat het coleoptiel 1-2 cm boven de grond is en breng ze vervolgens over naar een donkere kamer met dezelfde temperatuur en RV gedurende nog eens 5 - 7 dagen.
6. Oogst het eerste echte bladweefsel door het net boven de eerste kraag af te knippen.
7. Oppervlak steriliseer het bladweefsel kort in 25% handelsbleekmiddel en 250 μL 20% Tween 20-oplossing gedurende 1 minuut. Spoel het bladmateriaal 5x grondig af met gedemineraliseerd water.
8. Dep het maïsbladweefsel (voorzichtig) droog met pluisvrije tissues en verwijder met een scherp mes ~1,5 cm van zowel de punt als de basis van elk bladblad.
9. Snijd het resterende bladweefsel in smalle (0,5 mm - 1 mm) dwarsstroken en plaats deze in een petrischaaltje van 100 x 25 mm.
10. Filtreer en steriliseer 25 ml van de digestieoplossing door een spuitfilter van 0,22 μm rechtstreeks in het petrischaaltje met het gesneden weefsel.
11. Infiltreer het bladweefsel vacuüm met digestieoplossing door gedurende 30 minuten vacuüm toe te passen bij kamertemperatuur in een vacuümexsiccator bij een druk van ongeveer -75 mbar.
    OPMERKING: De vacuümdruk in huis voor tal van academische en particuliere laboratoria zou voldoende moeten zijn voor deze stap.
12. Plaats op een roterende platformschudder en schud op 25 °C in het donker bij 60 RPM gedurende 2,5 tot 3 uur. Als er nog 10 minuten over zijn tot het einde van de spijsverteringsperiode, verhoog dan de snelheid tot 90 RPM.
13. Giet de digestieoplossing en al het onverteerde plantmateriaal door een trechter bovenop een zeeffilter van 40 μm in een buis van 50 ml.
14. Centrifugeer de oplossing in de buis van 50 ml bij 150 x g gedurende 4 minuten om de protoplast te pelleteren. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 10 - 15 ml MMg Buffer-oplossing.
15. Herhaal de centrifugatie en verwijder de supernatant. Resuspendeer in een verse MMg-buffer van 5 - 10 ml.
16. Meet met een hemocytometer zorgvuldig de dichtheid van de geïsoleerde protoplast. Resuspendeer tot een dichtheid van ongeveer 5 x 10⁵ protoplasten per ml.
17. Laat het isolaat ~30 minuten op ijs rusten voorafgaand aan de transfectie. Bereid gedurende deze tijd de PEG-oplossing voor. Los PEG volledig op in een oplossing met behulp van een waterbad van 37 °C en laat het daar staan tot transfectie.

3. Geautomatiseerde protoplasttransfectie

OPMERKING: Stappen 3.6 tot en met 3.15 worden volledig beheerd door de geautomatiseerde vloeistofbehandelingsler, met uitzondering van de twee gebruikerspauzes bij stap 3.10 en 3.13, die handmatige centrifugatie vereisen. Relevante schermafbeeldingen die samen met dit geautomatiseerde protocol volgen, zijn te vinden in het supplement, Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Figuur 3, Aanvullende Figuur 4 en Aanvullende Figuur 5.

1. Bereid de deklay-out van de vloeibare handler voor transfectie voor volgens de protoplasttransfectiemethode die in de volgende stappen wordt beschreven. Monteer de volgende materialen: Bestemmingsplaat (in dit geval een zwarte plaat met 96 putjes met een doorzichtige microplaat aan de onderkant voor fluorescentiemeting), een doos met automatiseringstips met brede boring van 25 - 250 μl voor de PEG-aspiratiestap, vijf dozen met 25 - 250 μL pipetautomatiseringstips voor de resterende vloeistofbehandelingsstappen, drie plastic troggen als reagensreservoirs, een lege plaat met 96 putjes voor afvalinzameling, resterende wasoplossingen voor transfectiebuffers, W5 en WI.
2. Onmiddellijk voordat de transfectieprocedure begint, steriliseert de filter de PEG-oplossing door een 0,22 μm steriele wegwerpvacuümfiltereenheid in een verse buis van 50 ml.
3. Van de protoplast die in MMg-buffer is geresuspendeerd, voegt u 100 μL (ongeveer 50.000 protoplast) toe aan elk putje van de voorbereide, ontdooide transfectieplaat. Giet hiervoor de protoplastbevattende bufferoplossing in een steriele trog van 10 ml en gebruik een meerkanaalspipet. Blijf de trog voorzichtig roeren om te voorkomen dat de protoplast tijdens deze handmatige overdrachtsstap uit de oplossing bezinkt.
4. Giet de PEG-oplossing in de aangewezen trog en leg de transfectieplaat neer, die nu protoplast en plasmide-DNA bevat die transfectieplaat bevat, bereid met behulp van stap 1, op de gespecificeerde locatie volgens de deklay-out.
5. Om een protoplasttransfectiemethode tot stand te brengen, opent u de software van de vloeibare handler en voert u de hieronder beschreven stappen uit.
   1. Labware tussen decks verplaatsen: Vervang de lege tipbox op de tiplaadvloer door een nieuwe met behulp van de opdracht Labware verplaatsen. Selecteer de decks Van en Naar in de configuratieweergave .
   2. Voor volumes van meer dan 200 μL: Vervang de tips niet tussen de transfers. Laad tips voor de eerste overdrachtsstap en ontlaad na de laatste overdrachtsstap, waarvoor de opties voor laden/lossen correct moeten worden gespecificeerd voor elke overdrachtsstap, zoals in aanvullende afbeelding 3.
6. De totstandbrenging van de deklay-out: Net als de methode voor het maken van transfectieplaten, om een DNA geautomatiseerde transfectiemethode te creëren, opent u de software voor vloeistofverwerkers. Klik op de knop Nieuwe methode in de menubalk om een nieuwe methode te maken. Voeg de regel Instrumentinstelling toe tussen de start- en eindlijn door op de knop Instrumentinstelling in het linkerdeelvenster te drukken. Maak een deklay-out volgens de deklay-out die wordt weergegeven in aanvullende afbeelding 1.
7. Cel/DNA-menging: Voeg een stap toe om protoplast en DNA te mengen voordat PEG wordt toegevoegd met behulp van de Device Action-knop en het instellen van het apparaat (shakeing automated labware positioner of ALP), schudsnelheid (1500 rpm) en tijd om te schudden (10 s).
8. PEG toevoeging en het mengen: Om de transfectie te initiëren, voegt een stap van de Overdracht toe om 110 μL PEG van PEG-reservoir toe te voegen gebruikend een pipet van 96 peulen. Zorg ervoor dat de juiste bron- en bestemmingsposities zijn geprogrammeerd volgens de gespecificeerde lay-out van het dek. Programmeer de overdrachtsstap om PEG op 1 mm van de bodem van het reservoir aan te zuigen en deponeer de PEG op 3 mm van de bodem van de plaat met 96 putjes die het protoplast/DNA-mengsel bevat. Voeg nog een schudstap toe na het toevoegen van PEG door de eerder geprogrammeerde stappen te kopiëren en te plakken.
9. PEG-incubatie: Voeg een pauzestap toe door de pauzeknop te selecteren, selecteer de shaker en voer de vooraf bepaalde incubatietijd in, die begint met PEG-toevoeging.
   OPMERKING: De timer voor de pauze loopt door, tenzij er onderbrekingen of verstoringen van het lichtgordijn zijn die kunnen leiden tot een foutmelding. Zorg ervoor dat als manipulatie van het kaartspel nodig is, deze berichten worden gewist voordat u wegloopt.
10. W5-buffer toevoeging/menging: Voeg drie lijnen van Overdracht van 200 μL toe om een totaal van 600 μL W5-buffer over te brengen naar de transfectieplaat om de PEG-incubatiereactie te doven. Volg de W5-buffertoevoeging door te schudden en een gebruikerspauze in te stellen om centrifugatie van de transfectieplaat mogelijk te maken.
11. Gebruikerspauze 1: Centrifugeer de protoplasttransfectieplaat op 100 x g gedurende 4 minuten. Breng de transfectieplaat, nu met gepelleteerd protoplast, terug naar de juiste dekpositie. Voeg gebruikerspauze toe door op de knop Pauzeren te klikken, behalve nu met de optie Het hele systeem pauzeren en de berichtoptie weergeven .
    OPMERKING: De pop-up met het pauzebericht moet worden gewist voordat de vloeistofhandler verder gaat met de rest van het protocol.
12. Verwijdering van supernatant: Voeg twee lijnen Transfer toe om 400 μL supernatans te verwijderen en over te brengen naar de afvalplaat. Om celaspiratie tijdens het verwijderen van het bovenstaande te voorkomen, stelt u de afstand vanaf de bodem in op 6 mm.
13. WI toevoeging/menging Voeg 3 lijnen van Transfer toe om 580 μL WI-buffer over te brengen naar de transfectieplaat. Voeg nog een schudstap toe na WI-toevoeging door de eerder geprogrammeerde stappen te kopiëren en te plakken. Ga verder met de volgende gebruikerspauze.
14. Pauze 2 van de gebruiker: Centrifugeer de protoplasttransfectieplaat op 100 x g gedurende 4 min. Breng de transfectieplaat, nu met gepelleteerd protoplast, terug naar de juiste dekpositie.
15. Verwijdering van supernatant: Voeg vier transferlijnen toe om 680 μL supernatans te verwijderen en over te brengen naar de afvalplaat. Om celaspiratie tijdens het verwijderen van het bovenstaande te voorkomen, stelt u de afstand vanaf de bodem in op 6 mm.
16. Overdracht van protoplasten naar microplaat: De uiteindelijke overdracht van dit protocol bestaat uit twee overdrachtsstappen van 150 μL. Vóór elke afzonderlijke stap worden protoplasten herhaaldelijk aangezogen met 50 μl/s op 2 mm vanaf de bodem van de transfectieplaat en gedoseerd bij 3 mm. Breng vervolgens, met behulp van dezelfde pipetpunten, over naar de microplaat van de bestemming.
    OPMERKING: Het aanzuigen en doseren van buffervolume boven de korrel voorafgaand aan overdracht naar de microplaat zal alle resterende protoplasten verstoren die op de bodem van de transfectieplaat zijn gepelleteerd om ervoor te zorgen dat er geen monsterverlies is. Aangezien randomisatie werd uitgevoerd tijdens de creatie van de transfectieplaat, concludeert dit het geautomatiseerde protocol.
17. Incubeer de microtiterplaat 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur in het donker vóór de eerste fluorescentiemeting.

Results

Om observationele gegevens te verkrijgen die ondersteunen dat randeffecten de responsmetingen kunnen beïnvloeden; Een pilotstudie werd uitgevoerd om die vermoedens te bevestigen. Voor deze studie werden de bovenstaande methoden toegepast op drie replicatie van 96-putjes platen met slechts één behandelingsniveau; alle protoplasten werden getransfecteerd met behulp van pSYN11250¹⁹, een plasmide dat ZsGreen constitutief tot expressie brengt, met als doel aan te tonen dat er systematische verschillen bestaan in responsniveau voor eenheden aan de rand van de plaat in vergelijking met de tweede rij en centrale gebieden van de plaat. De 36 putten aan de buitenrand van de plaat worden gedefinieerd als blok 1, de 28 putten in de tweede rij vanaf de rand als blok 2 en de centrale 32 putten als blok 3 - zie figuur 2A rechtsonder. Deze opstelling is geschikt voor 28 behandelingsniveaus als een gerandomiseerd compleet blokontwerp (RCBD) of 32 behandelingsniveaus als een gerandomiseerd onvolledig blokontwerp (RIBD). In figuur 2A werden voor elke replicaat (rep) de ruwe gegevenspunten voor elke put genormaliseerd door het gemiddelde van die respectieve plaat. In alle drie de replicaten van het experiment zijn de reacties op de rand van de plaat gemiddeld 1-1,5x groter dan het minimum. Figuur 2B geeft blokgemiddelden weer als een percentage van het totale plaatgemiddelde voor elke replicaat. Tabel 2 toont eenrichtings-ANOVA-tafels van het passen van een lineair model met blok als een vast effect. Om redenen die verband houden met de beperkte randomisatie die betrokken is bij blokontwerpen, wordt gevolgtrekking op basis van hypothesetesten voor de blokkerende factor in het beste geval als bij benadering en in het slechtste geval als ongeldig beschouwd. Het inpassen van een model met een vaste blokkeringsfactor is echter nuttig om te beoordelen of een blokkeringsschema gunstig is. Mn_Sq (blok) staat voor de gemiddelde kwadratische afwijking van het blok, wat ongeveer het totale gemiddelde betekent. Mn_Sq (Fout) staat voor de gemiddelde kwadratische afwijking van de individuele waarnemingen over hun respectievelijke groep, in dit geval het totale gemiddelde, aangezien er geen behandelingsfactor in het model is. Wanneer Mn Sq (blok) groter is dan Mn Sq (fout), d.w.z. de F-ratio groter is dan één, is de grootte van de gemiddelde kwadratische fout effectief verkleind ten opzichte van een volledig gerandomiseerd ontwerp (CRD), waardoor de statistische power om de behandelingen van belang te vergelijken wordt vergroot en de breedte van betrouwbaarheidsintervallen voor het schatten van behandelingscontrasten wordt verkleind. Figuur 2B toont F-ratio's die ver boven één liggen, en de gemeten respons heeft de neiging af te nemen naarmate deze naar het midden beweegt op alle drie de replicaatplaten. In alle drie de replicaten worden 95%-betrouwbaarheidsintervallen waargenomen op niveau 0,05 voor ten minste één blok dat het waargenomen plaatgemiddelde niet bedekt. Derhalve kan worden geconcludeerd dat de blokkeringsregeling de precisie van deze ramingen aanzienlijk verhoogt. Behalve dat er minder precisie is, kan het niet in aanmerking nemen van variabiliteit in ruimtelijke hinder leiden tot valse resultaten vanwege de mogelijkheid om behandelingseffecten te verstoren met het randeffect.

Hoewel er een lange geschiedenis van geëtioleerde isolatie en transfectieprotocollen van maïsprotoplast is die teruggaan tot het begin van de jaren 1990, introduceert dit protocol enkele extra wijzigingen aan de traditionele procedure om een reproduceerbare, bulkprotoplastisolatie voor de doeleinden van protoplasttransfectie met hoge doorvoer²⁰ beter te vergemakkelijken. De sterilisatiestappen van het zaad- en bladweefsel vóór de vertering verminderen schimmelbesmetting zonder dat aseptische media nodig zijn. Het gebruik van aarde zal ook helpen om de kosten laag te houden in vergelijking met het gebruik van speciale groeimedia of het kopen van steriele wegwerpcontainers voor eenmalig gebruik. Het protocol kan in verschillende stadia worden geschaald om tegemoet te komen aan verschillende doorvoerniveaus. Ongeveer 2 g eerste bladweefsel resulteert in tussen 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ protoplasten. Aangezien 5 x 10⁶ protoplasten per 96 putplaattransfectie worden vereist, kan het isolatieprotocol, zoals het wordt geschreven, 2 looppas van het transfectieprotocol aanpassen. Dit protocol maakt ook gebruik van MMg als wasoplossing in plaats van de canonieke W5-oplossing. Dit werd oorspronkelijk afgeleid uit publicaties voor Arabidopsis wortel protoplast als middel om het aantal bufferoplossingen te verminderen die voor een bepaalde stap van de protoplast transfectieprocedure worden gebruikt²¹. Het werd echter ook gebruikt voor geëtioleerde maïsbladprotoplast in 2022²². Verdere verbetering van de isolatie en transfectie van elk protoplastprotocol zou de vereenvoudiging en vermindering van bufferoplossingen zijn. Zoals het er nu uitziet, schakelt dit protocol tussen de canonieke digestiebuffer, W5-buffer, MMg-buffer en WI-buffer. Vereenvoudiging van de oplossingen zou zeer nuttig zijn voor het verbeteren van de reproduceerbaarheid van protoplastexperimenten en het verminderen van de variabiliteit van persoon tot persoon of van batch tot batch tussen experimenten. Opmerkelijk is de laatste nieuwigheid van het protocol het ontbreken van volledige verwijdering voor bufferoplossingen na PEG-transfectie. De reden dat de automatisering mogelijk is, is omdat de protoplast, geëtioleerde maïs die hier wordt getoond en andere die we hebben getest, is dat ze de verdunning lijken te tolereren als een middel om de reactie te doven in plaats van volledige verwijdering van de verschillende bufferoplossingen¹¹. De productie van de reporter, zoals aangegeven door onze GFP-transfectiecontrole die hier wordt gebruikt, geeft aan dat protoplast tot 5% PEG kan verdragen zonder negatieve invloed op de fluorescentie-intensiteit (aanvullende figuur 6). Die waarde is meer dan het dubbele van wat de verwachte PEG-concentratie zou zijn na voltooiing van het hier beschreven protocol.

Figuur 1: Illustratief schema van de protoplastisolatie- en transfectieprocedure. Stappen waar automatisering is ingevoerd, worden aangegeven door de gestippelde rode lijnen en de bijbehorende blauwe vakken. Getallen omgeven door een rode cirkel komen overeen met de drie beschreven methoden. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Randeffect en de impact van mitigerende replicate-lay-outs. (A) Topografische kaarten met vouwverandering van fluorescentie-intensiteit voor platen met 96 putjes getransfecteerd met pSYN11250 ten opzichte van het plaatgemiddelde voor 3 onafhankelijke replicate (Rep) experimenten. Het gemiddelde van die experimenten wordt ook weergegeven met het blokkeringsschema, aangegeven door de verschillende kleuren stippellijnen die eroverheen zijn gelegd. (B) Stripdiagrammen die het blokgemiddelde weergeven als een percentage van het totale plaatgemiddelde voor duplicaatplaten 1, 2 en 3 van links naar rechts. De semi-transparante cirkels geven de ruwe datapunten weer na deling door het plaatgemiddelde. De foutbalken zijn 95% betrouwbaarheidsintervallen op niveau 0,05, waarbij het centrale streepje het gemiddelde aangeeft. De bruine, gouden en grijze kleuren geven respectievelijk de rand, de tweede rij en het binnenste gedeelte van de plaat aan. De gestippelde rode lijn op 100% geeft het totale plaatgemiddelde weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buffer	Reagens
Spijsvertering	1,5% Cellulose Rs
	0,3% macro-enzym
	0.6 M Mannitol
	10 mM MES (ph 5,7)
	1 mM CaCl2
	0,1% (m/v) BSA
	0,5 nM β-mercaptoethanol of 0,5 mM DTT
Moeder	0.6 M Mannitol
	15 mM MgCl2
	4 mM MES, pH 5,7
W5	154 mM NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5,7
WI	0.6 M Mannitol
	4 mM MES, pH 5,7
	4 mM KCl
PIN	30% PEG (m/v)
	0.6 M Mannitol
	100 mM CaCl2

Tabel 1: Bufferoplossingen voor de isolatie en transfectie van geëtioleerde maïsprotoplast.

Rips	Bron	Df	Som Sq	Mn Sq	F-waarde	Pr (>F)
Repliceren 1	Blokkeren	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Overgebleven	93	1.135	0.012
Repliceren 2	Blokkeren	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Overgebleven	93	1.102	0.012
Repliceren 3	Blokkeren	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Overgebleven	93	1.861	0.02

Tabel 2: Één weg ANOVA-lijst voor de drie replicaten van het 96-well pSYN11250 transfectieexperiment. Voor elke gerepliceerde plaat: de kolom Bron geeft de bron van variatie aan, Df geeft vrijheidsgraden aan, Som Sq geeft de som van kwadraten aan, Mn Sq geeft gemiddelde kwadraten aan (Som Sq/Df), F-waarde geeft de verhouding van Mn_Sq (blok) tot Mn_Sq (fout) aan, en Pr(>F) geeft de p-waarde van de globale F-test aan.

Aanvullende figuur 1: Screenshots van het softwaredashboard. Selectiecategorieën die betrekking hebben op het maken van een nieuwe methode, evenals de deklay-outs voor randomisatie- en transfectieprotocollen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Zeer belangrijke stappen in de opstelling voor het protocol voor de verwezenlijking van de transfectieplaat. Screenshots gemaakt tijdens de totstandkoming van het protocol voor het maken van transfectieplaten. Het nummer en de titel voor elk paneel komen overeen met de stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Screenshots voor manipulatie van labware en het laden van uiteinden voor de totstandbrenging van het transfectieprotocol. Dit zijn stappen die meerdere keren in het protocol voorkomen, dus om herhaalde vermeldingen te voorkomen, worden hier representatieve stappen weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Cel-DNA-menging door gebruikerspauze 1. Screenshots genomen tijdens de creatie van het transfectieprotocol. Het nummer en de titel voor elk paneel komen overeen met de stappen in de hoofdtekst van het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Verwijdering van het bovenstaande na gebruikerspauze 1 door overdracht van monsters naar de microtiterplaat. Screenshots genomen tijdens de creatie van het transfectieprotocol. Het nummer en de titel voor elk paneel komen overeen met de stappen in de hoofdtekst van het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: ZsGreen getransfecteerd geëtioleerd maïsbladprotoplast behandeld met verschillende concentraties PEG in WI-buffertijdverloop. Staafdiagram met de relatieve fluorescentie-intensiteit van protoplast na PEG-behandeling op 24, 48 en 72 uur met meting door een microplaatlezer. Foutbalk = SD, n = 4. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het automatiseren van de creatie van transfectieplaten en de isolatie van geëtioleerde maïsbladprotoplast met een geautomatiseerde transfectie. Voor de succesvolle voltooiing van het gedeelte van de vertaling van de plaatverwezenlijking van het protocol, vereist het een geautomatiseerde robot voor vloeistofbehandeling die is uitgerust met een 8-kanaals pod. Voor het transfectieprotocol, wordt een pod met 96 putjes aanbevolen voor volledige en uniforme 96-well plaattransfectie. De transfectiemethode kan worden voltooid met behulp van een 8-kanaals peul, maar speciale aandacht moet worden besteed aan de hoeveelheid tijd die aspiratie en afgiftestappen in beslag nemen, evenals de tijd die kan worden toegeschreven aan het veranderen van tips tussen kolommen. Verschillen in de duur van PEG-incubatie zijn goed gedocumenteerd om een significante invloed te hebben op de efficiëntie en expressie van transfectie, en daarom moet speciale aandacht voor deze bijdragende factoren worden overwogen om ongelijkheid in de behandeling van monsters te voorkomen¹³. Voordat u met het liquid handler-protocol begint, is het belangrijk om na te denken over de stappen van het protocol en of bepaalde activiteiten tegelijkertijd kunnen worden voltooid. Dit protocol maakt gebruik van een apparaat dat tips laadt op de pod met 96 putjes vanaf 1 positie op het dek. De vloeistofverwerker voor dit protocol bevat een functie waarbij de robot tipboxen verwisselt tijdens de incubatieperioden of tijdens de pauzestappen van de gebruiker om te voorkomen dat er extra tijd aan het protocol wordt toegevoegd. Denk bij het nemen van de beslissing om een vloeistofverwerker te kopen na over functionaliteit en mogelijke tijdbesparende gemakken.

Hoewel dit protocol is ontwikkeld om gebruik te maken van Beckman Coulter NXp- en Biomek FX-apparaten, kan dit protocol worden aangepast aan elk vergelijkbaar vloeistofbehandelingsapparaat. Alle vloeistofverwerkers hebben een manier om aan te geven hoe volumes van de ene locatie naar de andere moeten worden overgebracht en hoeveel. Voor dit protocol gebruikten deze apparaten een opdracht voor de regel Overbrengen van bestand. Als het laboratoriummateriaal correct is gedefinieerd, kan een gebruiker van of naar elk vat overstappen. In uitzonderlijke omstandigheden, bijvoorbeeld als buisrekken of adapters niet in de handel verkrijgbaar zijn, kunnen dergelijke connectoren worden gebruikt voor het 3D-printen van dergelijke connectoren. Voor typische protocollen van de protoplasttransfectie is 20 μg DNA bij een concentratie van 1 μg/μL transfectie een standaardvolume van materiaal voor talrijke protoplastplatforms¹³_. Tijdens de totstandbrenging van de transfectieplaat, als extra voorzorgsmaatregel, gebruik 0,2 - 20 μL filteruiteinden om om het even welk besmettingsrisico als gevolg van verneveld plasmide tijdens overdracht te minimaliseren. Het verwijderen van de menselijke component van het preparaat vermindert de variatie in de tijd en verbetert de reproduceerbaarheid van deze experimenten met hoge doorvoer. Ook kunnen borden ruim van tevoren worden bereid. Dit preparaat zal de spanning van de transfectiewetenschapper op de dag van het experiment verlichten. Het is echter belangrijk om deze platen van plasmide-DNA niet gedurende langere tijd bij 4 °C op te slaan, omdat monsters kunnen verdampen. De steekproeven zouden in een diepvriezer van -20 °C moeten worden opgeslagen en kunnen dan in de koelkast van 4 °C vóór transfectie worden ontdooid. Zodra dit protocol voor de verwezenlijking van de transfectieplaat wordt geprogrammeerd, zou het gemakkelijk herhaalbaar moeten zijn door een nieuwe overdracht van bestand te leveren .csv en dezelfde deklocaties voor de monsters, laboratoriumartikelen en reagentia te bezetten.

Voor de geautomatiseerde transfectieprocedure (stap 3) wordt een overschot aan PEG-oplossing bereid om een gelijkmatige aspiratie van de viskeuze vloeistof uit de trog te garanderen, meestal een overmaat van 40 ml om rekening te houden met het dode volume. Het gebruik van precies de vereiste hoeveelheid voor de transfectie kan resulteren in lucht die in de pipetten wordt getrokken en ongelijke volumes PEG die over het 96-kanaals hoofd worden aangezogen. Hoewel deze oplossing ook van tevoren kan worden bereid, wordt het aanbevolen om op de dag van transfectie te worden voorbereid. Sterilisatie van de PEG-oplossing kan worden gedaan met behulp van een spuitfilter, maar vanwege de viscositeit kan het moeilijk zijn. Het gebruik van een vacuümfiltereenheid is sneller en kan eventuele frustratie of pijn die met deze activiteit gepaard gaat, verlichten. Net als de PEG-oplossing wordt ook een overmaat van de andere transfectiebufferoplossingen (W5, WI) geleverd om een gelijkmatig pipetteren over de 96-kanaals kop te garanderen. Bufferoplossingen (W5 en WI) kunnen van tevoren in bulk worden bereid om te worden gebruikt voor toekomstige vloeistofoverslagruns. Hoewel de reagentia niet duur zijn, wordt er een goede hoeveelheid bufferoplossing opgeofferd. Met het toenemende aantal runs per dag, is het misschien beter om alternatieven voor het reservoir te gebruiken die het overtollige dat aan het einde van de run wordt weggegooid, verminderen. Tijdens het uitvoeren van het liquid handler-protocol kunnen W5 en WI worden toegevoegd aan hun respectievelijke troggen voordat het protocol begint, tijdens de incubatie van 15 minuten of tijdens de pauzestappen van de gebruiker in het protocol. Wees voorzichtig bij het toevoegen van buffers tijdens de incubatietijd vanwege veiligheidsvoorzieningen zoals een lichtgordijn. Zorg ervoor dat alle waarschuwingsberichten van de software worden gewist om onbedoelde verstoring van het protocol te voorkomen.

Dit protocol weerspiegelt een betrouwbare, herhaalbare en breed toepasbare verbetering ten opzichte van eerder gedocumenteerde geautomatiseerde protocollen voor de verwerking van protoplast^12,13. Deze methode kan worden aangepast aan het schijnbaar eindeloze repertoire van protoplast-protocollen, aangezien veel ervan afhankelijk zijn van dezelfde reeks stappen voor buffermanipulatie. Het verzachten van het randeffect door de RICBD tijdens de geautomatiseerde creatie van de transfectieplaat vermindert tegelijkertijd de hoeveelheid inspanning en variabiliteit terwijl een statistisch significante correctie van het randeffect wordt toegepast. Een pod-transfectie van protoplast met 96 putjes elimineert de mogelijkheid van enige variatie die verband houdt met de tijd van PEG-incubatie, waarbij de reactie tegelijkertijd in alle 96 putjes wordt uitgevoerd. Terwijl het protocol bedoeld was om volledige automatisering van de transfectiestappen te bereiken, zullen de gebruikerspauzes fysieke interventie door de transfectiewetenschapper vereisen. In de afgelopen jaren is er veel vooruitgang geboekt op het gebied van onbalanstolerante, automatiseringscompatibele centrifuges. Met deze apparatuur zou het mogelijk zijn om de hele methode te automatiseren zonder tussenkomst van de gebruiker. Als alternatief hebben andere protocollen centrifugatie vermeden door de protoplast na transfectie naar de bodem van de put te laten bezinken ^12,13. Nochtans, zal dit extra tijd aan de transfectieprocedure toevoegen en een overschrijding van de tijd het incuberen in de W5-buffer vóór nachtelijke incubatie in WI.

Op talrijke plaatsen in de transfectiemethode beschrijft het de behandeling van volumes van meer dan 200 μL waar de vloeistofbehandeling moet worden gedaan met behulp van meerdere transfers. Afhankelijk van de leeftijd en het model van de vloeistofverwerker kan en moet deze stap als één enkel volume worden uitgevoerd. Voor de oudere vloeistofbehandelaars, zoals het hier beschreven model, is het meeste dat kan worden opgezogen met een kop met 96 putjes 200 μL. Een voor de hand liggende verbetering van de methode in zowel efficiëntie als nauwkeurigheid zou zijn om het aantal overdrachten te verminderen om het potentiële risico op morsen, druppelen of besmetting te minimaliseren. Andere overwegingen voor de verbetering van protocollen voor vloeistofbehandeling worden uiteengezet in beoordelingen van deze technologieën en hun gebruik op het gebied van biotechnologie²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164