Microbiologische snelle evaluatie ter plaatse voor pulmonale infectieziekten

Samenvatting

Het protocol hier demonstreert een snelle en gestandaardiseerde workflow voor microbiologische snelle evaluatie ter plaatse (M-ROSE), inclusief drie stappen: het maken van dia's, kleuring en interpretatie. Dit protocol helpt artsen om snel klinische beslissingen te nemen.

Samenvatting

De snelle start van empirische anti-infectieuze therapie is cruciaal bij patiënten met een onverklaarbare longinfectie. Hoewel beeldvorming in de klinische praktijk relatief eenvoudig is, vereist het gebrek aan specificiteit vaak aanvullende tijdrovende tests zoals sputumcultuur, bronchoalveolaire spoelvloeistofcultuur of genetische sequencing om de onderliggende etiologie van de ziekte nauwkeurig te identificeren. Bovendien kan de beperkte werkzaamheid van empirische anti-infectieuze behandeling bijdragen aan misbruik van antibiotica. Recente ontwikkelingen in het interpreteren van microbiële achtergrond op ROSE-objectglaasjes (Rapid On-Site Evaluation) hebben clinici in staat gesteld om snel monsters te verkrijgen door middel van bronchoscopie (bijv. alveolaire spoeling, mucosale borsteling, weefselklem), waardoor kleuring en interpretatie aan het bed worden vergemakkelijkt die essentiële microbiële achtergrondinformatie biedt. Bijgevolg legt dit een basis voor het ontwikkelen van gerichte anti-infectiebehandeling en geïndividualiseerde medicamenteuze therapieplannen. Met een beter begrip van welke ziekteverwekkers in realtime infecties veroorzaken, kunnen artsen onnodige breedspectrumantibiotica vermijden die bijdragen aan antibioticaresistentie. Het opzetten van een snelle en gestandaardiseerde M-ROSE-workflow binnen afdelingen respiratoire geneeskunde of intensive care-afdelingen zal artsen enorm helpen bij het formuleren van nauwkeurige behandelingsstrategieën voor patiënten, wat aanzienlijke klinische implicaties heeft.

Inleiding

De techniek van snelle evaluatie ter plaatse (ROSE) is een zeer efficiënte methode die wordt gebruikt op het gebied van procedures voor longziekten. Het maakt real-time bemonstering en diagnostische interventie mogelijk, waardoor onmiddellijke cytologische analyse mogelijk^{wordt 1}. Deze innovatieve aanpak omvat het afdrukken van een deel van het weefselmonster op een objectglaasje met behoud van de integriteit ervan. Een van de belangrijkste voordelen van ROSE ligt in het vermogen om een snelle interpretatie van klinische informatie te vergemakkelijken door middel van gespecialiseerde microscopietechnieken. Dit omvat de analyse van de celmorfologie, classificatie, kwantificering, bepaling van samenstellende verhoudingen, beoordeling van de rangschikking, correlatieanalyse, evaluatie van de achtergrond en identificatie van vreemde voorwerpen. Door al deze gegevens te integreren met de klinische informatie van de patiënt, speelt ROSE een cruciale rol bij het evalueren van de geschiktheid van de bemonstering en het begeleiden van real-time interventionele procedures^{en technieken.}

Als dochteronderneming van de ROSE-technologie richt de M-ROSE-technologie zich voornamelijk op het verkrijgen van de microbiologische achtergrond van doellaesies in plaats van onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige cellen ^3,4. Aan de ene kant maakt M-ROSE de microscopische identificatie mogelijk van pathogenen zoals Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis en Candida⁵. Aan de andere kant heeft het belangrijke leidende implicaties bij het beoordelen van de kwaliteit van respiratoire monsters, het onderscheiden van infectieuze van niet-infectieuze ziekten, het onderscheiden van infectie van besmetting, en het evalueren van de ernst en prognose van infectie ^6,7. Bijvoorbeeld, binnen een respiratoir monster, duidt het naast elkaar bestaan van bacteriën die identieke morfologie vertonen naast infiltrerende ontstekingscellen op een infectie; Omgekeerd suggereert de aanwezigheid van meerdere morfologisch diverse bacteriën vergezeld van epitheelcellen besmetting. Het vermogen om klinische informatie uitgebreid te analyseren en resultaten te voorspellen, maakt M-ROSE tot een hulpmiddel van onschatbare waarde bij procedures voor longziekten.

Kortom, ROSE dient als een cruciale cytologische drager die de efficiëntie en precisie van het diagnosticeren van longziekten aanzienlijk verbetert. De veelzijdige mogelijkheden dragen bij aan betere patiëntresultaten door tijdige interventie te garanderen en een nauwkeurige diagnose te vergemakkelijken door middel van real-time bemonstering en diagnostische interventietechnieken. Het is echter belangrijk op te merken dat deze vooruitgang afhankelijk is van het verkrijgen van gekwalificeerde monsters. Hierin presenteren we een gestandaardiseerd M-ROSE-protocol dat de voorbereiding van objectglaasjes, kleuringstechnieken en interpretatierichtlijnen omvat. Dit protocol dient als een onschatbare referentie voor clinici om nauwkeurige evaluatie- en behandelplannen op te stellen en tegelijkertijd de besluitvorming over de daaropvolgende behandeling van doelmonsters te vergemakkelijken.

Protocol

De klinische proef is goedgekeurd door het goedkeuringscomité van het Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine (nr. 2022-ky-31). Het typische geval betrof een patiënt bij wie longontsteking Pneumocystis was vastgesteld en waarvoor geïnformeerde toestemming van de patiënt werd verkregen.

1. Uitrustings- en materiaalvereisten voor ROSE

1. Apparatuur: Raadpleeg het bestand Materiaaltabel voor de apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt.
   OPMERKING: Het gebruik van een speciale cytologische microscoop en een grafisch beeldvormingssysteem is absoluut noodzakelijk (Figuur 1A).
2. Materiaalvoorbereiding (zie Tabel met materialen).
   1. Bereid steriele celkweekglaasjes (met sterke celhechting), absorberend papier, poedervrije latexhandschoenen, wegwerpspuitnaalden van 2,5-5 ml voor en plaats de complete set Diff Quik (DQ) kleuringsoplossingen in glazen kleurpotjes met verzegelde deksels voor eenvoudig gebruik (Figuur 1).

2. M-ROSE workflow

1. Bereiding van cytologische objectglaasjes
   OPMERKING: Er zijn veel manieren om dia's voor te bereiden, en de volgende zijn enkele veelgebruikte bereidingsmethoden.
   1. Rol dia's
      OPMERKING: Zorg voor minimaal verlies van weefselmonster tijdens dit proces.
      1. Elimineer weefseldeeltjes met behulp van een wegwerpspuitnaald met een capaciteit van 2,5-5 ml (Figuur 2A).
      2. Spreid een cirkelvormig gebied met een diameter van ongeveer 1 cm en een gemiddelde dikte uit van het binnenste naar het buitenste derde deel van het gekleurde uiteinde (het uiteinde dat sterke celaanhechting vertoont) op het steriele cytologieobjectglaasje.
   2. Borstel dia's
      OPMERKING: Deze methode is van toepassing op monsters die zijn verkregen met behulp van conventionele celborstels, anti-vervuilingscelborstels of ultrafijne celborstels, evenals semi-vloeibare monsters zoals sputum en stroperige lichaamsvloeistoffen.
      1. Schuif de opzetborstel uit en breng deze aan op het distale derde deel van het steriele cytologische glasplaatje (het objectglaasje heeft sterke celadhesie-eigenschappen) om een rechthoekig gebied van ongeveer 2 cm x 1 cm met een gemiddelde dikte te verkrijgen.
   3. Spuit dia's
      1. Plaats de priknaald op een derde van het bevlekte uiteinde van een steriel cytologieglaasje met robuuste celadhesie.
      2. Oefen luchtdruk uit op de punt van de piercingnaald en steek deze vanaf de binnenkant naar buiten in, zodat er een cirkelvormig gebied ontstaat met een gemiddelde dikte van ongeveer 1 cm in diameter.
2. Cytologische kleuring van objectglaasjes
   OPMERKING: De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) beveelt een snelle kleuring van het cytologische objectglaasje van ROSE aan met de kleurstof^{van Diff 5}. De Diff-kleurstof kan worden hergebruikt, maar niet vele malen worden herhaald. Als er bezinksel is, moet dit na gebruik worden gefilterd. Te diep verven kan goed ontkleurd worden door methanol of alcohol, liefst niet meer geverfd. Als het verven te diep of te ondiep is, moet de verftijd of de concentratie van de werkvloeistof worden aangepast; de pH-waarde heeft een bepaalde invloed op het verven en de objectglaasje moet schoon zijn en vrij van zure en alkalische vervuiling. Zowel Diff A-oplossing als Diff B-oplossing zijn vluchtig en moeten na gebruik worden verzegeld en bewaard.
   1. Dompel het objectglaasje 10-30 s onder in Diff A-oplossing (Figuur 2B), spoel het vervolgens af in het PBS-verfbad om overtollige Diff A-oplossing te verwijderen en schud de resterende buffer voorzichtig af (Figuur 2C).
   2. Dompel het objectglaasje vervolgens 20-40 s onder in Diff B-oplossing (Figuur 2E).
   3. Reinig ten slotte de dia in de waterverftank (Figuur 2F), dep en veeg de resterende vloeistof van de dia af met absorberend papier (Figuur 2D) en voltooi het verven.
      OPMERKING: M-ROSE maakt directe visualisatie van pathogene micro-organismen mogelijk en vergemakkelijkt de beoordeling van de kwaliteit van respiratoire monsters, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen infectie en niet-infectie, evenals infectie en besmetting, wat van leidende betekenis is voor de evaluatie van de ernst en prognose van de infectie. In het discussiegedeelte wordt dit aspect behandeld, aangezien er geen experimentele procedures bij betrokken zijn.

Resultaten

In een typisch geval meldde een 63-jarige man zich in het ziekenhuis met hoesten, koorts en pijn op de borst. De patiënt werd eerder gediagnosticeerd met nefrotisch syndroom, gekenmerkt door proteïnurie en oedeem, en werd lange tijd behandeld met prednison en tacrolimus. De eerste laboratoriumbevindingen toonden een aantal witte bloedcellen aan van 10,49 x 10⁹/l, neutrofielentellingen van 8,87 x 10⁹/l, volbloed C-reactief proteïne en (1-3)-β-D-glucaanconcentraties van 155,81 mg/l en 249,7 pg/ml. De computertomografie (CT)-scan van de borstkas toonde opacificatie van geslepen glas met een diffuse, bilaterale en centrale locatie (figuur 3A). De eerste anti-infectieuze behandeling met cefoperazone tazobactam was niet effectief en zijn symptomen werden verergerd door hartvermoeidheid, kortademigheid en kortademigheid na inspanning; herhaalde CT-beeldvorming toonde geen significante verbetering (Figuur 3B). Vervolgens werd de patiënt overgebracht naar de intensive care (ICU) voor mechanische beademing en onderging hij een bronchoscopie. De focusbemonstering werd toegankelijk onder begeleiding van virtuele navigatie en er werden drie pincetbiopsiemonsters verzameld (Figuur 4). ROSE was beschikbaar voor onmiddellijke microscopische beoordeling van het weefsel en de diagnose van Pneumocystis jiroveci werd bevestigd (Figuur 5A). De patiënt kreeg onmiddellijk een antischimmelbehandeling met sulfamethoxazol (1,92 g, elke 6 uur); daaropvolgende kleuring (figuur 5B-E) bevestigde deze diagnose. Herhaalde CT-beeldvorming toonde echter nog steeds geen significante verbetering (figuur 3C). De patiënt kreeg carbofungine (de eerste dag van 70 mg en gevolgd door 50 mg per dag), methylprednisolon (80 mg per dag) en immunoglobuline (10 g per dag) voor schimmelinfectie. De symptomen werden snel verlicht en de patiënt zette de vervolgbehandeling voort.

Figuur 1: Apparatuur en materialen. (A) Cytologische microscoop en grafisch beeldvormingssysteem. (B) Diff Quik (DQ) kleuringsoplossing A. (C) Diff Quik (DQ) kleuringsoplossing B. (D) Poedervrije latexhandschoenen. (E) Steriele celkweekglaasjes. (F) Wegwerpnaalden van 2,5-5 ml spuiten. (G) Absorberend papier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: M-ROSE workflow. (A) Afdrukken van de dia. (B) Dompel het objectglaasje 10-30 s onder in Diff A-oplossing. (C) Spoel het objectglaasje af in het PBS-verfbad om overtollige Diff A-oplossing te verwijderen. (D) Dep de resterende vloeistof van het objectglaasje en veeg het af met absorberend papier. (E) Dompel het objectglaasje 20-40 s onder in Diff B-oplossing. (F) Reinig het glaasje in de waterverftank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: CT-beelden van de borstkas. (A) Bij opname. (B) Op de dag van de overplaatsing naar de IC. (C) Na de behandeling met sulfamethoxazol Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Lokalisatie van het achterste basale segment van de onderste kwab van de rechterlong door VBN. (A) Rechter hoofdbronchiën. (B) Rechter middelste bronchiën. (C) Achterste basale segment van de bronchiën van de onderste kwab van de rechterlong. (D) 3D-kaart van VBN. (E) Coronale kaart van thorax-CT. (F) Axiale kaart van thorax-CT. (G) Sagittale kaart van thorax-CT Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Foto's die het verschijnen van pneumocystis bij verschillende kleuringsmethoden documenteren. (A) ROOS 100 x 10; Witte pijl: cysten die ascosporen bevatten. (B) Hematoxyline en eosine (H-E), 60 x 10. (C) Alcian blauw, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) Hexamine zilver, 20 x 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Interventionele pulmonologie is een waardevolle tak van moderne luchtwegaandoeningen; Het is met name veel gebruikt bij de diagnose van longziekten ^8,9. In de afgelopen jaren heeft diagnostische interventionele pulmonologie het goed gedaan vanwege de verhoogde prevalentie van kwaadaardige longtumoren, meer resistente pathogene infecties in de onderste luchtwegen en veeleisende verzoeken om diagnose van verbijsterende en kritieke luchtwegaandoeningen 10,11,12 . De efficiëntie van interventionele diagnostiek hangt af van factoren zoals de grootte en de anatomische locatie van de aandachtsgebieden, het aantal complicaties en het aantal biopsieplaatsen, en onderliggende ziekten, waardoor het klinische gebruik van tal van geavanceerde technologieën en faciliteiten wordt bevorderd¹³. ROSE heeft opmerkelijke aandacht gekregen en is snel naar voren gekomen als een "real-time begeleidingstechniek" voor diagnose in de interventionele pulmonologie.

ROSE is ontworpen voor snelle evaluatie, voorlopige diagnose en prioritering van de tevredenheid van het monster tijdens procedures zoals punctie, biopsie en borstelen. Het geeft feedback om de daaropvolgende technologische vooruitgang te begeleiden 14,15,16,17. M-ROSE, een tak van ROSE, richt zich voornamelijk op het evalueren van de microbiële achtergrond in plaats van het beoordelen van^{maligniteit van} weefselcellen. De M-ROSE-methode is een snelle evaluatietechniek in plaats van een diagnostisch hulpmiddel, dus de diagnostische werkzaamheid moet niet worden overdreven. De klinische toepassing ervan omvat voornamelijk de volgende aspecten: visuele identificatie van bepaalde pathogene micro-organismen, differentiatie tussen infectie en contaminatie, en onderscheid tussen infectie en niet-infectie⁷.

Na snelle kleuring vertoonde de celkern van het weefsel een paarsrode tint, terwijl het cytoplasma een blauwachtig paarse kleur vertoonde. Bacteriën en schimmels leken blauw, wat resulteerde in een duidelijk contrast tussen weefselcellen en ziekteverwekkers⁷. M-ROSE zou een bepaald niveau van vermogen kunnen aantonen bij het identificeren van bacteriën en schimmels. In het bijzonder vertoont het een hoog positief percentage voor Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci en andere schimmels ^3,18. Het heeft echter beperkingen als het gaat om het herkennen van ziekteverwekkers met een klein volume en diameter of intracellulaire pathogene agentia. Het is van cruciaal belang om te onderstrepen dat de diagnose van een ziekte gebaseerd moet zijn op een uitgebreide evaluatie die de fundamentele toestand van de patiënt, klinische manifestaties, beeldvormende onderzoeken en andere factoren omvat, in plaats van alleen te vertrouwen op de microscopische identificatie van pathogene micro-organismen.

M-ROSE biedt ook voordelen bij het identificeren van infectie en contaminatie, zoals het beoordelen van de kwaliteit van monsters van alveolaire lavagevloeistof. Op afdelingen waar de omstandigheden het toelaten, kan evaluatie van de spoelvloeistof aan het bed worden uitgevoerd door middel van centrifugeren en kleuren. Gekwalificeerde monsters van alveolaire lavagevloeistof tonen aan dat het aandeel plaveiselcellen tussen alle cellen (met uitzondering van rode bloedcellen) onder microscopie met laag vermogen minder dan 1% is, zuilvormige epitheelcellen minder dan 5% en rode bloedcellen minder dan 10% (exclusief factoren die verband houden met trauma of bloeding)¹⁹. Het microscopisch onderzoek van de cytologie-achtergrond zal ons helpen bij het maken van tijdige beoordelingen.

Bovendien kan M-ROSE helpen bij het onderscheiden van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde laesies⁵. Bij geïnfecteerde laesies is er vaak infiltratie van neutrofielen, macrofagen en lymfocyten door ontstekingscellen, met af en toe observatie van neutrofiele fagocytose. Omgekeerd missen niet-geïnfecteerde laesies doorgaans infiltratie van inflammatoire cellen.

Het hier gepresenteerde protocol demonstreert het werkingsproces van M-ROSE; Door de interpretatie van de microbiologische achtergrond kan de voorlopige diagnose worden gesteld of kan de differentiële diagnose worden versmald. Zoals onze bevindingen suggereren, vereist de diagnose van PCP bevestigd bewijs van Pneumocystis jiroveci, dat niet gebaseerd mag zijn op klinische manifestaties en beeldvorming, zelfs niet bij symptomatische patiënten met een hoog risico. Microscopische identificatie van ascus en trofische vormen is het meest intuïtieve bewijs. De diagnostische efficiëntie wordt grotendeels bepaald door de kleuringsmethode van het preparaat. Historisch gezien zijn conventionele vlekken zoals Wright's-Giemsa, hexaaminezilver en toluïdineblauw beschikbaar voor PCP, maar ze zijn tijdrovend en hebben een lagere gevoeligheid. In dit geval werd de onmiddellijke diagnose van PCP bevestigd op de eerste dag van de overplaatsing van de patiënt naar de IC met behulp van ROSE. Diff-quick heeft zijn voordeel bewezen bij het identificeren van pneumocystis, gekenmerkt door een duidelijke structuur, scherp contrast en gemakkelijke identificatie van ascus (Figuur 5A).

Ook in de toepassing van etnische geneeskunde is ROSE van grote waarde. Bij etterende ziekten kunnen clinici bijvoorbeeld een breed scala aan ontstekingscellen identificeren die voornamelijk worden gedomineerd door neutrofielen binnen de microbiologische achtergrond⁵. Bijgevolg kunnen geneesmiddelen met warmtezuiverende en ontgiftende eigenschappen worden geselecteerd als mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen, zoals kamperfoelie, paardenbloem en patrinia, onder andere.

Aangezien ROSE een aanvullend programma is dat niet hoeft te worden geselecteerd in interventionele pulmonologie, zal het uitvoeren van ROSE ongetwijfeld de arbeids- en economische kosten verhogen. Het is discutabel dat ROSE regelmatig moet worden gebruikt. In termen van de voordelen van de economie maken we ons zorgen over tijd en arbeidskosten. De belangrijkste extra arbeidsbehoefte is de beoordelaar. ROSE-evaluatie kan worden uitgevoerd door een cytotechnoloog, patholoog of clinicus. Cytotechnologen zijn het meest waarschijnlijke personeel voor de ROSE-procedure. In de klinische praktijk vervangen clinici de rol echter, maar hiervoor kan een bepaalde trainingsbasis nodig zijn¹⁵. Een eerdere studie toonde aan dat een trainingsprogramma zou kunnen helpen om de nauwkeurigheid van de adequaatheidsbeoordeling door clinici te verbeteren en verstorende variabelen te elimineren²⁰. Bovendien heeft M-ROSE, als morfologische diagnostische techniek, subjectieve factoren in het resultatenrapport. De clinici moeten een uitgebreide beoordeling maken op basis van aanvullende klinische informatie.

We raden ziekenhuizen met de juiste faciliteiten en opgeleide professionals aan om te overwegen de ROSE-procedure te implementeren op hun ademhalingsafdelingen of ICU's, omdat dit de vroege evaluatie van uitdagende respiratoire kritieke ziekten kan vergemakkelijken en de klinische behandeling effectief kan begeleiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cytologisch microscoop	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) kleuringsoplossingen	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Wegwerp 2,5-5 mL spuitnaalden	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Poedervrije latex handschoenen	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Steriele celcultuur dia's	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101