Met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&tag) assay in muizenmyoblastonderzoek

Samenvatting

Onderzoekers die nieuw zijn in het epigenetische veld zullen CUT&Tag een aanzienlijk eenvoudiger alternatief vinden voor ChIP-tests. CUT&Tag heeft enorm geprofiteerd van de epigenetische studies op zeldzame en primaire celpopulaties, door hoogwaardige gegevens te genereren uit zeer weinig cellen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van H3K4me1 CUT&Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen.

Samenvatting

Dit protocoldocument is bedoeld om de nieuwe onderzoekers te voorzien van de volledige details van het gebruik van Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT & Tag) om de genomische locaties van chromatinebindingsfactoren, histonmarkeringen en histonvarianten te profileren. CUT&Tag-protocollen werken zeer goed met muizenmyoblasten en vers geïsoleerde spierstamcellen (MuSC's). Ze kunnen gemakkelijk worden toegepast op veel andere celtypen, zolang de cellen maar kunnen worden geïmmobiliseerd door Concanovalin-A-korrels. Vergeleken met CUT&Tag zijn chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays tijdrovende experimenten. ChIP-assays vereisen de voorbehandeling van chromatine voordat het chromatische materiaal kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie. Bij cross-linking ChIP (X-ChIP) omvat de voorbehandeling van chromatine crosslinking en sonicatie om het chromatine te fragmenteren. In het geval van natieve ChIP (N-ChIP) worden de gefragmenteerde chromatines normaal gesproken bereikt door microkokkennuclease (MNase) vertering. Zowel sonicatie als MNase-digestie introduceren enige vertekening in de ChIP-experimenten. CUT&Tag-assays kunnen in minder stappen worden voltooid en vereisen veel minder cellen in vergelijking met ChIP's, maar bieden meer onbevooroordeelde informatie over transcriptiefactoren of histonmarkeringen op verschillende genomische locaties. CUT&Tag kan al met 5.000 cellen functioneren. Vanwege de hogere gevoeligheid en het lagere achtergrondsignaal dan ChIP's, kunnen onderzoekers verwachten betrouwbare piekgegevens te verkrijgen van slechts enkele miljoenen lezingen na sequencing.

Inleiding

De CUT&Tag-test is uitgevonden om enkele openlijke tekortkomingen van ChIPs¹ te compenseren. De twee grote nadelen van ChIP's zijn 1) de bias die optreedt bij het fragmenteren van chromatine en 2) de incompetentie om met lage celaantallen te werken. X-ChIP-assays zijn gebaseerd op sonicatie of MNase-vertering om chromatinefragmenten te krijgen, terwijl N-ChIP meestal MNase-vertering gebruikt om nucleosomen te krijgen. Sonicatie vertoont een voorkeur voor ontspannen chromatinelocaties zoals promotorregio's², en blijkbaar werkt MNase-vertering ook efficiënter op ontspannen chromatinevezels. Bovendien meldden sommigen dat MNase-digestie ook een DNA-sequentie-afhankelijke bias vertoont³. Daarom is het bij de invoervoorbereidingsstap van ChIP-assays onmogelijk om op een perfect willekeurige manier chromatinefragmenten van allerlei genomische locaties te krijgen. Bovendien genereren ChIP-assays normaal gesproken hogere achtergrondsignalen in vergelijking met CUT&Tag en vereisen ze meer dan 10 keer meer lezingen dan CUT&Tag om te accentueren waar de pieken ^1,4,5 zijn. Dit verklaart waarom ChIP-experimenten met veel meer cellen moeten beginnen dan CUT&Tag. Dit is geen probleem bij het bestuderen van cellijnen, omdat ze herhaaldelijk kunnen worden gepasseerd om een zeer hoog celaantal te bereiken. De ChIP-test is echter zeker geen sterk epigenetisch hulpmiddel om zeldzame of kostbare primaire celpopulaties te bestuderen, hoewel primaire cellen uiteraard meer praktische en medische implicaties hebben.

Hoewel de lange en gecompliceerde ChIP-procedure sommige onderzoekers ontmoedigt om deze techniek te leren of te gebruiken, voelen mensen zich meer op hun gemak bij eenvoudigere tests zoals immunocytochemie (ICC) of immunofluorescentie (IF). Een CUT&Tag-test lijkt in wezen op het proces van ICC- en IF-experimenten, maar vindt alleen plaats in een reageerbuis. CUT&Tag heeft om te beginnen geen gefragmenteerd chromatine nodig, en in plaats daarvan moet het genoom intact zijn voor antilichaambinding¹. Op de eerste dag van een ChIP-experiment besteden onderzoekers normaal gesproken tot 4 uur aan het voorbereiden van de gefragmenteerde chromatines uit kernen met sonicatie of MNase-digestie voordat de korte chromatinestukjes kunnen worden gemengd met antilichaamkralen ^4,5. In opmerkelijk contrast hiermee is de werklast op de eerste dag van een CUT&Tag-procedure om de cellen gewoon te immobiliseren tot Concanavalin-A-korrels en vervolgens het primaire antilichaam aan de celkorrels toe te voegen. Dit vereist slechts ~40 min¹.

Het is vermeldenswaard dat Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) een belangrijk alternatief is voor CUT&Tag. CUT&RUN is opgericht op basis van een vergelijkbaar werkingsmechanisme als CUT&Tag. In CUT&Tag leiden de antilichamen de pA/G-Tn5-transposase naar alle locaties waar het enzym elk een stukje chromatine zal wegknippen en het ondertussen zal labelen met bibliotheekmakende adapters, terwijl in CUT&RUN de rol van pA/G-Tn5 wordt gespeeld door het pA/G-MNase dat alleen het knipgedeelte van het werk uitvoert⁶. Daarom vereist CUT&RUN, in vergelijking met CUT&Tag, een extra stap, namelijk het lijmen van de bibliotheekmakende adapters op de pA/G-MNase-gefragmenteerde DNA-stukjes ^7,8. Door de grote overeenkomsten tussen CUT&Tag en CUT&RUN zullen onderzoekers die bekend zijn met CUT&Tag zich gemakkelijk aanpassen aan het vakkundig uitvoeren van CUT&RUN. Er moet echter worden opgemerkt dat er enkele kleine verschillen bestaan tussen CUT&Tag en CUT&RUN. CUT&RUN-protocollen gebruiken normaal gesproken de fysische zoutconcentratie (~150 mM) in de wasstappen, terwijl in CUT&Tag de 300-Dig wasbuffer veel zout bevat. Daarom is CUT&Tag goed in het beheersen van de achtergrond bij het profileren van histonmarkeringen/-varianten of transcriptiefactoren, omdat deze eiwitten direct en sterk DNA^{binden 1}. CUT&Tag kan problemen ondervinden bij het profileren van chromatine-geassocieerde factoren die niet direct DNA binden en een zwakke affiniteit met het chromatine vertonen. Stappen met een hoog zoutgehalte in CUT&Tag kunnen chromatine-geassocieerde factoren verwijderen en geen signalen veroorzaken in de uiteindelijke output. Hoewel er succesvolle gevallen zijn waarin CUT&Tag kan worden gebruikt om sommige niet-histon/niet-transcriptiefactoreiwitten⁹ te profileren, raden we toch CUT&RUN aan via CUT&Tag om zwak gebonden chromatine-geassocieerde eiwitten te profileren.

Nadat zoogdieren de volwassenheid hebben bereikt, bevatten hun skeletspierweefsels nog steeds spierstamcellen. Tijdens spierletsel kunnen deze stamcellen worden geactiveerd en celnummeruitbreiding en differentiatie ondergaan om beschadigde spiervezels te regenereren¹⁰. Deze stamcellen staan bekend als spierstam-/satellietcellen (MuSC's). Nadat MuSC's zijn geïsoleerd van dieren of eenmaal zijn geactiveerd door spierletsel, beginnen ze zich te vermenigvuldigen en worden ze myoblasten.

Om MuSC's te verkrijgen uit de skeletspierdigestie van muizen, worden MuSC-oppervlaktemarkers zoals Vcam1 (Cd106), Cd34 en α7-integrine (Itga7) vaak afzonderlijk of in combinaties gebruikt om MuSC's te verrijken tijdens fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)¹¹. Het is aangetoond dat Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ waarschijnlijk de beste markercombinatie is om >95% zuivere MuSCs¹² te krijgen. FACS kan pure MuSC's isoleren direct nadat verse spieren zijn verteerd. Als het experimentele ontwerp echter geen zuivere MuSC's vereist direct bij hun isolatie, is pre-plating kosteneffectiever dan FACS om >90% zuivere myoblasten (MuSC-nageslacht) te verkrijgen.

MuSC's die vers uit muizen zijn geïsoleerd, prolifereren niet efficiënt in Ham's F10-media aangevuld met foetaal runderserum (FBS). Om het celaantal MuSC's beter uit te breiden en voldoende myoblasten te krijgen, moet rundergroeiserum (BGS) worden gebruikt in plaats van FBS. Als BGS echter niet beschikbaar is, kan Ham's F10 volledige media (bestaande uit ongeveer 20% FBS) worden gemengd met een gelijk volume T-cel conditionele media om myoblastexpansie dramatisch te bevorderen¹³. Daarom zal dit protocol ook de bereiding van T-cel media geconditioneerde MuSC media beschrijven.

Het belangrijkste is dat dit protocol een compleet voorbeeld biedt van het uitvoeren van H3K4me1 CUT&Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen. Houd er rekening mee dat dit protocol ook van toepassing is op andere celtypen en histonmarkeringen en histonvarianten, en dat lezers alleen het aantal cellen of de hoeveelheden antilichamen voor hun gevallen hoeven te optimaliseren op basis van de verrijking van de specifieke histonmarkeringen of varianten die ze bestuderen.

Om te worden gebruikt in CUT&Tag of CUT&RUN, moet het Tn5 of MNase worden gefuseerd met eiwit A of eiwit G om pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase of pG-MNase te maken. Blijkbaar kunnen zowel eiwit A als eiwit G tegelijkertijd op deze enzymen worden gefuseerd om pA/G-Tn5 of pA/G-MNase te genereren. Eiwit A en proteïne G vertonen differentiële affiniteiten met IgG's van verschillende soorten. Daarom kan het samensmelten van eiwit A en eiwit G op het enzym dit probleem oplossen en het enzym compatibel maken met antilichamen van meerdere soorten.

Protocol

De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, zijn allemaal goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Guangzhou Laboratory. Muizen die werden gebruikt om de representatieve resultaten van dit manuscript te genereren, werden gehuisvest en onderhouden in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van het Guangzhou Laboratory.

1. Myoblast isolatie van de spieren van de achterpoten van muizen (voorbeeld van het gebruik van 1 muis)

1. Verdun ijsazijn met ddH₂O tot 0,02 M en autoclaaf het.
2. Verdun collageen (uit rattenstaart) tot 0,1 mg/ml met 0,02 M azijnzuur.
3. Voeg deze collageenoplossing toe aan kweekschaaltjes om de bodem van de schaal een nacht in een celincubator van 37 °C te bedekken.
4. Verwijder voor gebruik de collageenoplossing en was de schaal twee keer met 1x PBS. Collageenoplossing kan 8-10 keer worden hergebruikt.
5. Offer een muis van 8-12 weken oud op. (Oude muizen hebben een slechte opbrengst van MuSC's en myoblasten.)
6. Isoleer en plaats alle spieren van de achterpoten van de muis in een schaal van 10 cm.
7. Gebruik 1x PBS (met penicilline/streptomycine) om de spieren 4 keer te spoelen. Breng na elke spoeling de spieren altijd over in een nieuwe plaat.
8. Verwijder na de laatste spoeling PBS en hak de spieren fijn met een schaar.
9. Voeg 6 ml 1x PBS bevattende dispase II (1,1 E/ml) en collagenase II (830 E/ml) toe om de gehakte spieren te verteren, en de spijsvertering zou ~1,5 uur moeten duren.
10. Om de spijsvertering uit te voeren, brengt u de gehakte spieren over in een buis in een waterbad van 37 °C of laat u de gehakte spieren direct in de schaal en plaatst u deze in een incubator van 37 °C CO₂ -cellen.
11. Als u een celincubator gebruikt om te verteren, schud het gerecht dan elke 15-30 minuten om de spijsvertering goed te mengen.
    OPMERKING: Dispase II moet eerst worden gemaakt als 11 E/ml bouillon met DMEM-media (geen serum), en collagenase II moet worden gemaakt als 10.000 E/ml bouillon met 1x PBS.
12. Wanneer de spijsvertering is voltooid, gebruikt u een plastic pipet van 10 ml om de verteerde weefsels meerdere keren op en neer te spoelen om het verteringsmengsel grondig te homogeniseren.
13. Voeg 10 ml MuSC/Myoblast groeimedia toe om de spijsvertering te vertragen. Details over de bereiding van MuSC/Myoblast groeimedia zijn te vinden in hoofdstuk 2.
14. Haal het mengsel door een zeef van 70 μm. Gebruik 1x PBS om de spijsverteringsplaat te spoelen en laat deze PBS ook door de zeef lopen, om alle cellen in de spijsverteringsplaat te verzamelen.
15. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 350 x g en gooi het supernatans weg met vacuüm.
16. Resuspendeer de celpellet met 20 ml 1x PBS en laat de cellen door een zeef van 40 μm lopen.
17. Centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatans met vacuüm.
18. Gebruik 20 ml MuSC/Myoblast groeimedia om de cellen te resuspenderen en de cellen te zaaien in een normale plastic plaat van 10 cm. MuSC's kunnen zich gedurende deze tijd niet aan de plaatbodem hechten en blijven meestal in de media zweven.
    LET OP: Dit is de eerste pre-plating op plastic platen.
19. Schud na 1,5 uur de plaat kort op en breng de vloeistof over in twee met collageen beklede schalen van 10 cm, waarbij elk schaaltje 10 ml cultuur bevat. Nu zullen de MuSC's zich hechten en groeien op de met collageen beklede platen. Verander de media na 2 dagen. Met collageen beklede platen worden voorbereid zoals in stap 1-4 van dit gedeelte.
20. Passage na nog een dag door de cellen: verwijder de media, was de cellen een keer met 1x PBS en probeer de cellen te proberen.
21. Gebruik MuSC/Myoblast groeimedia om de cellen van de platen te spoelen, verplaats de cellen naar een nieuwe plastic plaat en incubeer gedurende 40 minuten in de celincubator.
    LET OP: Dit is de tweede pre-plating op plastic platen.
22. Giet de cultuur in een nieuwe plastic plaat en incubeer nog 20 minuten in de celincubator.
    LET OP: Dit is de derde pre-plating op plastic platen.
23. Splits vervolgens het supernatans in de plaat in 8 met collageen beklede schaaltjes van 10 cm om de cellen te subcultureren. De doorgangsverhouding is hier 2:8 (1:4). Na drie keer voorplateren zoals hierboven beschreven, kunnen de myoblasten meer dan 90% zuiver bereiken. Daarom is het na dit punt niet nodig om voor te platen bij het verder passeren van de myoblasten.

2. Bereiding van MuSC/Myoblast groeimedia (Voorbeeld van bereiding van 5 muizen)

1. Offer 5 jonge en gezonde wildtype muizen op, isoleer de milten en spoel de milt één keer met 1x PBS (met penicilline/streptomycine).
2. Gebruik een schaar om de donkere delen/vlekken op de milt te verwijderen, indien aanwezig. Gooi de milt weg als het grootste deel ervan zwart is geworden.
3. Plaats alle 5 de milten in een zeef van 40 μm op de bovenkant van een tube van 50 ml.
4. Open een steriele verpakking van een spuit van 1 ml, trek de zuiger eruit en gooi de cilinder weg.
5. Houd in de zeef van 40 μm de rubberen stop vast en gebruik de duimsteun van de zuiger om de miltweefsels te vermalen en los te koppelen tot afzonderlijke cellen. Zorg ervoor dat u de duimsteun van de zuiger niet aanraakt en verontreinigt wanneer u de verpakking van de spuit openscheurt.
6. Gebruik tijdens het malen van de milt af en toe 1x PBS om de gedissocieerde miltcellen af te spoelen in de buis van 50 ml onder de zeef.
7. Nadat alle miltcellen door de zeef in de buis van 50 ml zijn gespoeld, centrifugeert u de buis gedurende 10 minuten op 500 x g .
8. Gebruik 1 ml 1x lysebuffer voor rode bloedcellen om de pellet te resuspenderen. Lyseer de rode bloedcellen gedurende ~1 min.
   OPMERKING: 10x lysebuffer voor rode bloedcellen bevat 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ en 1 mM EDTA-dinatriumzout in ddH₂O. Filter om te steriliseren en niet autoclaveren. Voor gebruik verdunnen met ddH₂O tot 1x.
9. Vul de tube van 50 ml met 1x PBS om het lyseringsproces van rode bloedcellen te stoppen.
10. Zeef de celsuspensie opnieuw met een zeef van 40 μm en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 500 x g .
11. Resuspendeer de cellen met 2 ml RPMI-1640 full media (RPMI-1640 media met 10% FBS en penicilline/streptomycine) met zeer voorzichtig pipetteren.
12. Voeg meer RPMI-1640 full media toe aan de tube en meng goed. Verdeel de celsuspensie over tien T75-kweekkolven. Het uiteindelijke kweekvolume in elke T75-kweekkolf moet 20 ml zijn.
13. Voeg 10 μL Concanavalin-A-bouillon toe aan elke T75-kweekkolf en meng goed. Concanavalin-A activeert de proliferatie van T-cellen.
    OPMERKING: Concanavalin-A voorraad is 4 mg/ml en bereid door Concanavalin-A op te lossen in 1x PBS. De Concanavalin-A zelf wordt hier gebruikt, en verwar het niet met de Concanavalin-A-kralen die later in CUT&Tag-assays worden gebruikt.
14. Vul na 48 uur elke T75-kolf aan met nog eens 20 ml RPMI-1640 full media, zodat het totale volume optelt tot 40 ml.
15. Verzamel nog eens 24 uur later alle cultuur in elke T75-kolf en centrifugeer deze gedurende 3 minuten op 600 x g .
16. Het supernatans is T-cel conditionele media en kan tot 2 maanden worden bewaard bij -20 °C tot -80 °C. Gooi de miltcelkorrels weg. Ontdooi voor gebruik de voorwaardelijke media van de T-cel en steriliseer de media verder met behulp van een filter van 0,22 μm.
17. Om Ham's F10 volledige media te maken, voegt u 100 ml FBS, 300 μL bFGF-bouillon en 6 ml penicilline/streptomycine toe aan 500 ml Ham's F10-media.
    OPMERKING: bFGF-voorraad is 5 μg/ml en wordt bereid door bFGF op te lossen in Ham's F10-media.
18. Meng de volledige F10-media van de Ham met gefilterde T-cel voorwaardelijke media zoals hierboven beschreven in een verhouding van 1:1 om MuSC/Myoblast-groeimedia te maken.

3. CUT&Tag met myoblasten (Voorbeeld van 3 CUT&Tag reacties)

1. Bereiding van de belangrijkste reagentia
   1. Zuiver de pA/G-Tn5-transposase in eigen beheer uit de bacteriecultuur met behulp van gepubliceerde methode¹⁴. Dit enzym bereikt pas zijn functionele vorm als het wordt gemonteerd met DNA-adapters die een bibliotheek maken. Het belangrijkste is dat pA/G-Tn5 in de handel verkrijgbaar is bij vele bronnen.
   2. De oligo's om adapters te maken zijn weergegeven in tabel 1. In het bijzonder, gloeien Oligo-Rev met respectievelijk Oligo-A en Oligo-B, om dienovereenkomstig dubbelstrengs Adapter-A en Adapter-B te maken. De details voor het gloeien om de adapters te maken zijn elders te vinden¹⁴.
   3. Incubeer Adapter-A en Adapter-B met pA/G-Tn5-transposase bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 uur. Vervolgens zal deze transposase zijn functionele vorm aannemen. In de volgende paragrafen van dit manuscript zal de functionele vorm van pA/G-Tn5 pA/G-Tn5a worden genoemd.
      OPMERKING: Als de pA/G-Tn5 wordt gekocht in plaats van in eigen huis gemaakt, zorg er dan voor dat u duidelijk maakt of het gekochte artikel pA/G-Tn5 is gemonteerd met adapters (met andere woorden, klaar voor gebruik) of dat het gewoon het pA/G-Tn5-enzym zelf is. Als het alleen om het enzym gaat, bereid dan de twee hierboven beschreven adapters voor en monteer ze op de pA/G-Tn5 voordat u dit enzym uiteindelijk gebruikt voor CUT&Tag.
   4. Voor de recepten van de Binding buffer, Wash buffer, Dig-wash buffer, 300-Dig buffer en Tagmentation buffer kunnen lezers ook verwijzen naar Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Bereid de bindingsbuffer voor, die 20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂ en 1 mM MnCl₂ bevat.
   6. Bereid de wasbuffer voor, die 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM Spermidine en 1x Proteaseremmercocktail bevat.
   7. Maak digitonine als een geconcentreerde bouillon in DMSO en bereid vervolgens Dig-wash buffer voor door digitonine toe te voegen aan Wash buffer tot een concentratie van 0,5 mg/ml.
   8. Bereid de antilichaambuffer voor door EDTA toe te voegen aan een concentratie van 2 mM en BSA tot een concentratie van 0,1% aan de Dig-wash-buffer.
   9. Bereid 300-Dig buffer met 20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidine, 1x Proteaseremmercocktail en 0,1-0,5 mg/ml digitonine.
   10. Bereid de tagmentatiebuffer voor door de 300-Dig buffer aan te vullen met 10 mM MgCl₂. MgCl₂ kan de enzymatische activiteit van pA/G-Tn5a activeren.
       OPMERKING: Informatie voor andere materialen vindt u in het bestand Materiaaltabel .
2. Activering van Concanavalin-A kraal
   1. Meng 30 μL Concanavalin-A-korrels (10 μL voor elke reactie) in 300 μL bindingsbuffer in een centrifugebuisje van 1,5 ml. Keer meerdere keren om om goed te mengen. Leg de buis op een magnetisch rek. Nadat de vloeistof helder is, verwijdert u het supernatant.
   2. Haal de tube uit het magnetische rek, voeg 300 μL bindingsbuffer toe aan de tube, meng goed en verdeel gelijkmatig over 3 tubes van een 8-PCR buisstrip. Wijs elke buis aan met één CUT&Tag-reactie.
   3. Plaats de 8-PCR buisstrip op een magnetisch rek en wacht tot de vloeistof helder is.
   4. Zuig het supernatans op en verwijder de buizen van het magnetische rek. Voeg 10 μL bindingsbuffer toe aan elke tube en meng goed. Leg de voorbereide kralen op ijs of bij 4 °C tot de cellen klaar zijn om verder te gaan.
3. Cellen binden aan Concanavalin-A kralen
   1. Trypsiniseer gekweekte muizenmyoblasten van de platen, was de cellen één keer met RT 1x PBS en resuspendeer de cellen uiteindelijk in de wasbuffer bij RT. Vermijd overtrypsinisatie, omdat dit de affiniteit van het celmembraan met Concanovalin-A-kralen in gevaar kan brengen.
   2. Pas de celdichtheid aan tot ongeveer 7 x 10⁵ cellen/ml in wasbuffer zodat 100 μL celsuspensie ongeveer 70.000 cellen bevat, voldoende voor één CUT&Tag-reactie.
   3. Pipetteer 100 μL van de celsuspensie in elk buisje van de 8-PCR-buisstrip, die al 10 μL bereide Concanavalin-A-korrels bevat. Meng goed en incubeer op een "wipbeweging" shaker gedurende 10 minuten bij RT.
   4. Plaats de 8-PCR buisstrip op een magnetisch rek. Wacht tot het helder is en verwijder het supernatant.
   5. Om te beoordelen of de Concanavalin-A-kralen de cellen efficiënt hebben afgezonderd, controleert u het supernatans onder een microscoop om te zien hoeveel cellen er nog in het supernatant zitten. Na de stap van de Concanavalin-A-parelbinding moeten zeer weinig of geen cellen in de supernatant worden waargenomen.
4. Incubatie van de cellen met een primair antilichaam
   1. Verdun voor elk monster 1 μL H3K4me1-antilichaam tot 50 μL antilichaambuffer en voeg het verdunde antilichaam toe aan elk monsterbuisje. Meng de bolletjes goed met het verdunde antilichaam door de buisjes meerdere keren om te draaien. Leg de monsters op de "wipbeweging"-shaker om ze een nacht bij 4 °C te incuberen.
      OPMERKING: Zoals vermeld door Dr. Steven Henikoff¹, was het niet nodig om een IgG-negatieve controle te gebruiken in alle CUT&Tag-tests. In vergelijking met ChIP's hebben CUT&Tag-assays een veel lager of geen achtergrondsignaal. Daarom levert het gebruik van IgG om een "negatieve controle" CUT&Tag-test uit te voeren geen nuttige informatie op. Daarentegen is het gebruik van een CUT&Tag-gevalideerd antilichaam om een positieve controle uit te voeren belangrijk om te beoordelen of de CUT&Tag-test heeft gewerkt.
5. Incubatie van de cellen met een secundair antilichaam
   1. Leg de volgende dagochtend de monsters op het magnetische rek en wacht tot de monsters helder zijn.
   2. Verwijder het supernatant, het primaire antilichaam. Het is niet nodig om de kralen te wassen; Voeg direct 50 μL verdund (1:100) secundair antilichaam toe aan elk monsterbuisje.
      OPMERKING: Secundair antilichaam wordt verdund met Dig-wash-buffer in een verhouding van 1:100. Om een efficiëntere herkenning van pA/G-Tn5a mogelijk te maken, mogen secundaire antilichamen niet worden geconjugeerd met moleculen of groepen zoals HRP, biotine of fluoroforen.
   3. Meng goed en incubeer op de "wipbeweging" shaker bij RT gedurende 1 uur.
   4. Plaats de monsters terug op het magnetische rek, wacht tot de monsters helder zijn en gooi het supernatant weg.
   5. Voeg 200 μL Dig-wash buffer toe aan elke tube en keer meerdere keren om om de overtollige antilichamen weg te spoelen.
   6. Plaats het terug op het magnetische rek, wacht tot het helder is en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer om overtollige ongebonden antilichamen volledig te verwijderen.
6. Incubatie van de cellen met pA/G-Tn5a
   1. Na de laatste wasbeurt legt u de monsters op het magnetische rek, wacht tot de monsters helder zijn en verwijder alle vloeistof in de buis. Voeg voor elk monsterbuisje 100 μl 300-Dig-buffer toe die pA/G-Tn5a bevat bij 0,04 μM. Meng goed en incubeer op de wip-bewegingsschudder gedurende 1 uur bij RT.
   2. Plaats op het magnetische rek. Wacht tot de monsters helder zijn en verwijder het supernatant.
   3. Voeg 200 μL 300-Dig-buffer toe aan elk monster, meng goed en plaats het op de shaker om het monster 3 minuten bij RT te wassen.
   4. Plaats op het magnetische rek. Wacht tot de monsters helder zijn en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer om overtollige pA/G-Tn5a te verwijderen en de achtergrond te verlagen.
7. Splitsing en tagmentatie van het genoom
   1. Na de laatste wasbeurt legt u de monsters op het magnetische rek en spuit u de vloeistof grondig van de buis. Voeg voor elk monster 50 μL tagmentatiebuffer toe. Meng goed en incubeer in een PCR-machine bij 37 °C gedurende 1 uur. Gebruik de dekselverwarmingsfunctie van de PCR-machine niet.
      OPMERKING: Optioneel kunnen, vanwege de slijtage van het materiaal tijdens de volgende genomische DNA-zuiveringsstap, enkele spike-in-DNA's worden toegevoegd aan de tagmentatiebuffer, zodat de spike-in zal verschijnen in de uiteindelijke sequentieresultaten en kan worden gebruikt om de gegevens te normaliseren. De methode voor het prepareren en gebruiken van het spike-in DNA is elders te vinden¹⁴.
8. Totale genomische DNA-zuivering
   1. Voeg na tagmentatie nog eens 150 μL tagmentatiebuffer toe voor elk monster. Het totale volume is nu 200 μL.
   2. Voeg vervolgens voor elk monster 10 μL 0,5 M EDTA, 3 μL 10% SDS en 2,5 μL 20 mg/ml Proteïnase K. Vortex toe om goed te mengen en gedurende 2 uur bij 55^°C te incuberen.
   3. Pipetteer elk monster in 200 μl fenol/chloroform in een centrifugebuis van 1,5 ml en draaikolk gedurende 10 s. Centrifugeer op 18.000 x g gedurende 5 min. Breng de bovenste laag over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
   4. Voeg 200 μL chloroform toe aan elke buis en draai gedurende 10 s. Centrifugeer op 18.000 x g gedurende 5 min.
   5. Zuig de bovenste laag op in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg vervolgens voor elk monster 550 μl 100% ethanol toe om het DNA gedurende 1 uur bij -80 °C te laten neerslaan. Om de DNA-korrel beter te visualiseren, voegt u 1 μL 20 mg/ml glycogeen toe.
   6. Centrifugeer op maximale snelheid (>18.000 x g) gedurende 15 minuten om het DNA te pelleteren.
   7. Giet het supernatant voorzichtig af, was de glycogeen/DNA-pellet eenmaal met 75% ethanol en centrifugeer opnieuw op maximale snelheid gedurende 5 minuten.
   8. Verwijder de 75% ethanol en resuspendeer de glycogeen/DNA-pellet met 21 μL ddH₂O.
9. Voorbereiding en volgorde van de bibliotheek
   1. Stel de PCR voor het voorbereiden van de bibliotheek in. Om de te sequencen monsters samen te indexeren, gebruikt u voor elk monster een andere N7XX Illumina-primer en een universele N5XX Illumina-primer. Als u meer dan 12 monsters indexeert, zijn ook andere N5XX Illumina-primers nodig. Illumina levert twaalf N7XX primers en acht N5XX primers, dus het totaal aantal N7XX met N5XX combinaties is 12 x 8 = 96. De opstelling van de PCR-reactie wordt weergegeven in Tabel 2.
   2. Bepaal ruwweg het PCR-cyclusnummer in PCR voor het bereiden van bibliotheken aan de hand van het celnummer dat wordt gebruikt in de CUT&Tag-test. Normaal gesproken zijn voor een CUT&Tag-test met 50.000-100.000 cellen 9-12 cycli voldoende, en celaantallen tussen 10.000-50.000 kunnen tot 14 cycli vereisen. Het PCR-programma wordt weergegeven in tabel 3.
      OPMERKING: Voor de meeste CUT&Tag-assays, als het antilichaam goed heeft gefunctioneerd, zou een PCR-cyclusnummer tussen 9-14 altijd een nuttige bibliotheek voor sequencing moeten genereren. Een goede bibliotheek is normaal gesproken 10-50 ng/μL (bepaald door Qubit-assay) in concentratie en 20-30 μL in volume. Integendeel, als het antilichaam niet efficiënt en specifiek werkte, kan alleen het verhogen van het cyclusnummer de experimenten niet redden. Te hoge cyclusaantallen komen de resultaten helemaal niet ten goede en introduceren in plaats daarvan meer PCR-duplicaten, wat later de gegevensanalyse zal bemoeilijken.
   3. Gebruik een aantal in de handel verkrijgbare DNA-zuiverings-/maatselectiekralen om het DNA van de bibliotheek te zuiveren en het DNA van de gewenste grootte te selecteren.
   4. Verdun een klein aliquot van de gezuiverde bibliotheek met water en gebruik het voor qPCR met locusspecifieke primers om verrijkingen te controleren zoals in ChIP-qPCR-experimenten. Voordat de volgorde van de bibliotheek wordt bepaald, kan dit helpen bepalen of de CUT&Tag heeft gewerkt.
   5. Voer sequencing en gegevensanalyse uit volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: CUT&Tag-kits zijn in de handel verkrijgbaar bij een handvol bedrijven, en een voorbeeld is te vinden in het bestand Materiaaltabel .

Resultaten

Voordat u cellen aan Concanavalin-A-korrels bindt, controleert u de celsuspensie onder de microscoop. Dienovereenkomstig, na het uitbroeden van de cellen met Concanavalin-A-korrels, plaatst u de monsterbuisjes op het magnetische rek en moet het supernatans opnieuw worden waargenomen met een microscoop. Dit is om te beoordelen hoe efficiënt de cellen zijn gevangen door Concanavalin-A-kralen. Wasbuffer met 7 x 10⁵ cellen/ml zou er onder de microscoop uit moeten zien als figuur 1A . Figuur 1B toont daarentegen het supernatans na Concanavalin-A-parelbinding, waarbij de kralen alle cellen hebben weggenomen. Het heeft geen zin om door te gaan met de volgende stappen van CUT&Tag als de Concanavalin-A-kralen niet eens efficiënt cellen hebben gevangen. Wasbuffer mag geen seruminhoud of EDTA/EGTA bevatten, omdat deze de binding van het celmembraan aan Concanavalin-A-korrels kunnen opheffen. Runderserumalbumine interfereert echter niet met de binding van concanavalin-A aan cellen.

Na het maken van de CUT&Tag bibliotheken door middel van PCR kan een klein aliquot van de bibliotheek (3-4 μL) worden geëlektroforesterd op een 1,2-1,5% agarosegel om te testen of de bibliotheek goed is. Figuur 2 toont het voorbeeld van succesvolle H3K4me1 CUT&Tag bibliotheken die we hebben gemaakt. In een histonmarkering of histonvariant CUT&Tag zijn de meeste gesplitste eenheden blijkbaar mononucleosomen, hoewel twee nucleosomen ook samen kunnen worden weggesneden. Drie nucleosomen die samen worden geknipt en gelabeld, zou zeer zeldzaam zijn. Daarom moet een nucleosoomarray met mono-nucleosomen, di-nucleosomen en zeer weinig tri-nucleosomen worden waargenomen in de elektroforese van HISTON-markering CUT&Tag-bibliotheken. Nucleosomen bevatten 147 bp DNA, maar met de sequencing-adapters toegevoegd door Tn5-transposase en bibliotheek-PCR, zou de totale grootte van een CUT&Tagged mononucleosoom 300 bp moeten bedragen, zoals weergegeven in figuur 2.

Voordat u geld uitgeeft aan high-throughput sequencing van de CUT&Tag-bibliotheken, is een andere kwaliteitscontrolemethode het uitvoeren van qPCR met locusspecifieke primers. Dit komt overeen met het uitvoeren van ChIP-qPCR. Bovendien zijn de locusspecifieke primers in CUT&Tag qPCR ontworpen op basis van dezelfde principes als ChIP-qPCR-primers. Figuur 3 toont de qPCR-amplificatie van verschillende locaties op de Myod1-genlocus. Myod1 codeert voor de hoofdtranscriptiefactor, MyoD, die de afstamming van skeletspieren bepaalt tijdens myogenese¹⁵. Zoals te zien is in figuur 3, is H3K4me1 sterk verrijkt in de kernversterker (CER) en het distale regulerende gebied (DRR) van de Myod1-locus. CER en DRR zijn zeer gevestigde enhancer-regio's voor Myod1¹⁶. Dit komt overeen met het goed gedocumenteerde fenotype dat H3K4me1 specifiek in opdracht aangeduide versterkers^{markeert 17}. Bovendien laat figuur 3 zien dat het H3K4me1-niveau erg laag is in het proximale regulerende gebied (PRR) omdat de nucleosomen in het proximale gebied van actieve promotoren normaal gesproken worden gemodificeerd met H3K4me3¹⁸ in plaats van H3K4me1. Alle primerparen voor deze beoordeelde loci zijn eerder gepubliceerd ^19,20, en de sequenties zijn te vinden in Tabel 4. Normaal gesproken zullen de onderzoekers, na de kwaliteitscontroles door bibliotheek-DNA-elektroforese en qPCR op specifieke loci, vol vertrouwen doorgaan met sequencing.

Figuur 1: Myoblasten geresuspendeerd in wasbuffer. Microscopische beelden genomen (A) voor en (B) na Concanavalin-A kraalbinding. Paneel B laat zien dat er bijna geen cellen meer over zijn in de suspensie na de incubatie van de Concanavalin-A-parel, wat aangeeft dat cellen efficiënt zijn opgevangen door de kralen. De kleine deeltjes in paneel B zijn waarschijnlijk de overtollige Concanavalin-A-korrels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Elektroforese van CUT&Tag bibliotheken. Er zijn drie onafhankelijke H3K4me1 CUT&Tag-assays uitgevoerd, en elk werd omgezet in een sequencingbibliotheek met behulp van Illumina-primers en PCR. Elke H3K4me1 CUT&Tag gebruikte 70.000 muizenmyoblasten. Bibliotheken bevatten meestal gelabelde mono-nucleosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: qPCR-amplificatie van verschillende locaties op de Myod1-genlocus . qPCR toont aan dat in muizenmyoblasten de H3K4me1-markering sterk verrijkt is in de enhancer-regio's van het Myod1-gen , wat overeenkomt met gepubliceerde conclusies. CER en DRR zijn gepubliceerde versterkers van Myod1 die zich stroomopwaarts van de Myod1-promotor bevinden. Houd er rekening mee dat de PRR geen H3K4me1-accumulatie heeft, en dit komt ook overeen met het feit dat actieve promotors voornamelijk zijn gemarkeerd met H3K4me3. De verrijkingen werden berekend door te normaliseren naar de verrijking van H3K4me1 op "genwoestijn" van monster "Repeat 1". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam	Sequenties (5'-3'):
Oligo-Rev	fos-CTGTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAG

Tabel 1: Oligosequenties voor het maken van Adapter-A en Adapter-B die op pA/G-Tn5-transposase moeten worden gemonteerd.

Fractie	Volume
Gezuiverd genoom-DNA na CUT&Tag-reactie	21 μL
N5XX primer (10 μM)	2 μL
N7XX primer (10 μM)	2 μL
NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix	25 μL
	Totaal 50 μL

Tabel 2: PCR-instelling voor de voorbereiding van de CUT&Tag-bibliotheek met behulp van Illumina-indexeringsprimers. Als u een in de handel verkrijgbare CUT&Tag-kit gebruikt die bibliotheek-PCR-reagentia bevat, zoals DNA-polymerasemix, volg dan de specifieke handleiding van die kit om de bibliotheek-PCR in te stellen.

Stap	Temperatuur	Tijd	Aantal cycli
1	72 oC	3 min	1
2	95 oC	3 min	1
3	98 oC	10 seconden	9 tot 14
4	60 oC	5 s en ga dan naar stap 3
5	72 oC	1 minuut	1
6	4 oC	houden	N.V.T

Tabel 3: PCR-programma voor de voorbereiding van de CUT&Tag-bibliotheek met behulp van Illumina-indexeringsprimers.

Plaats	Primer sequenties (5'-3')
CER	Vóór: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Vóór: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Vóór: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
DRR	Vóór: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Draai: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Vóór: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1 NL	Voor: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Herziening: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2 NL	Vóór: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
IgH-versterker	Vóór: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Herziening: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
De woestijn van het gen	Vóór: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tabel 4: Locus-specifieke primers voor het testen van H3K4me1-verrijking op verschillende locaties op het Myod1-gen .

Discussie

Het specifieke celnummer dat nodig is voor een bepaalde CUT&Tag-reactie is volledig afhankelijk van de verrijking van de histonmarkeringen/varianten of chromatinebindende eiwitten die moeten worden getest. Normaal gesproken zijn voor zeer verrijkte histonmarkeringen zoals H3K4me1, H3K4me3 en H3K27ac enz. 25.000-50.000 myoblasten voldoende voor één CUT&Tag-reactie. Voor sommige zeldzame chromatinebindende eiwitten kunnen echter tot 250.000 cellen nodig zijn. Het celnummer dat wordt gebruikt in CUT&Tag-assays is van cruciaal belang, wat, als het niet goed wordt behandeld, normaal gesproken het falen van de assay veroorzaakt. Het gebruik van een te groot aantal cellen in een CUT&Tag-reactie is schadelijk, vooral bij het testen van zeer verrijkte histonmarkeringen. Beginnen met te veel cellen betekent dat er onvoldoende antilichamen voor elke cel worden toegewezen. CUT&Tag werkt niet alleen met zeer lage celaantallen, het kan zelfs op enkelvoudig celniveau¹ worden toegepast.

Bovenal is het gebruik van een betrouwbaar en gevalideerd antilichaam met hoge affiniteit en specificiteit altijd de sleutel tot een succesvolle CUT&Tag-test. Net als ChIP-, immunoprecipitatie- (IP) en IF-assays, vereist CUT&Tag ook het type antilichamen dat de natuurlijk gevouwen antigenen kan herkennen^. Daarentegen moeten de antilichamen die alleen ontspannen peptiden in Western blot herkennen, strikt worden vermeden in de CUT&Tag.

Als het optimaliseren van het celaantal of het gebruik van een immunofluorescentie-gevalideerd of goed geciteerd antilichaam het slechte signaalprobleem in een CUT&Tag-test nog steeds niet kan oplossen, kijk dan of het eiwit van belang een chromatine-geassocieerd eiwit is dat zwak bindt of zelfs niet direct aan DNA bindt. Schakel in dit geval, zoals eerder vermeld, over op het gebruik van CUT&RUN in plaats van CUT&Tag. Als alternatief kan een lichte fixatie, zoals 5 minuten in 0,5% paraformaldehyde (gevolgd door 10 minuten blussen in 0,1 M glycine), een methode zijn die de moeite waard is om te testen. Echter, omdat we de fixatie nooit hebben toegepast in CUT&Tag assays, en we ook nooit de noodzaak zijn tegengekomen om de cellen te fixeren voordat CUT&Tag wordt uitgevoerd, kunnen we geen verdere opmerkingen maken over cross-linking.

We begrijpen dat sommige versies van CUT&Tag-protocollen beweren dat zowel RT (2 uur) als 4 °C ('s nachts) voor de primaire incubatiestap van antilichamen behoorlijke resultaten kunnen opleveren²¹. We raden echter ten zeerste aan om 4 °C ('s nachts) te gebruiken in plaats van RT gedurende 2 uur. Aan de andere kant wordt het ook niet aanbevolen om de incubatietijd langer dan één nacht te verlengen.

Wat betreft gevoeligheid, achtergrondcontrole en de mate van complexiteit voor onderzoekers om te hanteren, is CUT&Tag superieur aan ChIP-assays. Als er enkele nadelen moeten worden aangevoerd voor CUT&Tag in vergelijking met ChIP, dan is de enige dat CUT&Tag-protocollen geen interne normalisatiemethode bevatten, zoals het gebruik van "Input" in een ChIP-test¹. Daarom moeten onderzoekers bij het vergelijken van piekhoogtes tussen monsters met behulp van CUT&Tag om te beginnen het aantal cellen tussen monsters gelijk maken. Het is ook van cruciaal belang om technische replica's op te nemen.

Dit protocol presenteert de volledige details van het uitvoeren van CUT&Tag in muismyoblasten door een succesvol voorbeeld te geven van H3K4me1 CUT&Tag in dit celtype. De hier beschreven methode kan zonder aanpassingen direct worden toegepast op pas geïsoleerde MuSC's. Bovendien kunnen volgens dit protocol ook CUT&Tag-experimenten met histonmarkeringen, histonvarianten of transcriptiefactoren in andere celtypen worden uitgevoerd. Bij myotubes of myofibers kunnen eerst de kernen worden geïsoleerd en vervolgens kan CUT&Tag op de myonuclei worden uitgevoerd. Op deze manier kan men de kernen op dezelfde manier behandelen als cellen in dit CUT&Tag protocol. Myotubes en myofibers zijn cellen met meerdere kernen en we hebben niet getest of myotubes of myofibers rechtstreeks op Concanavalin-A-kralen kunnen worden gebonden, hoewel dit mogelijk is.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	Dit kit is door ons getest en werkt goed
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Voor bibliotheek-makende PCR-reactie
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Moet worden gemonteerd met adapters voor gebruik
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	Dit kit bevat Illumina N7XX en N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Kan Ampure XP beads vervangen. Kan CUT&Tag bibliotheken en DNA-fragmenten naar grootte zuiveren