Dit artikel presenteert een gestroomlijnd protocol voor het opstellen van een pulpitismodel bij muizen met behulp van een innovatieve mondknevel, gevolgd door daaropvolgende histologische analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opstelling van een blootstellingsmodel voor muizenpulp met een nieuwe mondknevel voor onderzoek naar pulpitis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pulpitis, een veel voorkomende oorzaak van natuurlijk tandverlies, leidt tot necrose en verlies van bioactiviteit in de ontstoken tandpulpa. Het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan pulpitis en de efficiënte behandeling ervan is een voortdurende focus van endodontisch onderzoek. Daarom is het begrijpen van het ontstekingsproces in de tandpulpa van vitaal belang voor het verbeteren van de conservering van de pulpa. Vergeleken met andere in vitro experimenten biedt een muizen pulpitismodel een meer authentieke en genetisch diverse context om de pathologische progressie van pulpitis te observeren. Het gebruik van muizen levert echter, ondanks hun kosteneffectiviteit en toegankelijkheid, problemen op vanwege hun kleine formaat, slechte coördinatie en lage tolerantie, wat intraorale en tandheelkundige procedures bemoeilijkt. Dit protocol introduceert een nieuw ontwerp en toepassing van een mondknevel om muizenpulp bloot te leggen, waardoor efficiëntere intraorale procedures mogelijk worden. De mondknevel, bestaande uit een tandboog, is direct beschikbaar voor de meeste tandartsen en kan de chirurgische voorbereiding aanzienlijk versnellen, zelfs voor de eerste ingrepen. Micro-CT, hematoxyline-eosine (HE)-kleuring en immunofluorescentiekleuring werden gebruikt om veranderingen in morfologie en celexpressie te identificeren. Het doel van dit artikel is om onderzoekers te helpen bij het vaststellen van een meer reproduceerbare en minder veeleisende procedure voor het maken van een pulpa-ontstekingsmodel met behulp van deze nieuwe mondknevel.
Inleiding
De tandpulpa, een integraal onderdeel van de tand, is verantwoordelijk voor meerdere essentiële functies, zoals de toevoer van voedingsstoffen, dentinevorming, sensorische functie enafweerreacties. Desalniettemin is de tandpulpa, omgeven door hard weefsel, vatbaar voor verwondingen en schade door diepe cariës, pulpitis, trauma of daaropvolgende therapieën 2,3. De afwezigheid van functionele tandpulp verhoogt het risico op tandbreekbaarheid4. Bovendien kan het verlies van de vitaliteit van de pulpa in jonge blijvende tanden de tandrijping nadelig beïnvloeden, en de huidige prothesetechnieken slagen er niet in om de neurale feedback van gezonde pulpa teherstellen. Deze situatie heeft ertoe geleid dat onderzoekers alternatieve oplossingen hebben onderzocht voor het beheersen van ontstoken pulp die verder gaan dan alleen verwijdering.
In 2007 startten Murray et al. de toepassing van weefselmanipulatie in regeneratieve endodontie, waardoor de belangstelling voor pulpaconserveringen -regeneratie toenam. Ontstoken pulpaweefsel vormt echter een uitdaging, aangezien cellen ontstekingsfactoren zoals IL-6 afgeven, die ontstekingscellen rekruteren en resulteren in celnecrose, verlies van pulpavitaliteit en complicaties bij functioneel herstel 6,7. Het begrijpen van ontstekingen en de daarmee gepaard gaande celdood is daarom cruciaal voor vooruitgang in het behoud van vitale pulpa. Er zijn een aantal experimenten uitgevoerd om de moleculaire biologie van de ontstoken pulp in vivo of in vitro te onderzoeken 8,9. Hoewel in vitro experimenten zoals 2D- of 3D-celculturen al jaren worden ontwikkeld en volwassen worden en op grote schaal worden gebruikt om reacties van pulpacellen op ontstekingsfactoren te testen, kunnen deze experimenten de interactie tussen pulpaweefsel en het systemische immuunsysteem nietweerspiegelen. Als het bestudeerde fenomeen is afgeleid van cellen van andere weefseloorsprong, zoals het immuunsysteem, het vasculaire systeem en het zenuwstelsel, dan zal pure pulpacelcultuur leiden tot een doodlopende weg. Daarom zijn in vivo experimenten zeer noodzakelijk en referentieel.
Muizen zijn steeds meer een veel voorkomende keuze geworden in ontstekingsonderzoek in vivo vanwege hun kosteneffectiviteit, hoge vruchtbaarheid en vitaliteit. Er is momenteel echter geen uitgebreid protocol voor het pulpitismodel van muizen, dat als referentie kan dienen. De kleine omvang van muizen en hun gevoeligheid voor stimulatie vormen aanzienlijke uitdagingen tijdens experimentele procedures. Het observeren van de minuscule tanden die diep in de mond van de muis zijn verborgen, vereist vaak het gebruik van een uitkragende microscoop, ondanks de meer gebruikelijke aanwezigheid van desktopmicroscopen in laboratoria. Het ontbreken van een mondopener vraagt om hulp van anderen. Om dit aan te pakken, heeft de groep een mondknevel bedacht met behulp van direct beschikbare materialen die tot doel heeft een gestandaardiseerd en reproduceerbaar protocol te bieden voor het construeren van het pulpitismodel van de muizen. Dit artikel beschrijft de procedure, met betrekking tot preoperatieve voorbereiding, immobilisatie, pulpablootstellingschirurgie en monsterafname op C57-muizen. Dit protocol beveelt het gebruik van de mondknevel aan en geeft informatie over de structuur, productie en toepassing ervan om andere onderzoekers te helpen bij het repliceren van de procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimentele procedures in deze studie werden goedgekeurd door de ethische commissie van de West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-125). Volwassen C57BL/6 muizen werden verkregen van Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China. De hele kroon van de maxillaire eerste kies barst 21 dagen na de geboorte uit. Muizen voor een operatie moeten ouder zijn dan 21 dagen met een normale vitaliteit11. Hier werden muizen van 6 tot 8 weken oud gebruikt voor modellering. Figuur 1 is een stroomdiagram van het gebruikte protocol.
1. Preoperatieve voorbereiding (figuur 2)
- Verkrijg de volgende instrumenten: stereoscopische microscoop, bevestigingsplaat, medische tape, mondknevel, minimaal invasieve tandbraam met een diameter van 0,6 mm, tandheelkundig high-speed tandheelkundig handstuk, 8# C+ vijl, verwarmingskussen, spuit van 1 ml, steriel watje, oogpincet.
- Verkrijg de volgende medicijnen: anesthesiemix, veterinaire zalf.
2. Voorbereiding van de mouth-gag
- Weeg en verdoven de muis door intraperitoneale injectie van een anesthesiemengoplossing (10% ketaminehydrochloride + 5% xylazine + 85% steriele isotone zoutoplossing) met 0,007 ml/g lichaamsgewicht en bevestig de juiste verdoving door middel van de teenknijpmethode. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om oogletsel door uitdroging tijdens het gebruik te voorkomen.
OPMERKING: Medische hoeden, maskers, handschoenen en overalls en andere basisbescherming zijn noodzakelijk. Zorg ervoor dat zowel de operatieomgeving als de muizenkamer schoon en veilig zijn. Een warmtekussen voor thermische ondersteuning tijdens de procedure is noodzakelijk. - Bereid de mondknevel voor zoals hieronder beschreven (Figuur 3).
- Verkrijg de volgende materialen: Orthodontische boogdraad met een diameter van 8 μm, jonge lusbuigtang, zware draadknipper, markeerstift, rubberen dop met een lengte van 3 mm en een doorsnedediameter van 1 mm.
- Strek eerst de boogdraad met de linkerhand voor fixatie en duim, wijsvinger van de rechterhand buig lichtjes tegen de boog van de draad. Herhaal deze actie meerdere keren, het zal het buigen naar de juiste driedimensionale hoek vergemakkelijken.
- Gebruik de Yong lus buigtang om de bovenrand (Figuur 3G, a-i) van het trapezium (Figuur 3C, a-l-k-b) ongeveer 8 mm lang te buigen in het midden van de boogdraad. Zorg ervoor dat punt a (Figuur 3) zich op de rand van de snavel van de tang bevindt.
- Houd de tang met de linkerhand vast, klem het vrije uiteinde van de boogdraad vast met de rechterduim en wijsvinger en buig de boogdraad vanaf punt a om een hoek van ongeveer 120° te maken. Dupliceer de vorige actie bij punt i (Figuur 3G). Controleer of de boogdraad zich op één vlak bevindt door deze op een horizontale tafel te leggen zonder te wrikken.
- Laat aan elke kant ongeveer 9 mm lengte vrij (Figuur 3D, a-b, l-k) en buig het vrije uiteinde in een hoek van 75° met dezelfde vaardigheid als stap 2.2.4, terwijl u ervoor zorgt dat elke rand zich op één vlak bevindt. Buig deze scherpe hoek met de punt van de tangsnavel.
- Zoek punt c op ongeveer 5 mm van punt b. Volg dezelfde vaardigheid om een hoek van 105° te buigen op punt c. Buig nog een hoek van 105° op punt d 5 mm vanaf punt c. Laat ongeveer 4,5 mm over van punt d en zoek punt e. Buig het vrije uiteinde bij punt e om een hoek van ongeveer 100 -105° te vormen (Figuur 3E).
OPMERKING: De 6-8 weken oude C57-muizen die we gebruikten, waren ongeveer 20 g. De afstand van 5 mm kon niet alleen de boven- en onderkaak van de muizen blokkeren zonder te bewegen, maar zou ook niet op de huid van de muizen drukken en ongemak veroorzaken. Als er andere soorten of leeftijden muizen worden gebruikt, pas dan de lengte van de c-d- en i-h-onderdelen aan de werkelijke situatie aan (Figuur 3E,G). - Buig een extra tongspatel voor het mandibulaire deel (Figuur 3G, j-i-h-g).
- Dupliceer buigstappen van a-b-c deel op l-k-j deel. Klem i-k en k-j onderdelen tegelijkertijd vast en buig het vrije uiteinde op punt j om het verticaal te maken ten opzichte van i-k-j vlak. Klempunt i dat 5 mm van punt j verwijderd is, buig het vrije uiteinde om het evenwijdig te maken aan zowel het i-k-j vlak als het c-d deel (Figuur 3H).
- Laat 5 mm lengte over vanaf punt i, bij punt h, buig de boog verticaal naar het i-h-gedeelte en evenwijdig aan het j-i-h-vlak. Zoek punt g op 5 mm van punt h. Klem j-i-h-g vlak en buig het vrije uiteinde symmetrisch naar k-j deel. Dan moet het vrije uiteinde na punt f symmetrisch zijn ten opzichte van het punt e-vrije uiteinde (Figuur 3H).
- Plaats rubberen doppen op het vrije uiteinde (Figuur 3F).
3. Immobilisatie
- Bevestig de muis op de rug op de fixatieplaat met ledematen die zijn vastgezet met huidtape. Druk de vrije uiteinden van de mondknevel samen met duim en wijsvinger.
- Bevestig de voorste snijtanden van de muis in de trapeziumvormige groef van twee armen. Zorg ervoor dat de arm met tongspatel voor mandibula is. Pas de mondknevel aan om ervoor te zorgen dat de tong van de muis geïmmobiliseerd is, maar niet ischemisch.
4. Beoordeling van de tanden
- Zorg ervoor dat de maxillaire eerste kies voor een operatie vrij moet zijn van tandcariës, trauma en odontogenese. Zorg ervoor dat er geen roodheid, zwelling of fistel op het omliggende tandvlees is. Zorg ervoor dat de tegenoverliggende tanden gezond zijn en beschikbaar zijn om als gezonde controlegroep te fungeren.
5. Blootstelling aan pulp
- Gebruik een tandbraam om aan de occlusale zijde van de maxillaire eerste kies te boren met een snelheid van 20.000 tpm. Zorg ervoor dat het glazuur is verwijderd. Houd de operatie met tandheelkundig handstuk alleen in een ondiepe laag dentine om overmatige thermische stimulatie op tandpulpaweefsel te voorkomen12.
- Voorkom tegelijkertijd oververhitting door tijdens de operatie elke 3 minuten een injectiespuit met een spuit normale zoutoplossing op de tand te druppelen.
- Plaats een 8# of 10# C+ vijl op de laagste positie van de geboorde put en prik door het laatste tandbeen om de pulpakamer bloot te leggen. Het zal een duidelijk gevoel van vallen zijn wanneer het lokale tandbeen grondig is verwijderd. Ga niet te diep in, anders kan er tandpulpaweefsel uit de pulpakamer worden gehaald.
- Reinig de fragmenten rond de tand. Doe de mondknevel af; De operatie is klaar. Gebruik de tegenoverliggende maxillaire eerste kies als controle zonder bediening.
6. Postoperatieve zorg
- Dien na de operatie carprofen (5 mg/kg) subcutaan toe en plaats de muis op het chemothermische verwarmingskussen in buikligging tot herstel van de anesthesie. Voer de muizen en zorg voor drinkwater. Het herstelproces moet onder toezicht staan. Er mogen geen andere dieren in dezelfde kamer zijn totdat de muis volledig is hersteld.
7. Monsterafname en opslag
- Euthanaseer de muis met cervicale dislocatie onder diepe verdoving 24 uur na de operatie of een ander tijdstip volgens experiment9. Knip de skeletspieren die aan de bovenkaak en het jukbeen zijn bevestigd af met een oogheelkundige schaar. Verwijder het skelet, het voorhoofdsbeen en het zachte weefsel en verwijder de lamina gnathostegite met maxillaire kiezen.
OPMERKING: Volgens He et al. wordt aanbevolen dat het pulpitismonster minder dan 72 uur na de operatie moet worden verzameld om uitgebreide necrose in tandpulpaweefsel te voorkomen13. - Verdeel de gnathostegiet sagittaal in tweeën en bewaar het weefsel in 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4, bij 4 °C voor 24-uurs fixatie.
8. Histologische analyse
- Was het weefsel met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en ontkalk ze in een dagelijks veranderde ontkalkingsoplossing van 5% EDTA en 4% sucrose in PBS, pH 7,4, bij 4 °C gedurende 2-4 weken10.
- Veranker de 1/2 gnathostegiet in paraffine en zorg ervoor dat het sagittale gezicht zonder tanden zich op de bodem van weefselcassettes bevindt.
- Snijd het paraffineblok in plakken van 5 μm dik met een paraffinemicrotoom. Pas de hoek van het paraffineblok aan volgens de proximale, distale, bovenste en onderste relatie die onder de microscoop wordt waargenomen om ervoor te zorgen dat de volledige kroonpulp en perforatie van de eerste kies kan worden doorgesneden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hierboven beschreven procedure werd uitgevoerd op de rechter maxillaire eerste kies van 3, 6-8 weken oude C57BL/6 muizen, terwijl de linker maxillaire eerste molaren als controle werden bewaard. Histologie- en immunofluorescentieresultaten van blanco controle, 12 uur pulpitis en 24 uur pulpitis monsters werden gebruikt voor demonstratie.
Volgens het protocol van CT-analyse van Goldman et al.15 werd de blootstelling aan pulpa bevestigd door middel van micro-CT en reco...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Als het solitaire zachte weefsel in de tanden vervult tandpulpa een cruciale rol bij het handhaven van de bioactiviteit van de tand, maar blijft het zeer gevoelig. Het behoud van deze vitale pulpa is de eerste benadering geworden die de voorkeur geniet bij recente endodontische behandelingen, waardoor een uitgebreid begrip van de ontstekingsmechanismen van tandpulpa nodig is. De spatiotemporele fluctuatie van de inflammatoire micro-omgeving en interacties tussen residente celtypen bij pulpitis bem...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de National Natural Science Foundation of China U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) en 82100982 (F. L.), en door Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.). Alle originele gegevens en afbeeldingen zijn opgenomen in dit document.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dier | |||
| C57/B6J muizen | Gempharmatech Experimentele Dierenbedrijf | C57/B6J | Voor de oprichting van pulpexpositie |
| Uitrusting | |||
| 1 mL spuit | Chengdu Xinjin Shifeng Medisch Apparatuur & Instrumenten Co. LTD. | SB1-074(IV) | Gebruikt bij het injecteren van medicijnen. |
| 8# C+ bestand | Readysteel | 0010047 | Gebruikt bij het blootleggen van het dak van de pulpkamer. |
| Anesthesie Mix-oplossing | 10% ketaminehydrochloride + 5% xylazine + 85% steriele isotone zoutoplossing. | ||
| DAPI-kleuringsoplossing | Beyotime | C1005 | Gebruikt bij immunofluorescence-kleuring voor tegenkleuring van de kern. |
| Tandheelkundige hoogsnelheids tandheelkundige handgreep | Jing yuan elektronische handelstechnologie | WJ-422 | Gebruikt bij pulpexpositie. |
| Zware draadsnijder | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Gebruikt bij boogsnijden. |
| Hematoxyline en Eosine Kleuringsset | Biosharp | BL700B | Voor de histologische analyse van de dia's. |
| IL-6 antilichaam | Novus | NBP2-89149 | Gebruikt bij immunofluorescence-kleuring om de ontsteking van het tandheelkundige weefsel te detecteren. |
| Ketamine (Ketaminehydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, VS | C3N VT1 | 100 mg/kg, IP. Toegepast bij verdoving. |
| Medische kraan | 3M | 1530 | Gebruikt bij het immobiliseren van muizen. |
| Orthodontische bogendraad | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter van 8µm |
| Ronde tandheelkundige boor (0,6 mm) | Shofu global | 072208 | Gebruikt bij het verwijderen van glazuur en ondiepe laag dentine. |
| Jonge lusbuigtang | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Gebruikt bij boogbuigen. |
Referenties
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R. Regenerative endodontics-Creating new horizons. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 104 (4), 676-685 (2016).
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328(2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing apical periodontitis in mice. J Vis Exp. (150), e59521(2019).
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
