Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66019

⸱

2 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latvian Biomedical Research and Study Centre, 2Institute of Solid-State Physics, University of Latvia, 3Cellbox labs LTD, Atari, 4Faculty of Materials Science and Applied Chemistry, Institute of General Chemical Engineering, Riga Technical university

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Samenvatting

Extracellulaire blaasjes (EV's) hebben een enorm potentieel voor verschillende biomedische toepassingen, waaronder diagnostiek, medicijnafgifte en regeneratieve geneeskunde. Desalniettemin brengen de huidige methodologieën voor het isoleren van EV's aanzienlijke uitdagingen met zich mee, zoals complexiteit, tijdsbesteding en de behoefte aan omvangrijke apparatuur, wat hun klinische vertaling belemmert. Om deze beperkingen aan te pakken, wilden we een innovatief microfluïdisch systeem ontwikkelen op basis van cyclisch olefine-copolymeer-off-stoichiometrie-thiol-een (COC-OSTE) voor de efficiënte isolatie van EV's uit monsters met een groot volume op een continue manier. Door gebruik te maken van scheiding op basis van grootte en drijfvermogen, bereikte de technologie die in deze studie werd gebruikt een aanzienlijk smallere grootteverdeling in vergelijking met bestaande benaderingen van urine- en celmediamonsters, waardoor het mogelijk werd om in toekomstige toepassingen specifieke EV-groottefracties te richten. Ons innovatieve COC-OSTE microfluïdische apparaatontwerp, dat gebruik maakt van gespleten asymmetrische flow field-flow fractioneringstechnologie, biedt een eenvoudige en continue EV-isolatiebenadering voor monsters met een groot volume. Bovendien biedt het potentieel voor massaproductie van dit microfluïdische apparaat schaalbaarheid en consistentie, waardoor het haalbaar wordt om EV-isolatie te integreren in routinematige klinische diagnostiek en industriële processen, waar hoge consistentie en doorvoer essentiële vereisten zijn.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn van cellen afgeleide membraangebonden deeltjes die bestaan uit twee hoofdtypen: exosomen (30-200 nm) en microvesikels (200-1000 nm)1. Exosomen vormen zich door naar binnen knopen van het endosomale membraan in een multivesiculair lichaam (MVB), waarbij intraluminale blaasjes (ILV's) vrijkomen in de extracellulaire ruimte bij fusie met het plasmamembraan1. Microvesikels daarentegen worden gegenereerd door uitwendige knopvorming en splijting van het celmembraan2. EV's spelen een cruciale rol in intercellulaire communicatie door eiwitten, nucleïnezuren, lipiden en metabolieten te transporteren, die de fysiologische toestand van de cel weerspiegelen, waaronder groei, angiogenese, metastase, proliferatie en therapieresistentie3. Als gevolg hiervan zijn ze naar voren gekomen als veelbelovende biomarkers en therapeutische doelen voor ziekten, waaronder kanker, wat hun potentieel in diagnostiek en medicijnafgiftesystemen benadrukt4.

Om EV's volledig te benutten in ziektediagnostiek en therapieën, is efficiënte isolatie van verschillende biovloeistoffen cruciaal5. Veelgebruikte methoden zijn ultracentrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), filtratie en immuno-isolatie6. UC is een veelgebruikte techniek, maar kan deeltjes met een vergelijkbare dichtheid opleveren die geen EV's zijn en EV-aggregaten kunnen genereren7. SEC heeft aan populariteit gewonnen vanwege het vermogen om monsters met een hogere zuiverheid te leveren door deeltjes uit te sluiten op basis van grootte in plaats van dichtheid8. Een zorgvuldige selectie van de juiste poriegrootte voor de SEC-kolom en optimalisatie van chromatografiecondities zijn echter essentieel om co-isolatie van ongewenste deeltjes zoals chylomicronen en lipoproteïnen met lage dichtheid tot een minimum tebeperken8. Ondanks hun effectiviteit zijn beide methoden tijdrovend en moeilijk te automatiseren, vooral voor monsters met een groter volume zoals celmedia of urine, waardoor hun schaalbaarheid voor industriële toepassingen wordt beperkt9.

In de afgelopen jaren is asymmetrische veldstroomveldfractionering (A4F) geëvolueerd als een krachtige scheidingstechniek voor deeltjesscheiding op basis van grootte en drijfvermogen op micro- en nanometerformaat10. Het werkingsprincipe van A4F berust op een microfluïdisch kanaal dat is voorzien van een poreus membraan aan de basis, waardoor een kracht wordt gegenereerd die op het membraan wordt uitgeoefend en die cross-flow10 wordt genoemd. In combinatie met de Brownse beweging en de Poiseuille-stroming die inherent zijn aan het systeem, vergemakkelijkt de kruisstroming een efficiënte deeltjesscheiding als gevolg van de variërende deeltjespositie binnen de stromingsdynamiek11. Ondanks de voordelen is deze methode beperkt tot monstervolumes binnen het microliterbereik12 en vereist een extra focusstap, waardoor de duur van het proces wordt verlengd10.

In het afgelopen decennium heeft microfluïdica aan bekendheid gewonnen als een hulpmiddel voor snelle, efficiënte en klinisch betrouwbare EV-scheiding13. De meeste microfluïdische methoden die zijn ontworpen voor EV-scheiding zijn echter geoptimaliseerd voor EV-monsters met een klein volume en een hoge concentratie of zijn afhankelijk van complexe scheidingsprocedures14. Bovendien wordt polydimethylsiloxaan (PDMS) op het gebied van microfluïdica erkend als het gouden standaardmateriaal vanwege zijn optische transparantie, biocompatibiliteit en gebruiksgemak15. Niettemin kan de bekende neiging om kleine lipofiele moleculen, waaronder EV's, te absorberen, problematisch zijn voor de toepassing ervan in het EV-veld13.

Cyclisch olefine-copolymeer (COC) is een veelgebruikt materiaal in microfluïdica vanwege biocompatibiliteit, kleine absorptie van moleculen en hoge chemische resistentie15. Bij de fabricage van COC-apparaten zijn echter vaak complexe processen of gespecialiseerde apparatuur nodig16. Als alternatief is off-stoichiometrie thiol-een (OSTE) een veelbelovend alternatief voor PDMS vanwege de verminderde absorptie van kleine moleculen, superieure chemische stabiliteit, fabricagegemak en schaalbaar fabricageproces17,18. Vanwege complexe verbindingen met slangen kunnen apparaten echter gevoelig zijn voor lekken19.

Het doel van deze studie was het ontwikkelen en fabriceren van een microfluïdisch apparaat dat OSTE en COC combineert met het gespleten A4F-principe voor EV-scheiding van monsters met een groot volume, zoals urine of celmedia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De monsterafname werd goedgekeurd door de Letse Commissie voor de ethiek van het onderzoek naar het leven en de medische wetenschappen van de Universiteit (besluit N0-71-35/54)

OPMERKING: De materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn opgenomen in het bestand Materiaaltabel .

1. Driedimensionale (3D) geprinte matrijsfabricage

  1. Ontwerp een serpentijnvormige dubbele negatieve mal in CAD-software met de volgende afmetingen voor het bovenste kanaal: hoogte van 0,5 mm, breedte van 1 mm en lengte van 210 mm. Gebruik voor het onderste kanaal hetzelfde ontwerp met een breedte van 1,5 mm, een hoogte van 0,6 mm en een lengte van 210 mm. Afmetingen zoals matrijsbreedte, lengte, hoogte en isometrische illustratie van het ontwerp worden weergegeven in afbeelding 1. Sla het ontwerp op als .stl-bestand.
  2. Bereid het bestand voor in Z-Suite; Er hoeft geen ondersteuning te worden toegevoegd. Print de mallen met behulp van een ultraviolette liquid crystal display (UV LCD) 3D-printer met stevige zwarte hars.
  3. Verwijder na het afdrukken de mallen voorzichtig van het printeroppervlak. Was de vormpjes in isopropanol (IPA) in sonicatie gedurende 20 min.
  4. Föhn de mallen met N2.
  5. Stel de mallen 810 s bloot aan blootstelling aan overstromingen met behulp van een ND33-filter en plaats ze vervolgens gedurende 48 uur in een oven op 60 °C.

2. Voorbereiding van de PDMS-mallen

  1. Weeg PDMS in een verhouding van 10:1 w/w (gebruik voor elke mal 16 g elastomeerbasis en 1,6 g vernettingsmiddel). Meng de componenten in een planetaire centrifugaalmenger en meng gedurende 1 minuut op 500 RPM.
  2. Giet het gemengde PDMS in de 3D-geprinte mallen en ontgas in een vacuümexsiccator bij -800 mbar gedurende 30 minuten of totdat er geen luchtbellen meer worden waargenomen.
  3. Plaats voorzichtig een 100 μm dikke polyvinylchloride liner op de vloeibare PDMS.
    NOTITIE: Breng de voering langzaam van de ene naar de andere kant aan om luchtbelvorming te voorkomen.
  4. Steek de mal met PDMS in een Mold-in-Place Jig en draai de mal vast met behulp van een momentsleutel die is ingesteld op 0.3 Nm.
  5. Plaats de mal gedurende 3 uur in een oven van 60 °C om PDMS uit te harden.
  6. Demonteer de mal met een inbussleutel en verwijder de 3D-geprinte mal van de mal.
  7. Ontvorm PDMS-mallen voorzichtig van de 3D-geprinte mastermallen, loop met een scalpel langs de randen van de mal en verwijder de mal vervolgens met een pincet.
    NOTITIE: Voor het gemakkelijker verwijderen van schimmel kan IPA worden gebruikt; de mallen moeten echter gedurende 10 minuten op 60 °C worden verwarmd om overtollig IPA te verdampen.

3. Voorbereiding van OSTE-COC bovenkanaal

  1. Gewicht OSTE bij een w/w-verhouding van 1,09:1 (voor 5 apparaten is 1,56 g A-deel en 1,44 g B-deel nodig). Meng de componenten in een planetaire centrifugaalmenger: meng gedurende 5 minuten op 750 RPM, ontgas vervolgens gedurende 5 minuten op 750 RPM.
  2. Breng de gemengde OSTE over in een centrifugebuis en ontgas bij -800 mbar in een vacuümexsiccator gedurende 30 min.
  3. Reinig COC-sledes met 2 x 16 mini-Luer-connectoren door sonicatie in IPA gedurende 10 minuten. Droog de glaasjes zorgvuldig af met N2.
  4. Plaats de schone COC-glaasjes in de plasma-aser zodat het vlakke oppervlak naar boven wordt geplaatst en behandel het oppervlak gedurende 2 minuten met 800 SCCM zuurstofplasma bij een vermogen van 700 W met een druk van 0.133 mbar.
  5. Plaats het geoxideerde COC-glaasje op de PDMS-mal voor het bovenste kanaal, zodat het behandelde oppervlak in contact komt met het gestructureerde oppervlak van PDMS. Plaats het geheel in een Mold-in-Place-mal en draai de mal vast met een momentsleutel die is ingesteld op 0.3 Nm.
  6. Sluit het druksysteem aan op de persluchtleiding bij 6 bar. Neem de centrifugebuis met ontgaste OSTE en monteer deze volgens de instructies van het druksysteem met behulp van polytetrafluorethyleen (PTFE) slangen met een binnendiameter van 0,8 mm (ID).
  7. Sluit de PTFE-slang aan op de inlaat van de PDMS-mal en vul het apparaat met een druk van 1000 mbar die wordt gehandhaafd door een piëzo-elektrische pomp in het druksysteem. Plaats de mal met de glaszijde naar boven in de maskeruitlijner en belicht met een dosis van 850 mJ met behulp van het ND33-filter.
  8. Demonteer na het fotograferen de mal met behulp van een inbussleutel en verwijder voorzichtig het COC-glaasje met de gestructureerde OSTE-laag uit de PDMS-mal.
  9. Breng de gestructureerde OSTE in contact met een membraan van 25 mm x 75 mm met poriën van 50 nm en een poriedichtheid van 11,8%, zodat de kanalen volledig bedekt zijn met het membraan.
    OPMERKING: Het is vooral belangrijk om het membraan zo recht mogelijk te houden tijdens het aanbrengen.
  10. Plaats het geheel op een kookplaat ingesteld op 60°C met de membraanzijde naar boven, plaats een schoon glasplaatje bovenop het membraan en oefen een druk van 1.6 kPa uit vanaf de bovenkant om een gelijkmatige hechting te garanderen. Verwarm het geheel een nacht.
    OPMERKING: Na deze stap is het vooral belangrijk om de hechtingsprestaties en kanaalvervorming te evalueren.

4. Voorbereiding van het OSTE-COC-onderkanaal en de montage van het apparaat

  1. Meng OSTE met een w/w-verhouding van 1,09:1 (voor 5 apparaten is 1,56 g A-deel en 1,44 g B-deel nodig). Meng de componenten in een planetaire centrifugaalmenger: meng gedurende 5 minuten op 750 RPM, ontgas vervolgens gedurende 5 minuten op 750 RPM.
  2. Breng de gemengde OSTE over in een valkbuis en ontgas bij -800 mbar in een vacuümexsiccator gedurende 30 minuten.
  3. Reinig COC-objectglaasjes door middel van sonicatie in IPA gedurende 10 minuten. Droog de glaasjes zorgvuldig af met N2.
  4. Plaats de schone COC-glaasjes in plasma-aser en behandel het oppervlak gedurende 2 minuten met 800 SCCM zuurstofplasma bij een vermogen van 700 W met een druk van 0.133 mbar.
  5. Plaats het geoxideerde COC-glaasje op de PDMS-mal voor het onderste kanaal, zodat het behandelde oppervlak in contact komt met het gestructureerde oppervlak van PDMS. Plaats het geheel in een Mold-in-Place-mal en draai de mal vast met een momentsleutel die is ingesteld op 0.3 Nm.
  6. Neem de valkbuis met ontgaste OSTE en monteer deze volgens de instructies van het druksysteem met behulp van PTFE-slangen met een binnendiameter van 0.8 mm.
  7. Sluit de PTFE-slang aan op de inlaat van de PDMS-mal en vul het apparaat met een druk van 1000 mbar. Plaats de mal met de glaskant naar boven in de maskeruitlijner en belicht met een dosis van 1100 mJ met behulp van het ND33-filter.
  8. Demonteer na het fotograferen de mal met behulp van een inbussleutel en verwijder voorzichtig het COC-glaasje met de gestructureerde OSTE-laag uit de PDMS-mal.
  9. Combineer de gestructureerde OSTE-laag met de bovenste kanaalconstructie, zodat het ontwerp van de bovenste en onderste laag op elkaar is afgestemd en dat de RESTE-onderlaag in contact staat met het membraan.
  10. Plaats het ontwerp in een Mold-in-Place-mal en oefen met behulp van bulldog-clips gelijkmatig een druk van 1.6 kPa uit op het apparaat. Zet de mal een nacht in een oven van 60°C.
    NOTITIE: Ongelijkmatige plaatsing van de clips kan leiden tot ongelijkmatige hechting.

5. Evaluatie van het apparaat

  1. Evalueer de apparaten na het verlijmen visueel met een microscoop op visuele defecten, bijvoorbeeld vervorming van het kanaal of mislukte verlijming.
  2. Test de apparaten zonder defecten door 0,02 μm gefilterd gedeïoniseerd water met een druk van 30 mbar door de kanalen te leiden. Let op lekken in het stroomkanaal en de Luer-poort en de waterstroom.
    OPMERKING: Als er geen lekkage kan worden gedetecteerd en de kanaalstroom ononderbroken is, worden apparaten als bruikbaar beschouwd voor verdere experimenten.

6. Apparaat instellen

  1. Vul twee spuiten van 5 ml met 2 ml 20 nm gefilterd 3% H2O2 en plaats ze op een spuitpomp (gebruik de bewegingspijlen voor de benodigde afstand, plaats de spuiten en zet ze vast met de bovenste balk).
    VOORZICHTIGHEID! Wees altijd voorzichtig bij het hanteren van H2O2. Draag een laboratoriumjas, beschermende rubberen handschoenen en oogbescherming.
  2. Sluit de 14 cm lange PTFE-slang met een binnendiameter van 800 μm aan op de spuiten met behulp van de spuitnaalden en op de inlaten van het apparaat met behulp van Luer-connectoren.
  3. Sluit een 20 cm lange 200 μm ID polyetheretherketon (PEEK)-slang aan op de stopcontacten.
  4. Sluit het andere uiteinde van de PEEK-slang aan op een afvalcontainer. De opstelling is te zien in figuur 3.
  5. Start de spuitpomp met een stroomsnelheid van 500 μL/min voor elke inlaat (op het instrumentenscherm: Instellingen > Systeemset > Spuit (fabrikant: medische spuit, spuit: 5 ml) > Terug-knop > Parameters (Selecteer: infuseren, Repeat: 1, Volume: 1.5 ml, Flow: 500 μL/min) > Terug-knop > Terug-knop ). Vang de doorstroom op in een afvalcontainer.
  6. Vul twee nieuwe spuiten van 5 ml met 2 ml 20 nm gefilterde 70% ethanol.
  7. Vervang de vorige spuiten door de met ethanol gevulde spuiten en start de spuitpomp met dezelfde parameters als beschreven in stap 6.5.
  8. Gebruik nieuwe spuiten van 5 ml en vul deze met 5 ml gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) van 20 nm.
  9. Vervang de vorige spuiten door de met PBS gevulde spuiten en spoel het apparaat door met 4 ml PBS door stap 6.1 te herhalen. en 6.5.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de parameters van de systeeminstellingen wijzigt in Volume: 4 ml (op het instrumentenscherm: Instellingen > Parameters > (Selecteer: Volume: 4 ml).
  10. Koppel de slang los van het apparaat en sluit elke in- en uitlaat af met Luer-pluggen.
    NOTITIE: Laat PBS in het apparaat en voorkom dat er lucht wordt opgesloten door extra PBS toe te voegen aan elke inlaat en uitlaat met behulp van een micropipet voordat u het sluit.
  11. Laat het apparaat een nacht op een donkere plaats bij kamertemperatuur (RT) staan.
  12. Spoel het met PBS gevulde apparaat de volgende dag door met 4 ml 20 nm gefilterd PBS (zoals beschreven in stap 6.8).
  13. Verzamel de laatste 1 ml van de doorstroom van beide uitgangen in een eiwitarm met een lage binding van 2 ml en bewaar deze bij 4 °C als blanco voor deeltjes die door het apparaat worden geïntroduceerd.
  14. Verwijder de met PBS gevulde spuiten en vervang ze door nieuwe spuiten van 5 ml gevuld met lucht.
  15. Ontlucht het apparaat met 4 ml lucht totdat alle vloeistof het apparaat en de slang heeft verlaten.

7. Apparaattesten met gestandaardiseerde latexparels

  1. Maak een gestandaardiseerd parelmonster met 1,0 μm polystyreen en 0,1 μm carboxylaatkorrels. Voeg aan een buisje van 15 ml 500 μl polystyreenkorrelstandaarden van 1,0 μm, 1 μl van 0,1 μm carboxylaatparelstandaarden en 9499 μl gefilterde PBS van 20 nm toe (de uiteindelijke concentratie van 1,0 en 0,1 μm korrelmix is respectievelijk 5 × 108 korrels/ml en 3,6 × 1010 korrels/ml).
  2. Draai het parelmonster gedurende 30 s en bewaar het bij +4 °C wanneer het niet in gebruik is.
  3. Vul een nieuwe spuit van 5 ml met 1,5 ml van het gestandaardiseerde parelmengsel en een andere met 1,5 ml 20 nm gefilterd PBS.
  4. Verwijder de eerder bevestigde spuiten en bevestig de spuit van het parelmengsel aan de eerste inlaatslang en de andere aan de tweede inlaat.
  5. Verwijder de afvalcontainer en maak voor elke uitlaatslang ten minste vijf microcentrifugebuisjes van 0.5 ml klaar.
  6. Wijzig de opstartparameters van het spuitpompsysteem in Volume: 1 ml; Debiet: 250 μL/min.
    NOTITIE: Afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kunnen verschillende stroomsnelheden worden ingesteld, zoals 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min en 50 μL/min. Een voorstudie om de meest gunstige snelheid voor het gewenste resultaat te kiezen, wordt aanbevolen.
  7. Start de spuitpomp en vang de uitstroom op - 5 tot 6 druppeltjes in elke microcentrifugebuis.
    NOTITIE: Als hetzelfde apparaat meerdere keren wordt gebruikt, spoelt u het apparaat door zoals beschreven in stap 6.8 en vervangt u alle connectoren, stekkers en naalden. Was de gebruikte connectoren, stekkers en naalden door ze minimaal 30 minuten in 20 nm gefilterde 70% ethanol te laten liggen. Verplaats vervolgens alle onderdelen naar een buis met 20 nm gefilterd gedeïoniseerd water, schud de buis grondig en breng ze over naar een petrischaal met 20 ml 20 nm gefilterd gedeïoniseerd water. Laat de petrischaal minstens 30 minuten op de shaker staan op 100 tpm en laat de dingen vervolgens drogen in een droge petrischaal (minimaal 12 uur) voordat u ze opnieuw gebruikt.

8. Apparaattesten met urinemonsters

  1. Bereid het apparaat voor zoals beschreven in de stappen 6.1-6.15.
  2. Verzamel 100 ml ochtendurine per donor met behulp van steriele urinecontainers en lever deze binnen 2 uur na afname in bij het laboratorium voor verwerking.
  3. Scheid elk urinemonster in twee buisjes van 50 ml en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten bij RT.
  4. Verzamel het supernatans en gooi de pellet weg.
  5. Centrifugeer het supernatans bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij RT om grote deeltjes en celresten te verwijderen.
  6. Verzamel het supernatans en gooi de pellet weg.
  7. Was het apparaat zoals beschreven in 6.6.
  8. Vervang de spuiten van 5 ml door een spuit van 20 ml gevuld met het voorbereide urinemonster voor de monsterinlaat en nog een spuit van 20 ml gevuld met 20 ml 20 nm gefilterde DEPC-PBS voor de bufferinlaat. Wijzig de instellingen van de spuitpomp in BDPlastipak; Spuit: cc; Volume: 20 ml; Debiet: 250 μL/min (optimaal debiet), op dezelfde manier als beschreven in stap 6.2. Start de spuitpomp en vang de doorstroom van elke uitlaat op in afzonderlijke slangen van 50 ml.
  9. Concentreer elke doorstroom afzonderlijk met behulp van 100.000 molecuulgewicht afgesneden concentratiebuisjes tot elk 100 μl bij 3.000 x g bij 4 °C.
  10. Breng de concentraten over in microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
  11. Draai de geconcentreerde monsters gedurende 30 seconden en draai ze vervolgens gedurende 10 seconden.
  12. Aliquoteer de monsters door 25 μL monster per buisje over te brengen, label ze en vries ze in bij -80 °C voor langdurige opslag.

9. Testen van apparaten met geconditioneerde media

  1. Bereid het apparaat voor zoals beschreven in de stappen 6.1- 6.15.
  2. Kweekcellen in een 5% CO2 -bevochtigde omgeving bij 37 °C totdat het totale aantal 100 miljoen bereikt volgens Bajo-Santos et al.20 Breng de cellen over naar een enkele T175-suspensiekolf in 100 ml serumvrije media aangevuld met 2% B-27 serumvervangend supplement en kweek gedurende nog eens 48 uur in een 5% CO2 -bevochtigde omgeving bij 37 °C.
  3. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer deze op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT om cellen te verwijderen.
  4. Verzamel en centrifugeer het supernatans opnieuw bij 3.000 x g gedurende 30 minuten bij +4 °C om grote deeltjes en celresten te verwijderen.
  5. Vang het supernatans op en bewaar het bij +4°C totdat de scheiding kan plaatsvinden, maar niet langer dan 3 uur.
  6. Vervang de spuiten van 5 ml door spuiten van 20 ml, gevuld met de voorbereide geconditioneerde media voor de monsterinlaat en gevuld met 20 ml 20 nm gefilterd PBS voor de bufferinlaat.
  7. Stel de instellingen in het pompstation in zoals beschreven in stap 7.8.
  8. Start de spuitpomp en vang de doorstroom van elke uitlaat op in een aparte slang van 50 ml.
  9. Concentreer elke doorstroom afzonderlijk met behulp van 100.000 molecuulgewicht afsnijconcentratiebuisjes tot 150 μl elk bij 3.000 x g bij +4 °C.
  10. Breng de concentraten over in microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
  11. Vortex geconcentreerde monsters gedurende 30 s.
  12. Draai geconcentreerde monsters gedurende 10 s.
  13. Aliquot de monsters door 25 μL monster per buisje over te brengen, ze te labelen en ze in te vriezen bij -80 °C voor langdurige opslag.

10. Isolatie van EV's met behulp van ultracentrifugatie

  1. Centrifugeer 20 ml urine of geconditioneerde celmedia bij 100.000 x g gedurende 70 minuten bij +4 °C met behulp van een centrifuge met een rotor met vaste hoek.
  2. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 20 ml 20 nm gefilterd PBS.
  3. Centrifugeer opnieuw, zoals uitgelegd in 10.1.
  4. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 12 ml 20 nm gefilterd PBS.
  5. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 70 minuten bij +4 °C met behulp van een zwenkrotor.
  6. Gooi de supernatant weg.
    NOTITIE: Wees voorzichtig bij het weggooien van het supernatans deze keer. Het wordt aanbevolen om het met een pipet te doen.
  7. Resuspendeer de pellet in 100 μL 20 nm gefilterd PBS.
  8. Aliquot het monster en ga verder met zetting 12 voor EV-karakterisering. Anders bewaren bij -80 °C tot verder gebruik.

11. Isolatie van EV's met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)

  1. Concentreer 20 ml urine of geconditioneerde celmedia tot 500 μl met behulp van 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) centrifugaalfiltereenheden bij 3.000 x g bij +4 °C gedurende 15 minuten.
  2. Breng het concentraat over op de SEC-kolom (belastingsbereik van 35 nm).
  3. Giet de 20 nm gefilterde PBS op de kolom en verzamel 15 fracties van 0,5 ml.
  4. Analyseer fracties met een dynamisch lichtverstrooiingssysteem (DLS) volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Bundel de geselecteerde breuken. Kies fracties met een verzwakker lager dan 11 en ten minste 30% van de totale deeltjes die groter zijn dan 40 nm.
  6. Concentreer geselecteerde fracties tot 100 μl met behulp van 3 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) centrifugaalfiltereenheden bij 14.000 x g bij +4 °C gedurende 15 min.
  7. Aliquot het monster en ga verder met sectie 12 voor EV-karakterisering. Anders bewaren bij -80 °C tot verder gebruik.

12. Karakterisering van EV's

  1. Neem het te karakteriseren monster uit de vriezer en ontdooi het langzaam (op een ijsblok of bij +4 °C).
  2. Voer een nanodeeltjesvolganalyse (NTA) uit om de deeltjesgrootteverdeling en hoeveelheid13 te bepalen. Voer een T-celmembraanproteïne 4 (TIM-4) dubbele sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest (dsELISA)14 met hoge affiniteit uit om de aanwezigheid van EV in de monsters te bevestigen.

13. NTA

  1. Draai het ontdooide EV-monster gedurende 30 s en draai het gedurende 10 s, breng vervolgens 1 μL over naar 999 μL 20 nm gefilterde PBS in een microcentrifugebuis van 2 ml om het 1000-voudig te verdunnen. Bewaar 1 ml extra PBS dat voor verdunning wordt gebruikt om te controleren of het geen deeltjes bevat. Bewaar alles bij +4 °C tot de meting.
    NOTITIE: Filter PBS voor gebruik door een filter van 0.02 nm.
  2. Draai het EV-monster of de blanco gedurende 30 s en steek deze met een spuit in de module. Vul de module met ongeveer 0,7 ml monster en plaats het in het instrument.
  3. Meet het monster met behulp van het nanodeeltjesanalysatorinstrument volgens de instructies van de fabrikant.

14. dsELISA voor EV-markers

  1. Bereid een oplossing van 1 μg/ml TIM4-Fc-eiwit. Smeer de putjes van een ELISA-plaat met 96 putjes in door 100 μL oplossing over te brengen naar elk nodig putje en incubeer 's nachts bij +4 °C en schud bij 200 RPM.
  2. Bereid de volgende dag wasoplossing (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
  3. Gooi alle vloeistof in elk putje weg. Was elk putje door 200 μL wasoplossing toe te voegen, 5 minuten op 200 RPM te schudden en weg te gooien. Herhaal deze stap twee keer.
  4. Bereid blokkerende oplossing voor (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% runderserumalbumine. Voeg 200 μL blokkeringsoplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij RT terwijl het schudt bij 200 RPM.
  5. Was elke put zoals beschreven in stap 14.3.
  6. Bereid 220 μL van elke monsterverdunning in wasbuffer (optimale EV-concentratie is 2,7 × 105 EVs/μL). Voeg 100 μL van het verdunde monster per putje toe en voer twee replicaties uit. Incubeer 90 minuten bij RT terwijl je schudt op 200 RPM.
  7. Was elke put zoals beschreven in stap 14.3.
  8. Voeg 100 μL corresponderende antilichamen toe aan elk putje. Gebruik de juiste EV-markeringen voor het bevestigen van EV's en verontreinigingen4. Incubeer gedurende 2 uur bij RT terwijl je schudt bij 200 RPM. OPMERKING: Als secundaire antilichamen worden gebruikt, herhaalt u stap 14.7-14.8. Verkort echter de incubatietijd van secundaire antilichamen tot 1 uur.
  9. Was elke put zoals beschreven in stap 14.3.
  10. Voeg 100 μL mierikswortelperoxidasesubstraat toe aan elk putje, meng de plaat gedurende 1 minuut en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
  11. Voeg 1 M H2SO4 toe aan elk putje om de reactie te stoppen.
  12. Meet met behulp van een microplaatlezer de absorptie bij 450 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben een microfluïdisch apparaat gefabriceerd met behulp van een 3D-geprinte dubbele negatieve mal (Figuur 1) via zachte lithografie (Figuur 2A) voor EV-scheiding met hoge doorvoer op basis van het gespleten A4F-principe (Figuur 2B,C). De opstelling vereist een pomp en een doorstroomstation, zoals te zien is in figuur 3, voor het op geautomatiseerde wijze isoleren van EV's. Ten eer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde microfluïdische apparaat biedt een veelbelovende methode voor de isolatie en extractie van EV's uit biologische vloeistoffen, waarbij enkele van de kritieke beperkingen van bestaande gouden standaardmethoden zoals UC en SEC12 worden aangepakt. UC en SEC staan bekend als arbeidsintensief, tijdrovend en hebben een laag rendement, waardoor ze minder geschikt zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer waar grote hoeveelheden EV's nodig zijn21,22<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

A.A., G.M. en R.R. zijn oprichters, bestuursleden en aandeelhouders in Cellbox Labs, LLC

Dankbetuigingen

We danken alle donoren die hebben deelgenomen aan deze studie, het personeel van de Letse genoomdatabase voor het beschikbaar stellen van de monsters. Het Instituut voor Vastestoffysica, Universiteit van Letland heeft als Center of Excellence financiering ontvangen van het Horizon 2020-kaderprogramma H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 739508, project CAMART2. Dit werk werd ondersteund door de Letse Raad voor Wetenschap Project nr. lzp-2019/1-0142 en projectnummer: lzp-2022/1-0373.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 µm carboxylate FluoSpheresInvitrogen#F8803Stock concentratie: 3,6 x 1013 kralen/mL (afhankelijk van partij)
0.5 mL microcentrifuge tubesStarstedt72.704
1 mL Luer cone syringe enkel gebruik zonder naaldRAYSTUB1ML
1.0 µm polystyreen FluoSpheresInvitrogen#F13083Stock concentratie: 1 x 1010 kralen/mL (afhankelijk van partij)
10 mL Serologische pipettenSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugale filtersMerck MilliporeUFC910024
2.0 mL Protein LoBind buisjesEppendorf30108132
20 mL spuitenBD PlastikPak10569215
250 µm ID polyether ether ketone buisjesDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO centrifugale filter unitsMerck Millipore,UFC200324
5 mL medische spuit zonder naaldAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL conische buizenSarstedt62.547.254
70 Ti hoekvaste ultracentrifuge rotorBeckman Coulter337922
800 µm ID polytetrafluorethyleen buisjesDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96 well microplaat, f-bodem, med. bindingGreiner Bio-One655001ELISA plaat
B-27 Supplement (50x), serumvrijThermo Fisher Scientific17504044
Bovine serum albumineSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas microscoop slide platformMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas microscoop slide platform 2 x 16 Mini Luer Microfluidic Chipshop10000387
Elveflow OB1 drukregelaarElvesys Group
Luer connectorenDarwin Microfluidics CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300nanodeeltje analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg vrij. Fisher Bioreagents. 100 gFisher ScientificBP2944-100
PC membraan (50 nm poriëndiameter, 11,8% dichtheid)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, België
Petri schotels, sterieelSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm kolomIzonSP5SEC kolom
QSIL 216 Silicone Elastomer KitPP&S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotorBeckman Coulter331301
SpuitpompDK InfusetekISPLab002
T175 suspensie flesSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc eiwitAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)SigmaAldrichT0440-100MLHorseradish peroxidase substraat
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XPBeckman Coulter
Ultrasoon reinigingsapparaat P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Universele Microplate SpectrofotometerBio-Tek instruments71777-1
Urinecollectabek, 150mL, sterieelAPTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 SpuitfilterSigmaAldrich68092002
ZetaSizer Nano ZSMalvern Panalyticaldynamic light scattering (DLS) systeem 
Zortrax InkspireZortrax

Referenties

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

EV-isolatieasymmetrische stroomfractioneringscheiding op basis van grootteverwerking van biofluïdaurine-monstervoorbereidingpartikelterugwinningultracentrifugatie
Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.