Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

Summary

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

Abstract

De oculaire lens is een transparant flexibel weefsel dat van vorm verandert om licht van verschillende afstanden op het netvlies te focussen. Afgezien van een basaalmembraan rond het orgaan, de capsule genaamd, is de lens volledig cellulair en bestaat de lens uit een monolaag van epitheelcellen op de voorste hemisfeer en een bulkmassa lensvezelcellen. Gedurende het hele leven vermenigvuldigen epitheelcellen zich in de kiemzone bij de lensevenaar, en equatoriale epitheelcellen migreren, verlengen en differentiëren tot nieuw gevormde vezelcellen. Equatoriale epitheelcellen veranderen de morfologie aanzienlijk van willekeurig opeengepakte geplaveide cellen in uitgelijnde zeshoekige cellen die meridionale rijen vormen. Nieuw gevormde lensvezelcellen behouden de zeshoekige celvorm en strekken zich uit naar de voorste en achterste polen, waardoor een nieuwe schil van cellen wordt gevormd die over eerdere generaties vezels wordt gelegd. Er is weinig bekend over de mechanismen die de opmerkelijke morfogenese van lensepitheelcellen naar vezelcellen aansturen. Om de structuur, ontwikkeling en functie van lenzen beter te begrijpen, zijn nieuwe beeldvormingsprotocollen ontwikkeld om perifere structuren in beeld te brengen met behulp van hele vattingen van oculaire lenzen. Hier worden methoden getoond om de dikte van de capsule, het epitheelceloppervlak, het celkerngebied en de vorm, de volgorde en verpakking van meridionale rijcellen en de breedte van de vezelcellen te kwantificeren. Deze metingen zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire veranderingen die optreden tijdens levenslange lensgroei en het begrijpen van de veranderingen die optreden met leeftijd of pathologie.

Introduction

De ooglens is een flexibel, transparant weefsel aan de voorkant van het oog dat functioneert om licht op het netvlies te focussen. Het vermogen van de lens om te functioneren kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de ingewikkelde architectuur en organisatie 1,2,3,4,5,6. Rondom het lensweefsel bevindt zich het kapsel, een basaalmembraan dat essentieel is voor het behoud van de lensstructuur en biomechanische eigenschappen ^7,8,9. De lens zelf is volledig cellulair en bestaat uit twee celtypen: epitheel- en vezelcellen. De epitheellaag bestaat uit een monolaag van kubusvormige cellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekken¹⁰. Gedurende het hele leven vermenigvuldigen de epitheelcellen zich en migreren ze langs het lenskapsel naar de lensevenaar. Voorste epitheelcellen zijn rustig en geplaveid in doorsnede, en in de buurt van de evenaar van de lens vermenigvuldigen epitheelcellen zich en beginnen ze het differentiatieproces te ondergaan tot nieuwe vezelcellen^11,12. Equatoriale epitheelcellen transformeren van willekeurig opeengepakte cellen in georganiseerde meridionale rijen met zeshoekige cellen. De zeshoekige celvorm wordt gehandhaafd aan de basale zijde van deze differentiërende cellen, terwijl de apicale zijde zich vernauwt en verankert aan het lensdraaipunt of modiolus 4,13,14,15. Naarmate de equatoriale epitheelcellen zich beginnen uit te strekken tot nieuw gevormde vezelcellen, migreren de apicale uiteinden van de cellen langs het apicale oppervlak van de voorste epitheelcellen naar de voorste pool, terwijl de basale uiteinden langs het lenskapsel naar de achterste pool bewegen. Nieuwe generaties vezelcellen overlappen eerdere generaties cellen, waardoor bolvormige schillen van vezels ontstaan. Tijdens het celverlengings- en rijpingsproces veranderen vezelcellen hun morfologie aanzienlijk 11,12,16. Deze vezelcellen vormen het grootste deel van de lensmassa 11,12,16,17,18.

De moleculaire mechanismen die bijdragen aan het tot stand brengen van ingewikkelde lensmicrostructuren, celmorfologie en unieke cellulaire organisatie zijn niet helemaal bekend. Bovendien is de bijdrage van het lenskapsel en de celstructuur aan de algehele lensfunctie (transparantie, lensvormverandering) onduidelijk. Deze relaties worden echter opgehelderd met behulp van nieuwe beeldvormingsmethodologie en kwantitatieve beoordelingen van structurele en cellulaire kenmerken van lenzen 2,4,19,20,21,22. Er zijn nieuwe protocollen ontwikkeld om hele lenzen in beeld te brengen die visualisatie met hoge ruimtelijke resolutie van het lenskapsel, de epitheelcellen en de perifere vezelcellen mogelijk maken. Dit omvat methodologie voor het kwantificeren van capsuledikte, celgrootte, celkerngrootte en circulariteit, meridionale rijvolgorde, vezelcelpakking en vezelcelbreedtes. Deze visualisatie- en beeldkwantificeringsmethoden maken diepgaand morfometrisch onderzoek mogelijk en hebben voordelen ten opzichte van andere visualisatiemethoden (beeldvorming van flatmounts of weefselsecties) door de algehele 3D-weefselstructuur te behouden. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om nieuwe hypothesen te testen en zullen een voortdurende vooruitgang mogelijk maken in het begrip van de ontwikkeling en functie van lenscellen.

Voor de volgende experimenten gebruiken we wildtype en Rosa26-tdTomato muizen tandem dimeer-tomaat (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) in de C57BL/6J achtergrond tussen de leeftijd van 6 en 10 weken, van beide geslachten. De tdTomato-muizen maken visualisatie mogelijk van cellulaire plasmamembranen in levende lenzen via expressie van tdTomato-eiwit dat is gefuseerd met de N-terminale 8 aminozuren van een gemuteerd MARCKS-eiwit dat zich richt op het plasmamembraan via N-terminale myristylatie en interne cysteïne-palmitoylatieplaatsen²³. We gebruiken ook NMIIA^{E1841K/E1841K} muizen²⁴ die oorspronkelijk zijn verkregen van Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Zoals eerder beschreven²⁰, NMIIA^{E1841K/E1841K-muizen} in FvBN/129SvEv/C57Bl6-achtergrond die verlies hebben van CP49 gepareld intermediair filamenteiwit (handhaaft volwassen vezelcelmorfologie en biomechanica van de hele lens), worden teruggekruist met C57BL6/J wildtype muizen. We hebben de nakomelingen gescreend op de aanwezigheid van het wildtype CP49-allel.

Confocale beeldvorming werd uitgevoerd op een confocale fluorescentiemicroscoop met laserscanning met een vergroting van 20x (NA = 0,8, werkafstand = 0,55 mm, 1x zoom), een vergroting van 40x (NA = 1,3 olieobjectief, werkafstand = 0,2 mm, 1x zoom) of een vergroting van 63x (NA = 1,4 olieobjectief, werkafstand = 0,19 mm, 1x zoom). Alle afbeeldingen zijn verkregen met behulp van een gaatjesgrootte, die een bepalende factor is voor de dikte van de optische doorsnede, tot 1 Airy Unit (de resulterende optische diktes worden vermeld in figuurlegenda's). De beelden werden verwerkt met Zen-software. Afbeeldingen werden geëxporteerd naar .tif formaat en vervolgens geïmporteerd in FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Protocol

Muizen zijn gehuisvest in de dierenfaciliteit van de Universiteit van Delaware, gehouden in een pathogeenvrije omgeving. Alle dierproeven, inclusief euthanasie door CO₂ -inhalatie, werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde dierprotocollen door de University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding en beeldvorming van de gehele lensvatting

1. Fixatie van lenzen voor beeldvorming op de hele vatting
   1. Na euthanasie de ogen verwijderen en lenzen ontleden zoals eerder beschreven²⁵. Breng de lenzen na dissectie onmiddellijk over in verse 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO 4-7H₂O; pH 7,4) bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De cellulaire morfologie kan veranderen als lenzen gedurende langere tijd in PBS worden bewaard, daarom wordt aanbevolen om onmiddellijk binnen ~10 minuten na dissectie te fixeren.
   2. Voor beeldvorming van de voorste lens met volledige vatting, fixeert u hele lenzen door ze bij kamertemperatuur onder te dompelen in 0,5 ml vers gemaakte 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS in een microcentrifugebuis. Was de lenzen na 30 min 3x (5 min per wasbeurt) met 1x PBS. Ga verder met stap 1.2 of bewaar in 1x PBS bij 4 °C. Vaste lenzen kunnen maximaal 5 dagen worden bewaard.
   3. Voor beeldvorming van de lens op de volledige vatting van het equatoriale gebied fixeert u hele lenzen door ze bij kamertemperatuur onder te dompelen in 0,5 ml vers gemaakte 4% PFA in 1x PBS in een microcentrifugebuis. Was na 1 uur de lenzen 3x (5 min per wasbeurt) met 1x PBS. Ga verder met stap 1.3 of bewaar in 1x PBS bij 4 °C. Vaste lenzen kunnen maximaal 5 dagen worden bewaard.
2. Hele vatting van het voorste lensgebied (vast of live)
   1. Ga verder met stap 1.2.3 voor beeldvorming van vaste lenzen met volledige vatting.
   2. Voor beeldvorming van levende lenzen met volledige vatting, brengt u de lenzen over in een putje met een plaat met 48 putjes die 1 ml Medium 199 (fenolroodvrij) bevat met 1% antibioticum/antimycoticum. Incubeer lenzen bij 37 °C en 5% CO₂ tot beeldvorming. Vóór de beeldvorming moeten de lenzen gedurende ten minste 10 minuten worden geïncubeerd in een oplossing met fluorescerend gelabeld tarwekiemagglutinine (WGA-640, 1:500) en Hoechst 33342 (1:500) in Medium 199. Ga verder met stap 1.5.
   3. Om het lenskapsel, F-actine en de kernen van vaste lenzen te kleuren, plaatst u de lenzen in een oplossing van 500 μL met WGA-640 (1:500), rhodamine-falloidine (1:50) en Hoechst 33342 (1:500) in permeabilisatie-/blokkeringsbuffer (1x PBS met 0,3% Triton, 0,3% runderserumalbumine (fractie V) en 3% geitenserum) in een microcentrifugebuis. Kleurs lenzen 's nachts bij 4 °C.
   4. Was de lenzen na een nacht incubatie 3x (5 min per wasbeurt) met 1 ml 1x PBS. Ga verder met beeldlenzen.
   5. Om de vaste lens te stabiliseren voor confocale beeldvorming, maakt u lensimmobilisatiedivots in agarose op een beeldvormende schaal zoals eerder beschreven²¹ (Figuur 1).
      1. Verwarm en meng voorzichtig 2% agarose in PBS met behulp van een magnetron tot de oplossing vloeibaar is. Pipetteer 250 μl vloeibaar gemaakte 2% agarose in een schaal met glazen bodem (figuur 1A) en druk de agarose plat over de schaal met behulp van een flexibel plastic dekglaasje (figuur 1B). Zodra de agarose is afgekoeld en volledig gestold, verwijdert u het dekglaasje met een pincet met een fijne punt (Figuur 1C) en gebruikt u een biopsiepons van 3 mm om een gat in de agarose in het midden van de schaal te maken (Figuur 1D).
      2. Verwijder overtollige agarose met een delicaat doekje (Figuur 1E). Houd agaroseschimmel gehydrateerd met 1x PBS en houd op 4 °C tot gebruik. Agarose-schimmels zijn met succes tot 1 week bewaard.
   6. Breng met behulp van een embryopincet de levende of vaste lens voorzichtig over in de kuil in de agarose (Figuur 1F), met ~2 ml 1x PBS (vaste lens) of fenolroodvrij Medium 199 (levende lens), en plaats de schaal vervolgens op een omgekeerde microscooptafel. Om te bevestigen dat de lens zich bevindt met het voorste gebied naar het objectief gericht, visualiseert u de kleuring van de kernen. Als er geen kernen worden waargenomen, kan het achterste gebied naar het doel gericht zijn.
   7. Om de lens om te keren, gebruikt u een gebogen pincet en draait u de lens voorzichtig ~180° zodat het voorste deel naar het objectief is gericht. Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop.
   8. Voor visualisatie van lenscapsules maakt u z-stack-afbeeldingen met behulp van een 40x-objectief met een stapgrootte van 0,3 μm. Verkrijg het eerste beeld vóór het oppervlak van het lenskapsel (aangegeven door WGA-kleuring) en het laatste beeld na het apicale oppervlak van de epitheelcellen. Om epitheelcellen te visualiseren, verkrijgt u z-stack-afbeeldingen met behulp van een 63x-objectief met een stapgrootte van 0,3 μm voor visualisatie van lensepitheelcellen.
      OPMERKING: Deze microscoopparameters maken een adequate driedimensionale (3D) reconstructie van beelden mogelijk, wat essentieel is voor de beeldkwantificering van de dikte van het kapsel of het gebied van de epitheelcellen. Het is ook mogelijk om hechtingen in live lens tdTomato-lenzen in beeld te brengen door langs de monolaag van de epitheelcel te kijken, zoals eerder beschreven⁴.
3. Lens equatoriale epitheel- en vezelcelkleuring
   1. Plaats vaste lenzen in een 0,5 ml oplossing van rhodamine-phalloidine (1:300), WGA-640 (1:250) en Hoechst 33342 (1:500) in permeabilisatie-/blokkerende oplossing (3% BSA, 3% geitenserum en 0,3% Triton) in een microcentrifugebuisje. 's Nachts op 4 °C houden.
   2. Was de lenzen na een nacht incubatie 3x in 1 ml 1x PBS (5 min per wasbeurt).
   3. Creëer lensimmobilisatie agarosewiggen zoals eerder beschreven ^4,10.
      1. Maak in het kort agarosepartjes in schalen met glazen bodem (FD35-100, WPI) door ~5-6 ml gesmolten 2% agarose in 1x PBS in schalen te gieten (Figuur 2A). Zodra de agarose is gestold (Figuur 2B), maak je een driehoekige divot met een scherp mes (Figuur 2C). Verwijder het agarosepartje en doe 1 ml 1x PBS in de agaroseschaal (Figuur 2D).
      2. Zuig eventuele resterende agarose op die achterblijft bij het snijden van de agarose. Per schotel kunnen meerdere wiggen worden gemaakt om op meerdere verschillende maten lenzen te passen (niet afgebeeld). Om de agarosevorm te bewaren, plaatst u 1 ml 1x PBS op de agarosevorm en bewaart u deze op 4 °C. Wedges zijn maximaal 1 week houdbaar.
   4. Plaats de lens met een gebogen pincet in een agarosewig met 1 ml 1x PBS en pas deze zo aan dat het equatoriale gebied van de lens naar beneden is gericht op het microscoopglas boven het confocale objectief (Figuur 2E-F). Om te bevestigen dat het equatoriale gebied scherp is, visualiseert u kernen en zorgt u ervoor dat de kernen in rijen op de evenaar zijn uitgelijnd. De equatoriale epitheelcellen kunnen ook worden geïdentificeerd omdat ze onregelmatig verpakt en gevormd zijn. Ook zijn de meridionale rijcellen nauwkeurig uitgelijnd en zeshoekig gevormd, aangegeven door F-actinekleuring op de celmembranen.
   5. Als kernen in het gezichtsveld willekeurig zijn verpakt, is de voorste kant van de lens naar het objectief gericht. Als kernen niet kunnen worden waargenomen, is de achterkant van de lens hoogstwaarschijnlijk naar het objectief gericht. Als de lens niet op de evenaar zit, heroriënteer de lens dan en gebruik het gebogen pincet om de lens te draaien totdat de nauwkeurig uitgelijnde kernen op de evenaar van de lens worden waargenomen.
   6. Breng de equatoriale epitheel- en vezelcellen van de lens in beeld met behulp van een confocale microscoop met laserscanning (20x objectief, NA = 0,8, stapgrootte 0,5 μm en/of 40x olieobjectief, NA = 1,3, stapgrootte 0,4 μm). Draai de afbeeldingen vóór de z-stack-verzameling, waarin equatoriale epitheelcellen zich bovenaan bevinden, gevolgd door meridionale rij- en vezelcellen er direct onder.

2. Methodologie voor beeldanalyse

1. Meting van de dikte van het lenskapsel
   1. Met behulp van z-stack-beelden verkregen met een 40x objectief (stapgrootte van 0,3 μm) van live tdTomato-lenzen gelabeld met WGA of vaste lenzen gelabeld met WGA en rho-phalloidine, verkrijgt u een optische 2D-projectie in de XZ-weergave van de 3D-reconstructie en slaat u deze op in .tif formaat. Verwerk beelden met Zen-software.
   2. Open XZ slice (.tif)-afbeeldingen in de FIJI ImageJ-software.
   3. Gebruik de rechte lijnfunctie (weergegeven in afbeelding 3A,B) om de dikte van het lenskapsel te meten. Stel de lijndikte in op 50 pixels door Bewerken > Opties > Lijnbreedte te selecteren. Deze lijndikte werd empirisch bepaald om een hoge signaal-ruisverhouding te bieden met de microscoopinstellingen. De optimale lijndikte kan verschillen bij andere microscopen/microscoopinstellingen of bij gebruik van lenzen van andere soorten. Trek vervolgens een lijn van het bovenoppervlak van de capsule tot onder het basale gebied van de epitheelcellen.
   4. Sla de regel op als een interessegebied door op Ctrl + T te drukken.
   5. Scheid kanalen in tabbladen voor afbeeldings-, kleur- en gesplitste kanalen.
   6. Meet de intensiteit langs de lijn voor het capsulekanaal door op Ctrl + K te drukken.
   7. Zet in een spreadsheet intensiteitswaarden uit als functie van de afstand en bepaal intensiteitspieken voor de capsule en F-actine, die respectievelijk het capsuleoppervlak en het basale gebied van epitheelcellen vertegenwoordigen. Op de x-as staat de lijnafstand.
   8. Bereken vervolgens de dikte van de capsule door de afstand tussen de pieken van de fluorescerende intensiteit van de capsule en het epitheel te bepalen (Figuur 3C, D).
2. Analyse van het celgebied
   1. Met behulp van z-stack-beelden die zijn verkregen met een 63x objectieflens (NA = 1,4; stapgrootte van 0,3 μm) op live tdTomato-lenzen of vaste lenzen met het label phalloidine, analyseert u een XY-weergavesegment van een z-stack confocaal beeld dat overeenkomt met waar het middelste (laterale) gebied van epitheelcellen scherp is. Merk op dat de laterale membranen zichtbaar zijn met behulp van de tdTomato membraankleurstof of door falloidine te visualiseren die aanwezig zijn op de laterale celmembranen.
      OPMERKING: Vanwege de kromming van de lens (zoals te zien in een XZ-weergave; Figuur 4A-C), zullen niet alle epitheelcellen scherp zijn in het beeld. Het middelste gebied van het epitheel komt overeen met het gebied waar zowel de laterale membranen van de cel (Figuur 4D-E) als de kernen (Figuur 4G-I) scherp zijn.
   2. Exporteer de afbeelding als een .tif en open deze in FIJI ImageJ.
   3. Als u de schaal in FIJI ImageJ wilt instellen voor analyse, gebruikt u het lijngereedschap om een lijn te maken die de lengte heeft van een schaalbalk uit de confocale afbeelding.
   4. Noteer de pixellengte van de lijn en de lengte van de schaalbalk. Ga naar Analyseren in het werkbalkmenu en selecteer Schaal instellen. Voer het aantal pixels in dat de lengte van de lijn is in Afstand in pixels en voer in de Bekende afstand de bekende lengte van de schaalbalk in.
   5. Gebruik de tdTomato- of rhodamine-phalloidine-kleuring als indicatie van celgrenzen en schets handmatig een populatie cellen die scherp zijn in de afbeelding met behulp van het veelhoekige gereedschap. Traceer alleen cellen waar laterale membranen zichtbaar zijn (Figuur 4E) en vermijd het traceren van gedeeltelijk zichtbare cellen (d.w.z. aan de rand van de afbeeldingen). Sla ROI op door op Ctrl+T te drukken. Ga naar Bewerken in het werkbalkmenu en selecteer Buiten wissen. Meet nu het totale celoppervlak (ROI) door op Ctrl + M te drukken in FIJI ImageJ.
   6. Bereken het gemiddelde celoppervlak door het ROI-gebied te delen door het totale celnummer. Een eenvoudige manier om het aantal cellen te bepalen is door het aantal kernen te tellen. Ga naar het kernkanaal (blauw). Selecteer in het menu ROI het opgeslagen ROI-overzicht van cellen (Afbeelding 4G). Buiten de ROI wissen door naar Bewerken te gaan en vervolgens op Buiten wissen te klikken (Figuur 4H). Gebruik het gereedschap Multi-point om de kernen te tellen door op individuele kernen te klikken.
3. Analyse van cellulair nucleair gebied en vorm
   1. Analyseer voor analyse van het kerngebied en de vorm een optische doorsnede van een XY-vlakweergave van een confocaal beeld van een z-stack dat overeenkomt met waar het middelste (laterale) gebied van tdTomato-epitheelcellen scherp is. Analyseer een z-stack slice van een confocaal beeld waarbij het nucleaire gebied het grootst is (Figuur 5A); Dit vertegenwoordigt het middelste deel van de kernen.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat vanwege de kromming van de lens niet alle kernen scherp zijn, zoals te zien is in de XZ-weergave (Afbeelding 4G en Afbeelding 5A).
   2. Selecteer een subpopulatie van kernen die in focus zijn en sla een ROI op.
   3. Gebruik de functie Buiten wissen . Trek binnen de ROI met behulp van het selectiegereedschap uit de vrije hand (vierde menuknop van links) zorgvuldig de grenzen van de kernen over (Figuur 5B). Sla elk nucleair spoor op in het ROI-venster door op Ctrl+T te drukken. Omtrek alleen kernen waar de volledige kernen te zien zijn, en de kernen elkaar niet raken.
   4. Zodra alle kernen zijn omlijnd, meet u het nucleaire oppervlak en de vorm (d.w.z. circulariteit) van individuele cellen door op Ctrl+M te drukken.
   5. Kopieer en plak gegevens in een spreadsheet en bereken de gemiddelde nucleaire oppervlakte en circulariteit (Figuur 5C).
4. Meridionale rij epitheliale pakking
   1. Om de meridionale rijstoornis te meten, maakt u beelden met behulp van een 20x objectief (stapgrootte van 0,5 μm).
   2. Identificeer het draaipunt / modiolus van de lens op afbeeldingen. Het draaipunt is het gebied waar de apicale uiteinden van langwerpige epitheelcellen samentrekken om een ankerpunt te vormen tijdens de initiële differentiatie en verlenging van vezelcellen op de evenaar. Identificeer het draaipunt op basis van de intensiteit van de heldere F-actine (aangegeven door de pijlpunt in de XZ-weergave in figuur 6A; aangegeven door een rode stippellijn in figuur 6B) en de verandering in de cellulaire organisatie in een enkele optische sectie in de XY-weergave.
      OPMERKING: Bovendien is F-actinekleuring van zowel de basale als de apicale gebieden van epitheelcellen zichtbaar boven het draaipunt, terwijl alleen het basale gebied van de verlengde cellen zichtbaar is onder het draaipunt (Figuur 6A). De epitheelcellen boven de draaipuntlijn zijn onregelmatig opeengepakt en hebben de neiging rozetten te vormen, terwijl de vezelcellen onder het draaipunt in parallelle rijen zijn gerangschikt, aangegeven door heldere F-actinekleuring op het membraan (Figuur 6B).
   3. Zodra het draaipunt is geïdentificeerd bij muizen van 2 maanden oud, selecteert u het enkele optische gedeelte ~4.5-5 μm perifeer van het draaipunt (in de richting van het lenskapsel) in het XY-vlak. Deze afstand is geselecteerd op basis van de waarneming dat alle kernen van de meridionale rijcellen in muizen van 2 maanden oud scherp zijn wanneer ze ~5 μm perifeer zijn van het draaipunt. Sla de enkele optische sectie (.tif op. Open de afbeelding op FIJI.
      OPMERKING: Deze analyse is alleen uitgevoerd op muizen van 2 maanden oud en daarom kan niet worden geconcludeerd of deze afstand verandert met de leeftijd.
   4. Voordat u een beeldanalyse uitvoert, stelt u de schaal in ImageJ in op μm met behulp van stap 2.2.2.
   5. Omlijn handmatig de volledige meridionale rijgebieden met behulp van het lijngereedschap uit de vrije hand (interessegebied/ROI) door de nucleaire uitlijning te identificeren, zoals weergegeven in figuur 7A. Sla ROI op door op Ctrl+T te drukken. Ga naar Bewerken in het werkbalkmenu en selecteer Buiten wissen. Meet het totale celoppervlak (ROI) door op Ctrl + M te drukken in FIJI ImageJ.
   6. Identificeer alle gebieden van stoornis die worden aangegeven door F-actinekleuring door te schetsen met behulp van het lijngereedschap uit de vrije hand in FIJI ImageJ. Criteria voor ongeordende regio's zijn onder meer vertakking van rijen, onregelmatige pakking en verkeerde uitlijning van rijen (figuur 7B), zoals eerder getoond²⁰.
   7. Meet het omlijnde ongeordende gebied/gepatcht door op Ctrl + M te drukken in FIJI ImageJ. Tel het totale ongeordende gebied op in een spreadsheet.
   8. Deel het totale ongeordende gebied door het ROI-gebied en vermenigvuldig dit vervolgens met 100 om een percentage ongeordend gebied te krijgen. Als er geen stoornis wordt waargenomen, plaats dan een waarde van 0% voor het ongeordende gebied.
5. Meridionale rij aantal aangrenzende cellen
   1. Om het aantal naburige cellen te meten, gebruikt u met F-actine gekleurde beelden die zijn verkregen met een 40x olie-objectief (stapgrootte van 0,4 μm).
   2. Identificeer een optische doorsnede (XY-vlak) in het basale gebied van de meridionale rijcellen naar binnen vanaf het lenskapsel waar F-actine is verrijkt rond de gehele omtrek van de meridionale rijcellen, alle meridionale rijcellen zijn scherp en bevinden zich op hetzelfde vlak.
   3. Tel het aantal aangrenzende cellen dat elke meridionale rijcel heeft (Figuur 8). Meet het gemiddelde percentage cellen met zes aangrenzende cellen in een spreadsheet.
      OPMERKING: Bepaal het aantal aangrenzende cellen met een 20x doelstelling. Het is echter aanzienlijk gemakkelijker om de zeshoekige vorm te observeren met een 40x objectief.
6. Beeldanalyse van equatoriale vezelcellen
   1. Maak confocale foto's van rhodamine falloidine gekleurde lenzen met een 20x objectief (0,5 μm stapgrootte).
   2. Identificeer het draaipunt zoals aangegeven in stap 2.4.2. Zodra het draaipunt is geïdentificeerd, selecteert u een enkele optische sectie. Voor standaardisatiedoeleinden en om lenzen te vergelijken, kwantificeert u de breedte van de vezelcellen ~10 μm naar binnen vanaf het draaipunt in het XY-vlak (Figuur 9A).
   3. Exporteer RAW-afbeeldingen naar FIJI ImageJ. Trek in FIJI ImageJ een lijn (meestal ~300-400 μm lang) over verschillende aangrenzende vezelcellen om de afstand tussen met F-actine gekleurde pieken te meten (lijnscananalyse; Figuur 9A; roze lijn).
   4. Verkrijg de fluorescerende intensiteit over de lijnscanafstand in FIJI door op Ctrl+K te drukken. Exporteer vervolgens gegevens naar de spreadsheet om de interpiekafstand te berekenen (voorbeeld weergegeven in figuur 9A-B). Dit komt overeen met vezelcelbreedtes.

Results

Voorste lenskapsel, epitheelcelgebied en nucleair gebied
Om de dikte van het lenskapsel te analyseren, hebben we lenscapsules, in levende of vaste lenzen, gekleurd met WGA. We identificeerden lensepitheelcellen door membranen te labelen met tdTomato in levende lenzen (Figuur 2A), of via rhodamine-phalloidinekleuring voor F-actine op de celmembranen in vaste lenzen (Figuur 2B). In een orthogonale (XZ) projectie stelt kleuring voor WGA en tdTomato/rhodamine-phalloidine ons in staat om piek-tot-pieklijnscananalyse van fluorescentie-intensiteit uit te voeren. De belangrijkste piek in het WGA-kanaal geeft het kapseloppervlak aan, terwijl de grote piek in het tdTomato/rhodamine-phalloidine-kanaal het basale gebied van epitheelcellen aangeeft. Door de afstand tussen deze pieken te berekenen, kunnen we kapseldikte verkrijgen. Uit de lijnscananalyse blijkt dat capsules van een 9 weken oude muizen een dikte hadden van 11,2 μm, en capsules van een 9 weken oude muizen vaste lens een dikte hadden van 12,5 μm. Deze waargenomen capsulediktes zijn representatief voor eerdere bevindingen ^2,4.

Beeldvorming op het geheel van tdTomato-gelabelde transgene muizenlenzen (of met rhodamine-phalloidine gekleurde lenzen; niet afgebeeld) maakt live visualisatie van de morfologie van epitheelcellen mogelijk. De orthogonale (XZ) projectie biedt een zijaanzicht van de epitheelcel van de lens, terwijl het vlakke (XY) beeld op de laterale regio's visualisatie van de epitheliale veelhoekige vorm mogelijk maakt. Bij gezonde brillenglazen zien we geen openingen tussen cellen. We kunnen het gemiddelde celoppervlak berekenen door een populatie cellen in een afbeelding te traceren en het gebied te delen door het aantal cellen binnen de ROI. Het aantal cellen wordt bepaald door het aantal Hoechst-gekleurde kernen in een gegeven ROI te tellen. De analyse toont een gemiddeld celoppervlak van 260^μm2 aan, wat in overeenstemming is met eerdere studies ^2,4.

Hoechst-kleuring van kernen maakt het ook mogelijk om de nucleaire morfometrie van lensepitheelcellen in epitheelcellen te onderzoeken. De orthogonale (XZ) projecties maken een zijaanzicht van kernen mogelijk. De vlakke (XY) weergave toont de cirkelvormige/ellipsoïde vormen van de kernen. Het traceren van kernen maakt het mogelijk om het kernoppervlak van individuele cellen en andere vormparameters zoals circulariteit te berekenen. De analyse toont een gemiddelde nucleaire oppervlakte van 64^μm2 met een gemiddelde circulariteit van 0,8. Cirkelvormige waarden dicht bij 1 duiden op een perfecte cirkel, terwijl waarden die 0 naderen duiden op een meer langwerpige morfologie.

Equatoriale epitheelcelverpakking, zeshoekige vezelcelpakking en vezelcelbreedtes
De vlakke (XY) weergave van het equatoriale gebied van de lens toont zeshoekige en regelmatig opeengepakte lensepitheelcellen die samenkomen op het draaipunt. Het draaipunt is waar de apicale uiteinden van verlengde epitheelcellen samentrekken om een ankerpunt te vormen tijdens de initiële vezelceldifferentiatie en elongatie op de evenaar 4,13,14,15 (Figuur 6B, aangegeven door een rode stippellijn). Het draaipunt kan worden gelokaliseerd op basis van verhoogde F-actinekleuring en vormt een doorlopende lijn die de equatoriale epitheelcellen en vezelcellen scheidt (Figuur 6B, rode stippellijn). De F-actinekleuring op de celmembranen vertoont ook veranderingen in celvorm, waarbij cellen onder het draaipunt nauwkeurig zijn uitgelijnd en in parallelle rijen zijn gerangschikt (Figuur 6). Celkernen zijn ook uitgelijnd onder het draaipunt.

Om de meridionale rij-epitheelcellen en vezelcellen van de lens te visualiseren, wordt een afbeelding 4,5-5 μm perifeer van het draaipunt (in de richting van het lenskapsel) in het XY-vlak, waar het basale gebied van meridionale rijcellen in beeld is, geselecteerd zoals eerder beschreven²⁰. Om de meridionale rijstoornis te meten, wordt een interessegebied (ROI) geschetst (Figuur 7A; geel kader). Het gebied van de ROI in de wildtype-lensafbeelding is 15.833^μm2. Omdat er geen waarneembare stoornis is, is het percentage wanordegebieden 0. De cruciale rol die niet-spiermyosine IIA (NMIIA) speelt bij het hexagonaal verpakken van cellen met behulp van muizen met een NMIIA-E1841K-mutatie is eerder beschreven²⁰. Figuur 7A toont een representatief equatoriaal beeld van de NMIIA^{E1841K/E1841K-lens} om de meridionale rijcelstoornis aan te tonen. De ROI van de meridionale rij was 20.757 μm2. Vervolgens werd het totale gebied van ongeordende plekken getraceerd. Het totale gebied van de stoornis was 3.185^μm2. Het berekende percentage wanorde werd vastgesteld op 15,3% (ongeordend gebied x 100/totale ROI; Figuur 7B). Dit percentage ongeordende gebied ligt binnen het bereik in een eerdere studie²⁰.

Vervolgens werd een onderzoek naar hexagonale pakking in wild-type meridionale rijcellen gedemonstreerd²⁰. Omdat F-actine is verrijkt rond de gehele omtrek van meridionale rijcellen en op alle zes hoekpunten van de basale gebieden van celmembranen in wild-type (d.w.z. NMIIA^+/+) lenzen, werd F-actinekleuring gebruikt om celvormen en verpakkingsorganisatie te beoordelen. In representatieve afbeelding 1 werden cellen gelabeld en werd het aantal aangrenzende cellen rond elke cel geteld. In afbeelding 1 hebben alle tien cellen zes aangrenzende cellen, wat suggereert dat deze cellen zijn gerangschikt in een honingraatverpakkingsorganisatie (Figuur 8). Daarentegen hebben acht van de 10 cellen (80% van de cellen) zes aangrenzende cellen in afbeelding 2 die aangeven dat de cellen onregelmatig verpakt zijn (Figuur 8).

Ten slotte werden, om de breedte van de vezelcellen te meten, de perifere vezelcellen onderzocht die zich ~10 μm naar binnen van het draaipunt bevonden in vaste wild-type lenzen gelabeld met rhodamine-phalloidine (Figuur 9A)^2,4. Merk op dat het ook mogelijk is om vezelcelbreedtes te meten met behulp van levende tdTomato-muizen, maar het signaal van lenzen die heterozygoot zijn voor tdTomato is meestal zwak in de equatoriale regio's. Daarom wordt het gebruik van muizen aanbevolen die homozygoot zijn voor tdTomato, omdat is vastgesteld dat ze een sterkere fluorescentie hebben (niet afgebeeld). De afstand tussen de met F-actine gekleurde celgrenzen met behulp van lijnscananalyse werd gemeten zoals eerder beschreven om de vezelcelbreedte ^2,4 aan te geven (Figuur 9B). Uit deze analyse bleek dat de gemiddelde interpiekafstand in wild-type lenzen 11,45 ± 2,11 μm is (N=117 vezelcellen van 4 verschillende muislensafbeeldingen, Figuur 9B).

Figuur 1: Stappen om agarosedivot te maken om de lens te immobiliseren tijdens beeldvorming. (A) Met behulp van een glazen bodemschaal, pipet vloeibaar 2% agarose. (B) Druk plat met een flexibele afdekglaasje en (C) verwijder na afkoeling met een pincet met een fijne punt. (D) Maak voor de divot een gat met een biopsiepons van 3 mm. (E) Zuig de resterende agaro's op, spoel ze af met PBS, veeg het oppervlak schoon met een pluisvrije tissue. (F) Monteer de hele lens voorzichtig in de divot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stappen om agarosedivot te maken voor het afbeelden van equatoriale epitheel- en vezelcellen van de lens. (A) Giet 2% gesmolten agarose in de weefselkweekschaal. (B) Koel de agarose af bij kamertemperatuur totdat deze volledig gestold is. (C) Maak met een scherp mes een driehoekige divot. (D) Doe 1 ml van 1x PBS in het weefselkweekschaaltje. (E) Plaats de ontlede lens in de wig met (F) de lens steunend op de evenaar ingeklemd tussen de agarosewanden (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bepaling van de dikte van het lenskapsel. Sagittale (X, Z-vlakweergave) optische doorsneden van reconstructies van confocale z-stapels van (A) levende en (B) vaste lenscapsules. Fluorescerende intensiteit van lijnscan van (C) live en (D) vaste lenzen toont een enkele WGA (groene) piek die overeenkomt met het bovenoppervlak van de capsule en het basale gebied van epitheelcellen (rood) grenzend aan de capsule. De afstand tussen de twee pieken wordt gemeten om de dikte van de capsule te kwantificeren. Beelden verkregen met behulp van een 40x olieobjectief met een pinhole van 1 luchtige eenheid, resulterend in optische secties van 1,0 μm en 1,2 μm in respectievelijk de tdTomato/Rhodamine-phalloidine- en WGA-kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kwantificering van het epitheelceloppervlak. (A) X, Z-vlakaanzicht van de lensepitheelcellen gemarkeerd met (B) tdTomato voor celmembranen en (C) Hoechst voor kernen. (D) X, Y-vlakweergave van het middelste gebied van lensepitheelcellen. (E) tdTomato-signaal wordt gebruikt als leidraad om een interessegebied te definiëren dat overeenkomt met een groep cellen die scherp zijn. (F) De oppervlakte van het afgebakende gebied wordt bepaald. (G) Hoechst-kleuring voor kernen wordt gebruikt om het aantal cellen binnen het gedefinieerde gebied te bepalen. (H) Het aantal kernen wordt geteld met behulp van (I) FIJI ImageJ's multipoint tool. Om het gemiddelde celoppervlak te berekenen, deelt u de totale oppervlakte van het gedefinieerde interessegebied door het totale aantal cellen. Beelden verkregen met behulp van een 63x olie-objectief met een 1 luchtige eenheid pinhole, resulterend in optische secties van 0,7 μm en 1,0 μm in respectievelijk de Hoechst- en tdTomato-kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Bepaling van het kernoppervlak en de vorm ervan. (A) XY-vlakaanzicht van het middelste gebied van kernen. (B) Er werd een interessegebied gedefinieerd waar kernen centraal staan. Kernen binnen de ROI worden geschetst. (C) De oppervlakte en circulariteit van kernen van individuele cellen werden getabelleerd en gemiddelden voor oppervlakte en circulariteit werden berekend. Foto's gemaakt met behulp van een 63x olie-objectief met een 1 luchtig gaatje in de eenheid, resulterend in een optische doorsnede van 0,7 μm in het Hoechst-kanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Identificatie van het draaipunt van de lens. F-actine en kernen kunnen worden gebruikt om het draaipunt en de meridionale rijen te identificeren. (A) XZ-weergave toont verrijkte falloidinekleuring voor F-actine die overeenkomt met het draaipunt. (B) Enkelvoudig optisch XY-vlakzichtgedeelte met het lensdraaipunt scherpgesteld. Hoechst-kleuring voor kernen laat zien dat de kernen boven het draaipunt onregelmatig opeengepakt zijn, terwijl de kernen onder het draaipunt precies zijn uitgelijnd (rechtsboven). Phalloidinekleuring voor F-actine laat zien dat de cellen boven het draaipunt onregelmatig gevormd zijn, terwijl de cellen onder het draaipunt in parallelle rijen zijn verpakt (linksonder). De rode stippellijn geeft de locatie van het draaipunt aan. Beelden verkregen met behulp van een 20x-objectief met een pinhole van 1 luchtige eenheid, resulterend in optische secties van 1,5 μm, 2,0 μm en 2,2 μm in respectievelijk de Hoechst-, Rhodamine-Phalloidine- en WGA-640-kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bepaling van meridionale rijstoornis. (A) Enkele XY-vlakweergave optische doorsnede van de wildtype en NMIIA^{E1841K/E1841K} meridionale rijcellen op ~5 μm afstand van het draaipunt (in de richting van het lenskapsel). De volledige meridionale rijcellen zijn blauw omlijnd op basis van nucleaire uitlijning. F-actine (rood) kleuring in wildtype lens laat zien dat meridionale rijcellen precies zijn uitgelijnd zonder tekenen van wanorde (0%). Een representatief geordend gebied in wildtype wordt omlijnd (oranje). In lenzen met ongeordende cellen schetsen we de ongeordende regio's (geel). (B) Hoge vergroting van het geordende gebied ten opzichte van wildtype (oranje kader in A). (C) Hoge vergroting van ongeordende gebieden die verschillende soorten wanorde vertonen, waaronder (I) vertakking van rijen, (II) onregelmatige celvorm en verlies van honingraatpakking, en (III) verkeerde uitlijning van rijen. Afbeeldingen van de NMIIA^{E1841K/E1841K-lens} tonen een 15,3% meridionale rijcelstoornis. Beelden verkregen met behulp van een 20x-objectief met een gaatje van 1 luchtige eenheid, resulterend in optische secties van respectievelijk 1,5 μm en 2,0 μm in de Hoechst- en Rhodamine-Phalloidine-kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Analyse van de honingraatpakking van de meridionale rijcellen van de lens. (A) Enkelvoudige optische XY-secties van meridionale rijcellen gekleurd met rhodamine-phalloidine voor F-actine. Afbeeldingen met een lage vergroting (bovenste paneel) tonen de cellen die worden geëvalueerd (genummerd in roze). Het geel omlijnde gebied wordt vergroot (onderste paneel). De gele Romeinse cijfers zijn de tellingen van aangrenzende cellen. Afbeelding 1 toont cellen die allemaal zeshoekig van vorm zijn, elk met 6 aangrenzende cellen. Afbeelding 2 heeft onregelmatigheden, waarbij celnummer 1 en 5 respectievelijk 5 en 7 aangrenzende cellen hebben. (B) De gegevens worden geregistreerd en getabelleerd met het berekende percentage zeshoekige cellen. Beelden verkregen met behulp van een 40x objectief met een 1 luchtige eenheid pinhole resulterend in een optische doorsnede van 1,0 μm in het Rhodamine-Phalloidine-kanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Analyse van de breedte van de vezelcellen. (A) Enkelvoudig optisch XY-weergavegedeelte van de lensvezelcellen ~10 μm vanaf het draaipunt. Cellen werden gekleurd met rhodamine-phalloidine voor F-actinevisualisatie bij de celmembranen. Over een aantal vezelcellen wordt een lijn (roze; streepje) getrokken. (B) Representatieve lijnscan van F-actine-intensiteiten als functie van de afstand. De interpiekafstand vertegenwoordigt de breedte van de vezelcel. Beelden verkregen met behulp van een 40x objectief met een 1 luchtige eenheid pinhole resulterend in een optische doorsnede van 1,0 μm in de rhodamine-phalloidinekanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De beschreven protocollen maken visualisatie met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk van perifere lensstructuren en cellen in de voorste en equatoriale regio's van de lens. In deze studie werden methoden getoond voor de visualisatie van perifere lensstructuren met behulp van intacte (onder spanning staande of vaste) lenzen waarbij de algehele 3D-lensarchitectuur behouden blijft. Daarnaast werden eenvoudige methoden voor morfometrische kwantitatieve analyse met behulp van openbaar beschikbare FIJI ImageJ-software aangeboden. De hele visualisatie- en kwantificeringsmethoden voor de montage zijn in eerdere studies gebruikt. Deze methoden stelden ons in staat om de reactie van het voorste kapsel en de cellen op lensvormverandering of veroudering te begrijpen ^2,4. Deze methoden zijn ook gebruikt om equatoriale vezelcelexpansie als gevolg van lensvormverandering of veroudering te onderzoeken ^2,4 en om de rol van NMIIA te bepalen bij het vaststellen van precieze zeshoekige vormen en perifere vezelcelorganisatie²⁰.

Beeldvorming met volledige montage maakt beeldvorming met hoge ruimtelijke resolutie en gezichtsweergave van de lensstructuur mogelijk. In het voorste lensgebied is beeldvorming met volledige montage voordelig ten opzichte van beeldvorming met platte montage door schade te voorkomen die de integriteit van de kapselstructuur en/of de cellulaire morfologie van het epitheel kan veranderen. Bovendien blijft de interface tussen epitheel- en vezelcellen behouden. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van de visualisatie van lenssecties, aangezien beeldvorming op het gezicht een grotere ruimtelijke resolutie biedt en analyse mogelijk maakt van het epitheelcelgebied en het nucleaire gebied/de vorm van het geselecteerde gebied (d.w.z. mid-lateraal, zoals hier weergegeven) of andere celgebieden. Bovendien maken de beeldvormingsmethoden het mogelijk om morfologische kenmerken op specifieke punten langs de equatoriale regio's van de lens te kwantificeren, waardoor visualisatie van zeshoekige vormen, meridionale rijcelpakking, draaipunt en vezelcelbreedtes mogelijk wordt, wat niet gemakkelijk haalbaar zou zijn via beeldvormende lenssecties vanwege een gebrek aan ruimtelijke resolutie en weefselvervorming die kan optreden tijdens het doorsnijden.

De geschetste protocollen maken het ook mogelijk om levende lenzen in beeld te brengen om specifieke lensstructuren en cellen in de loop van de tijd te volgen. Het beeldvormingsprotocol voor levende lenzen speelde een belangrijke rol in een eerdere studie, waarbij herhaalde metingen van de dikte van het kapsel en het epitheelcelgebied van een subpopulatie cellen van dezelfde lens vóór en na lenscompressie om lensafplatting te induceren werden uitgevoerd⁴. Er werd vastgesteld dat lenscompressie een afname van de dikte van het kapsel en een toename van het epitheelcelgebied veroorzaakte. Vanwege de aanzienlijke variatie in de dikte van het kapsel en het epitheelceloppervlak tussen individuele lenzen en de omvang van de effecten op deze parameters veroorzaakt door lenscompressie, zou het moeilijk zijn om verschillen te detecteren als een onafhankelijk meetontwerp zou worden gebruikt (d.w.z. het vergelijken van individuele niet-gecomprimeerde lenzen versus individuele gecomprimeerde lenzen). Met behulp van de live beeldvormingsmethoden is beeldvorming met volledige montage uitgevoerd op live muislenzen die LifeACT-GFP²⁶ endogeen tot expressie brengen om F-actine in epitheelcellen²² te visualiseren, waardoor de reorganisatie van F-actine in levende epitheelcellen kan worden gevolgd.

Terwijl de geschetste protocollen zijn ontwikkeld voor het afbeelden van muizenlenzen en kunnen worden aangepast om lensstructuren bij andere soorten te visualiseren, zijn de kleuringsprotocollen om lens te visualiseren voor zowel anterieure als equatoriale perifere structuren in andere knaagdierlenzen (rat, cavia) en in andere zoogdierlenzen (koe, makaak en mens; gegevens niet getoond). Visualisatie van structuren in grotere lenzen vereist langere fixatie (4% PFA, op ijs, 4 uur), blokkering (1 uur) en kleuring ('s nachts, 4 °C). Merk op dat de beeldvorming bij verschillende soorten alleen werd uitgevoerd op vaste lenzen. Live beeldvorming van lenzen van andere soorten kan een uitdaging zijn, aangezien het live beeldvormingsprotocol lenzen gebruikt van transgene muizen die fluorogene eiwitten tot expressie brengen. Daarom kan deze beeldvorming beeldlenzen van andere soorten uitsluiten waar genetische modificaties niet gebruikelijk zijn. We zijn echter in staat geweest om live visualisatie van lensepitheelcelmembranen of F-actine uit te voeren door muizenlenzen vooraf te kleuren met respectievelijk de lipofiele sonde, FM4-64 of een F-actinebindingssonde, SiR-Jasplakinolide (SiR-actine), (niet afgebeeld). Het is mogelijk om dergelijke sondes te gebruiken om levende lenzen van andere soorten in beeld te brengen. Voorzichtigheid is echter geboden bij het gebruik van dergelijke sondes om off-target effecten te voorkomen; SiR-Jasplakinolide kan bijvoorbeeld leiden tot een veranderde F-actinedynamiek²⁷. Een andere beperking van de kleuringsmethoden, of het nu gaat om onder spanning staande of vaste lenzen, is dat dergelijke sondes een beperkte penetratie hebben. Daarom is beeldvorming beperkt tot perifere regio's. Het is mogelijk om binnenste regio's (d.w.z. diepe vezelcellen) in beeld te brengen met behulp van lenzen van tdTomato transgene muizen⁴, die opnieuw afhankelijk zijn van de transgene expressie van fluorogene eiwitten. De expressie moet ook hoog genoeg zijn voor heldere signalen in diepe vezelcellen.

Desalniettemin hebben de geschetste protocollen een effectieve morfologische kwantificering van perifere lenskenmerken mogelijk gemaakt ^2,4,20. De kwantificeringsmethoden zijn effectief en maken gebruik van open-source, openbaar beschikbare FIJI ImageJ-software. Hoewel handmatige traceringstools werden gebruikt om interessante regio's te identificeren, is het misschien mogelijk om de identificatie van interessante regio's te automatiseren. Automatisering kan zo eenvoudig zijn als het toepassen van fluorescerende drempels om het contrast te verbeteren voor op FIJI ImageJ gebaseerde identificatie van bepaalde structuren (d.w.z. kerngrenzen), of complexere machine learning-algoritmen om verschillen in celvorm te detecteren (d.w.z. onregelmatige epitheel- of vezelcelvormen). Voor een complexere analyse kunnen gespecialiseerde plug-ins of beeldvormingssoftware nodig zijn. Gespecialiseerde plug-ins of software kunnen het ook mogelijk maken om 3D-volumetrische morfologische metingen te verkrijgen van verworven z-stacks. Hoewel de beschreven kwantificeringsmethoden gemakkelijk toegankelijk, kosteneffectief en geschikt zijn voor veel nuttige uitkomstmaten ^2,4,20, zou het beeldvormingsprotocolplatform, in combinatie met geavanceerde software-analyse, een schat aan aanvullende morfologische metingen kunnen opleveren voor toekomstige studies.

De lens is een ingewikkeld biologisch weefsel met gespecialiseerde functies die afhankelijk zijn van locatie- en diepte-afhankelijke geometrieën van de cellen en de bijbehorende structuren. Het gebruik van de beeldvormingsprotocollen en kwantificeringsmethoden die hier worden gedemonstreerd, zal een beter begrip mogelijk maken van hoe lensstructuren en de complexe organisatie van de lens tot stand komen. Bovendien zullen de beeldvormingsprotocollen en kwantificeringsmethoden helpen bij het afbakenen van de relaties tussen lensstructuur en -functies.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R