<ol><li> Construeer een stroom geplaatst zoals aangegeven in de video. Zorg ervoor dat de Parafilm afdichting strak is en het gebruik van gewassen dekglaasjes. </li><li> Incubeer actine-bindende middel in de kamer voor 5-10 &#39;. </li><li> Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen op het glas dekglaasje met een blokkerend eiwit. </li><li> Polymeriseren actine in de kamer door stroomt in G-actine in polymeriseren buffer. </li><li> Wash-out niet-gepolymeriseerde actine door stromend dan buffer. </li></ol>

monitoring actin demontage met time-lapse microscopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

Vandaag wil ik u laten zien hoe u een flowkamer construeert, een fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop. Hiervoor creëer ik twee ruimtes met behulp van folie. Ik neem hiervoor parafilm en snijd dit in kleine stroken.Vervolgens ga ik, dit zal in feite de kanalen voor de wanden vormen, en ik droog ze met een schuine luchtstroom. Ik plaats het dekglas bovenop de paraffine, en hier is het resultaat. Daarna verhit ik het op een warmteblok om de paraffine te smelten en zo in feite een afdichting te creëren.Dit is dus het dekglas hier, en bovenop het dekglas bevinden zich twee lagen phim, zoals u hier ziet. En daarop ligt vervolgens weer een dekglas van 22 bij 22 mm. Dit exemplaar hier, dat ik tegen de param heb gedrukt om de verzegeling te vormen.Oké, de vloeistof stroomt hier in één richting naar binnen en ik kan deze hier in deze richting wegzuigen met een filterpapier. Ik zal u zo laten zien hoe u dat doet. Wat ik graag doe, is het in een bevochtigingskamer plaatsen, wat heel eenvoudig is.Neem twee soorten verhoogde strips en plaats daar een filterpapier onder. Om het systeem afgesloten te houden, plaats ik het dekglas op de flowcel. De manier waarop u een oplossing in de cel introduceert, is door de pipetpunt bij de ingang van de cel te plaatsen en vervolgens te dispenseren.Vervolgens incubeer ik de kamer gedurende 10 minuten met het deksel gesloten. Om de vloeistof aan de andere zijde af te zuigen, gebruik ik gewoonlijk filterpapier dat in dunne strips is gesneden, zoals hier te zien is. Ik neem een van deze dunne strips en breng gelijktijdig de oplossing aan bij de ingang, terwijl ik het filterpapier bij de uitgang plaats om de uitwisselingsoplossing op te zuigen.U ziet nu de vloeistof door de oplossing stromen. Vervolgens wacht ik vijf minuten tot de afsluiting voltooid is. Nu ben ik klaar om het actine toe te voegen; ik moet het actine polymeriseren, wat ik binnen de flowkamer doe volgens dezelfde procedures als hiervoor.Omdat de actine nu gepolymeriseerd is, spoel ik alle overtollige, niet-gepolymeriseerde actine weg met een groot volume buffer. Ik gebruik hier ongeveer 100 µL, wat overeenkomt met enkele volumes van de reactiekamer aan buffer. Zodra het filterpapier verzadigd raakt, moet ik de richting veranderen. Oké?Ik ben nu klaar om hiermee beelden op te nemen. De perfusiekamer is voorzien van gebonden actine. Nu neem ik het objectglas, monteer ik het onder de microscoop en aangezien ik beelden opneem met een olie-objectief, breng ik immersie-olie aan op het bovenoppervlak van het dekglas, zodat de oplossing, het eiwit of wat er ook aan het actine is gebonden, behouden blijft.Wat ik dus doe, is dat ik de oplossing aan de ene zijde kan vervangen terwijl ik de time-lapse imaging uitvoer. Op die manier.

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

In dit artikel

Protocol

Herprints en machtigingen

Tags