<ol><li> Construeer een stroom geplaatst zoals aangegeven in de video. Zorg ervoor dat de Parafilm afdichting strak is en het gebruik van gewassen dekglaasjes. </li><li> Incubeer actine-bindende middel in de kamer voor 5-10 &#39;. </li><li> Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen op het glas dekglaasje met een blokkerend eiwit. </li><li> Polymeriseren actine in de kamer door stroomt in G-actine in polymeriseren buffer. </li><li> Wash-out niet-gepolymeriseerde actine door stromend dan buffer. </li></ol>

monitoring actin demontage met time-lapse microscopie

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

Oké, dus wat ik vandaag wil doen, is je laten zien hoe je een flowkamer, een fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop, kunt bouwen. Wat ik dan doe, is twee ruimtes maken met behulp van film. Dus wat ik doe, is ik neem de parafilm, ik snijd het in kleine stroken.Vervolgens ga ik dit gebruiken om de kanalen voor de wanden te vormen, en ik droog ze met een hellende luchtstroom. Ik plaats de dekglas op de para en hier is de afgewerkte kamer. Vervolgens verwarm ik het op een verwarmingsblok om de param te smelten en een afdichting te maken.Dus wat dit is, is het dekglast hier, en bovenop het dekglast zijn twee lagen phim, zoals je hier ziet. En bovenop dit, weer, is het een 22 bij twee twee mil millimeter dekglas. Deze hier, die ik tegen de param heb gedrukt om de afdichting te maken.Oké, dus de vloeistof gaat hier in één richting in en ik kan het eruit zuigen met een filterpapier hier in deze richting. En ik zal je hoe dat te doen in een moment laten zien. Dus wat ik graag doe, is ik plaats het in een bevochtigde kamer, wat heel eenvoudig is.Neem twee soorten verhoogde stroken en plaats er een filterpapier onder. En om het luidruchtig te houden, plaats ik het dekglast op de flowkamer. De manier waarop je een oplossing in de kamer introduceert, is dat je de pipettip bij de ingang van de kamer plaatst en je gewoon scheidt.Nu wat ik doe, is ik incubeer de kamer met het deksel gesloten gedurende 10 minuten. Wat ik meestal doe om de vloeistof van de andere kant uit te zuigen, is een filterpapier nemen en het in dunne stroken snijden zoals dit. En ik neem een van deze dunne stroken en breng tegelijkertijd de oplossing bij de ingang aan terwijl ik het filterpapier bij de uitgang plaats om de oplossing te verwisselen.Dus je zult de vloeistof zien stromen door de oplossing. En dan wacht ik vijf minuten voor de mid close. Nu wat ik klaar ben om te doen, is eigenlijk de actin er in te doen en de actin, ik moet het polymeriseren, ik polymeriseer het binnen de flowkamer en het is dezelfde procedure als eerder.Dus omdat dit zo is, en nu dat de actie is gepolymeriseerd, was ik alle onnodige ongepolymeriseerde actie weg met een groot volume buffer. Dus hier heb ik ongeveer honderd microliters en het is een paar reactiekamer volumes buffer waard. Gewoon, weet je, wanneer het filterpapier verzadigd raakt, moet ik de richting veranderen.Oké?En dus ben ik klaar om beeldvorming te doen met dit. Dus perfusiekamer met actin eraan bevestigd. Nu neem ik de dia, monteer het onder de microscoop, en aangezien ik beeldvorming doe met een olieobjectief, ga ik wat immersieolie op het bovenoppervlak van het dekglast doen, zodat het oplossing of eiwit of iets anders op het actin binnenin kan.Dus wat ik doe, is dat ik de oplossing kan verwisselen terwijl ik de time lapse beeldvorming doe. Zo.

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

In dit artikel

Protocol

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen