Hier presenteren we een combinatie van effectieve rattenbeperking en subclavia-aderpunctiemethoden die snelle, veilige en herhaalde bloedafname bij ratten zonder verdoving mogelijk maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bloedafname van subclavia-aderen bij bewuste ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn verschillende gevestigde methoden voor het verkrijgen van herhaalde bloedmonsters van ratten, waarbij de meest gebruikte methoden laterale staartaderbemonstering zonder verdoving en halsaderbemonstering met anesthesie zijn. De meeste van deze methoden vereisen echter hulp en anesthesieapparatuur en leveren soms problemen op in termen van bloedafname of de slechte kwaliteit van bloedmonsters. Bovendien nemen deze methoden voor bloedafname veel tijd en personeel in beslag wanneer herhaalde bloedafname vereist is voor een groot aantal ratten. Deze studie presenteert een techniek voor herhaalde bloedafname bij niet-verdoofde ratten door een enkel bekwaam individu. Zeer bevredigende bloedmonsters kunnen worden verkregen door de subclavia-ader te doorboren. De methode toonde een indrukwekkend algemeen slagingspercentage van 95%, met een mediane tijd van slechts 2 minuten tussen het fixeren van ratten en het voltooien van de bloedafname. Bovendien brengt het uitvoeren van opeenvolgende bloedafnames binnen het aangegeven bereik geen schade toe aan de ratten. Deze methode is de moeite waard om te promoten voor bloedafname, vooral in grootschalige farmacokinetische onderzoeken.
Inleiding
Ratten zijn een van de meest voorkomende proefdieren en er zijn veel manieren om bloedmonsters te verkrijgen. Voor experimenten met een enkele bloedafname in de eindfase kan een voldoende hoeveelheid bloed worden verkregen door middel van een hartpunctie of abdominale aorta-bloedafname1. Sommige onderzoeken vereisen echter herhaalde bloedafname van ratten voor routinematige bloed- of biochemische analyse, vooral in farmacokinetische en toxicologische onderzoeken, waarbij herhaalde bloedafname vereist is om de absorptie, distributie en het metabolisme van geneesmiddelen te bepalen.
Hoewel bloedafname in de staartader momenteel de meest gebruikelijke methode is voor bloedafname bij ratten, ondanks dat er geen anesthesie nodig is, kan deze methode een uitdaging zijn voor herhaalde bloedafname en is het volume van het verzamelde bloed relatief klein 3,4. Bovendien, hoewel bloed kan worden afgenomen uit de saphena en penisaderen, is de hoeveelheid verkregen bloed beperkt en is anesthesie vereist 1,5. Bovendien leveren bloedmonsters die zijn verzameld uit de submandibulaire veneuze plexus, evenals sublinguale, halsslagaders en subclavia-aderen monsters van hogere kwaliteit, maar vereisen meestal anesthesie of de hulp van meerdere personen 1,6,7,8,9. Ten slotte vereist retro-orbitale bloedafname van sinussen/kanalen niet alleen anesthesie, maar kan het mogelijk ook letsel en stress veroorzaken bij de ratten9.
De kwaliteit van bloedmonsters die doorgaans uit grote aderen worden verkregen, is over het algemeen van de hoogste standaard1. Op dit moment hebben sommige onderzoeken aangetoond dat continue microbemonstering via de halsader een zeer geschikte methode is voor toxicologisch onderzoek bij ratten, hoewel deze methode meestal halsaderkatheterisatie vereist 10,11,12. Daarom is het de moeite waard om te onderzoeken hoe bloedmonsters van hoge kwaliteit kunnen worden verkregen in overeenstemming met het 3R-principe van dieronderzoek zonder chirurgische ingrepen. Het doel van deze studie was om een methode te presenteren voor het efficiënt afnemen van bloed uit de subclavia-ader bij ratten. Deze techniek maakt het mogelijk om snel bevredigende monsters te verzamelen door middel van een eenpersoonsprocedure zonder dat anesthesie nodig is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie voldeed aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in de 8e editie van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren13. Het onderzoek kreeg goedkeuring van de ethische commissie van het Lanzhou University Second Hospital en werd gedocumenteerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen 2.014. Twaalf gezonde Wistar-ratten (zes mannetjes met een gewicht van 290-330 g en zes vrouwtjes met een gewicht van 250-280 g) in de leeftijd van 12-16 weken werden gedurende 3 dagen vóór het eigenlijke experiment ondergebracht in het GLP Animal Laboratory van de Universiteit van Lanzhou. De gebruikte rattenkooien waren van het type R5, met afmetingen van 545 mm x 395 mm x 200 mm, en waren uitgerust met geautoclaveerd strooisel. Alle ratten kregen onbeperkte toegang tot zowel voedsel als water. Het laboratorium handhaafde een gemiddelde luchtvochtigheid van 25%, een gemiddelde temperatuur van 24 °C en een lichtcyclus die afwisselend dag en nacht (7:00 uur/19:00 uur) was. Aan het einde van het onderzoek werden alle dieren op humane wijze geëuthanaseerd met behulp van een overdosis isofluraan. Voor uitgebreide informatie over de materialen en instrumenten die in dit onderzoek zijn gebruikt, verwijzen wij u naar de Tabel met Materialen.
1. Berekening van de steekproefomvang en selectie van dieren
- Kies de resourcevergelijkingsmethode15 om de steekproefomvang van dieren te schatten met behulp van vergelijking (1).
E = Totaal aantal dieren − Totaal aantal groepen (1)
Waarbij E de mate van vrijheid van variantieanalyse (ANOVA) is en varieert van 10 tot 20.
OPMERKING: In deze studie werden 12 dieren verdeeld in twee groepen A en B (drie mannetjes en drie vrouwtjes per groep). - Definieer de primaire uitkomst van dit onderzoek als het slagingspercentage en de tijdsbesteding van herhaalde bloedafname door een enkele persoon.
- Definieer de secundaire uitkomstmaten als veranderingen in het lichaamsgewicht van ratten, voedsel- en waterinname, evenals de incidentie van bijwerkingen (zoals sleutelbeenfracturen, onderhuidse hematomen, pneumothorax en mortaliteit).
- Definieer succesvolle bloedafname als het voldoen aan de volgende criteria: i) minder dan drie puncties voor een enkele bloedafname; ii) een totale tijd (tussen fixatie van de rat tot voltooiing van de bloedafname) van niet meer dan 5 minuten; en iii) het bereiken van het beoogde bloedvolume bij het verkrijgen van helder plasma. Beschouw elke afwijking van deze criteria als een steekproeffout.
2. Fixatie van dieren en bloedafname
OPMERKING: Bloedmonsters van groep A - en B-ratten werden verzameld door twee ervaren onderzoekers, die beiden ten minste 100 bloedmonsters hadden genomen. Bloedmonsters werden verzameld van beide groepen ratten voor een totaal van 96 keer in de loop van 4 dagen. Deze bloedafnamemethode vereist geen anesthesie of extra fixatiemiddelen voor de ratten. Het vereist echter bedreven hanteringstechnieken.
- Om 8:00 uur op de dag voor bloedafname (dag 1), wijs je elke rat toe aan zijn individuele kooi terwijl zijn voedsel en water worden gewogen. Laat vervolgens een andere onderzoeker, blind voor de metingen, vanaf dag 1 elke dag om 8:00 uur het gewicht, de voedselconsumptie en de waterinname van de ratten noteren.
- Om dit protocol te volgen, neemt u elke dag eerst om 10.00 uur en vervolgens om 22.00 uur bloed af, waarbij u afwisselend 0,15 ml bloed verzamelt uit de subclavia-aderen aan beide zijden.
OPMERKING: De hoeveelheid bloed die moest worden afgenomen, werd bepaald door het maximale volume dat de rat met het laagste gewicht binnen een week kon verdragen. - Spoel een spuit met natriumheparine (25 E/ml) en desinfecteer de injectieplaats met alcohol.
- Aai zachtjes over de rughuid van de rat en knijp herhaaldelijk in zijn nek om de rat te helpen ontspannen (video 1).
- Gebruik de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand om de nekhuid van de rat stevig vast te pakken en op te tillen (Figuur 1A en video 1).
- Gebruik met coördinatie van de dominante hand de resterende drie vingers en de palm van de niet-dominante hand om de rughuid van de rat vast te zetten en zijn voorste ledematen te immobiliseren (Figuur 1B, C en Video 2).
OPMERKING: Als de rat zich verzet of worstelt, kan deze procedure meerdere keren worden herhaald om de rat te helpen wennen aan de behandeling. De volgende stappen zijn de sleutel tot een succesvolle bloedafname. - Gebruik de wijsvinger van de niet-dominante hand om voorzichtig de huid van de kop van de rat naar beneden te duwen, terwijl de andere vingers, samen met de handpalm, helpen bij het naar buiten draaien van het schoudergewricht. Gebruik tijdens dit proces de dominante hand om het schoudergewricht van de rat volledig uit te strekken (Figuur 1D-F en Video 2).
- Pak de rat stevig vast met de niet-dominante hand om de kop en het lichaam van de rat in een rechte lijn uit te lijnen (Figuur 1G,H). Gebruik vervolgens de dominante hand om de positie van het sleutelbeen te lokaliseren en de prikplaats te bevestigen (Figuur 1I, Video 2 en Video 3).
LET OP: Het scheren van de rat is niet nodig. In figuur 1 werd alleen geschoren om het sleutelbeen en de punctiepositie in grotere mate te laten zien. Bij het in bedwang houden van ratten, vooral ratten >350 g, zal het toestaan van de rat om zijn poten op een stevige ondergrond te laten rusten, helpen om hun lichaamsgewicht te ondersteunen. Bovendien moet de weerhouder de ademhalingsfrequentie van elke rat controleren terwijl hij bloed verzamelt om ervoor te zorgen dat de fixatie niet te strak zit, wat ademnood kan veroorzaken. - Houd de spuit evenwijdig aan het lichaam van de rat in de dominante hand, met de punt van de naald naar boven gericht en de schaal van de spuit naar de onderzoeker gericht, en houd een hoek van ongeveer 15° aan met de middellijn van het lichaam van de rat. Steek de naald 0,5 cm onder de inkeping van het sleutelbeen (op de kruising van het proximale derde deel van het sleutelbeen en het borstbeen) en zorg ervoor dat de naald evenwijdig blijft aan het lichaam van de rat (Figuur 1J en video 3).
OPMERKING: Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de hoek en diepte van het inbrengen van de naald om te voorkomen dat het bloedvat wordt doorboord of onbedoelde schade aan aangrenzende bloedvaten wordt veroorzaakt. - Trek de spuit voorzichtig iets terug om een negatieve druk te creëren, vaak vergezeld van een voelbaar gevoel van doorbraak bij het binnendringen van het bloedvat (vooral uitgesproken tijdens de eerste bloedafname). Houd deze positie aan en verzamel indien nodig 0,1-1,0 ml bloed met een constante snelheid (volgens de IACUC-richtlijnen van ongeveer 4-5,3 ml/kg bloed per week1) (Figuur 1K en video 3).
- Als er geen bloed is bij het prikken, probeer dan voorzichtig de hoek en diepte van de naald aan te passen of draai de spuit voorzichtig rond (video 3). Als drie opeenvolgende pogingen aan dezelfde kant niet succesvol zijn, stop dan alle bloedingen en schakel vervolgens over naar de andere kant voor de punctie.
OPMERKING: Een snelle punctie door de huid is raadzaam om te voorkomen dat de rat door ongemak worstelt. - Breng een wattenstaafje aan voor hemostase en breng de rat terug naar zijn kooi (video 4).
- Verwerk de bloedmonsters volgens de experimentele vereisten.
3. Verwerking van bloedmonsters
- Gooi de naald van de spuit weg in een naaldencontainer. Breng het verzamelde bloed over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die eerder is gespoeld met heparine. Plaats de buis in een centrifuge, stel deze in op 4 °C en 1.200 x g, en centrifugeer gedurende 10 minuten om het plasma te scheiden. Breng het serum met behulp van een pasteurpipet van 1,0 ml over in een schone microcentrifugebuis en bewaar deze bij -80 °C.
NOTITIE: Om hemolyse als gevolg van druk te voorkomen, verwijdert u indien nodig de punt van de naald. Vermijd tijdens plasma-aspiratie het afnemen van bloedcellen uit de bodem van de buis. Af en toe kan het oppervlak van de spuit rattenbont verzamelen; Zorg ervoor dat er geen vacht in de buis komt, omdat dit tot stolling kan leiden.
4. Statistische analyse
- Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie en test ze op homogeniteit van variantie.
- Gebruik de exacte test van Fisher om de slagingspercentages tussen groepen te vergelijken.
- Gebruik een onafhankelijke t-toets met twee steekproeven om de totale gemiddelden tussen de twee groepen te vergelijken.
- Gebruik variantieanalyse (ANOVA) voor continue metingen zoals bloedafnametijd, lichaamsgewicht, voedselinname en waterverbruik. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Plasmamonsters van hoge kwaliteit vertonen een lichtgele tint, helderheid en transparantie, zonder enige rode tint of stolling, zoals afgebeeld in figuur 2A. Figuur 2B toont hemolyse (linkerkant) of coagulatie (rechterkant) als gevolg van onjuiste procedures, respectievelijk. In de loop van 96 bloedafnamesessies binnen 4 dagen waren de gemiddelde enkelvoudige bloedafnametijden voor groep A en B respectievelijk 119,87 ± 33,62 s e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel bloedafname in de staartader de meest gebruikelijke methode is voor herhaalde bloedafname bij ratten, kan deze worden beïnvloed door anesthesiemiddelen, en vanwege de kleine omvang van de staartader is de hoeveelheid bloed die in één keer kan worden afgenomen beperkt, wat leidt tot een langere bloedafnameduur 4,5. Hoewel high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) -tandem massaspectrometrie (MS/MS) systemen in combinatie met capillaire microsampling (C...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het Cuiying Plan Project van het Lanzhou University Second Hospital (subsidienr. PR0121015) en Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (subsidie nr. 0412D2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.75% normale zoutoplossing | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Bereide heparine natriumoplossing |
| 1 mL Pasteur pipet | Biosharp | BS-XG-01-NS | Bloedverzameling |
| 1 mL spuit (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Bloedverzameling |
| 1,5 mL Eppendorf buisje | Biosharp | BS-15-M | Bloedopslag en -verzameling |
| 75% medische alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Desinfectie van de bloedafnameplek bij ratten |
| Centrifugebuiskoker | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Elektronische weegschaal | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Wegen |
| Heparine natrium injectie | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Spuit en EP-buisje spoelen; verdunnen met fysiologische zoutoplossing tot 25 U/mL |
| Laagtemperatuurcentrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Serumscheiding |
Referenties
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513(2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513(2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167(2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66075
