Methodenartikel

Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem

DOI:

10.3791/66077

⸱

11 april 2025

 ,  , 
1Department of Life Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences, 2Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naarmate CRISPR-gerelateerde protocollen steeds nuttiger en toegankelijker worden, kunnen er onder specifieke experimentele omstandigheden nog steeds complicaties en obstakels optreden. Dit protocol schetst de creatie van een receptor-interagerende serine/threonine-proteïne kinase 1 (RIPK1/RIP1) knock-out menselijke cellijn met behulp van CRISPR/Cas9 en benadrukt mogelijke uitdagingen die zich tijdens dit proces voordoen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een procedure voor het uitschakelen van het RIP1-gen met behulp van CRISPR/Cas9 in de menselijke monocyt U937-cellijn. De methode maakt gebruik van aangewezen gids-RNA-plasmiden en lentivirale verpakkingsplasmiden om RIP1-genknock-out te bereiken. Het protocol pakt uitdagingen en verbeteringen aan traditionele CRISPR-methoden aan, waardoor de replicatie ervan voor toekomstige celdoodstudies mogelijk wordt. De resulterende mutante cellen kunnen worden gebruikt om mechanistische veranderingen in celdood te onderzoeken, waar functionele RIP1-eiwitten anders een rol zouden spelen. Levensvatbaarheidstesten toonden een significante vermindering van celdood in knock-outcellen aan na inductie van necroptose. Fluorescentiemicroscopie toonde een duidelijke afname van mitochondriale reactieve zuurstofspecies (ROS) in knock-outcellen onder dezelfde omstandigheden. Samen bevestigen deze functionele testen het verlies van RIP1-eiwit. Deze procedure is geoptimaliseerd voor gebruik met menselijke U937-monocyten en kan ook worden aangepast om zich te richten op andere belangrijke celdoodregulatoren, wat functionele, niet-dodelijke mutanten oplevert. Mogelijke valkuilen worden overal aangepakt om inzicht te geven in uitdagingen die zich kunnen voordoen tijdens de generatie van mutanten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van de CRISPR/Cas9-technologie voor het bewerken van genen is snel geëvolueerd sinds de ontdekkingervan 1,2,3. Het vermogen om genen in cellijnen of bacteriën in te slaan of uit te schakelen is van onschatbare waarde voor het bevorderen van onderzoek en het begrip van intracellulaire mechanismen 1,2,3,4,5,6. Het CRISPR-Cas9-systeem verbetert eerdere methoden voor het bewerken van genen, zoals transcriptie-activator-achtige effectornuclease (TALEN), door de engineering van genspecificiteit te vereenvoudigen. Deze procedure omvat twee fundamentele componenten: gids-RNA (gRNA) dat wordt gebruikt om het beoogde gendoelwit te lokaliseren, en Cas9, een endonuclease dat de beoogde genoomlocatie wijzigt met een dubbelstrengs DNA-breuk 3,4. Het gRNA zal fungeren als een gids voor het Cas9-endonuclease om de dubbelstrengs breuk op de beoogde genetische sequentie te lokaliseren en te initiëren door middel van Watson-Crick-basenparing. Het volledige proces van genoombewerking door het CRISPR/Cas9-systeem omvat cellulaire machinerie die deze dubbelstrengs breuken in DNA herstelt door middel van niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologe recombinatie 3,7. Het is waarschijnlijker dat NHEJ zal optreden, waardoor effectief een mutatie in het genoom ontstaat die resulteert in een verlies van expressie voor het doelgen 3,4.

Commerciële bronnen zijn in staat geweest om bibliotheken van gRNA-doelen te creëren die tot expressie kunnen worden gebracht door bacteriegroei en isolatie, wat hun gebruiksgemak aanzienlijk verbetert. De belangrijkste beperking van het CRISPR/Cas9-systeem is echter de moeilijkheid om het gRNA- en Cas9-complex in doelcellijnen af te leveren. Deze beperkingen doen zich voor in suspensiecellijnen, omdat ze over het algemeen worden aangeduid als moeilijk te transfecteren8. Typische transfectiemethoden zijn over het algemeen niet efficiënt in het afleveren van het CRISPR/Cas9-systeem in suspensiecellen, daarom zijn virale afgiftemethoden zoals lentivirale transfectie en transductie beter geschikt voor dit type cellijn 8,9.

Dit type van transfectie vereist een lentivirale vector die gRNA en Cas9 endonuclease samen met toegevoegde lentivirale verpakkingsplasmiden codeert, die in een cellijn worden getransfecteerd die in staat is om lentivirale deeltjes te vervaardigen. Een typisch gekozen cellijn voor dit proces is HEK293T cellen, omdat ze gemakkelijker te transfecteren zijn en zeer efficiënt werken bij de assemblage van gRNA en Cas9 9,10. Deze deeltjes worden vervolgens vrijgegeven als lentivirussen in de supernatant, die kan worden gebruikt om het gRNA en Cas9 te transduceren in de beoogde suspensiecellijn, zoals U937 menselijke monocyten. Als zodanig heeft de hier beschreven procedure de volgende wijzigingen in vergelijking met gevestigde methoden: (1) Alternatieve transfectiemethode voor moeilijk te transfecteren cellijnen; (2) Het is niet nodig om CRISPR-plasmide-DNA te concentreren of een ultracentrifuge te gebruiken; en (3) Het elimineert de noodzaak van het klonen van één cel.

De directe focus van dit artikel was het uitschakelen van het RIP1-gen in menselijke monocyten van U937. De canonieke vorm van de zeer inflammatoire celdoodroute necroptose wordt gecontroleerd door RIP1, dat dient als een cruciaal doelwit voor celdoodstudies. 11,12,13,14 Naarmate RIP1 actief wordt door autofosforylering, rekruteert en veroorzaakt het directe fosforylering en activering van receptor-interagerende serine/threonine-proteïnekinase 3 (RIPK3/RIP3) en gemengde afstammingskinase domeinachtig (MLKL) pseudokinase om het necrosoom te vormen. Na deze vorming kan het necrosoom vrij door de cel bewegen om te interageren met organellen zoals de mitochondriën12,13. In de mitochondriën versterkt RIP1 een positieve feedbacklus met cellulair metabolisme, wat een directe invloed heeft op de productie van mitochondriale ROS, wat op zijn beurt verdere autofosforylering van RIP1, necrosoomvorming en de stroomafwaartse uitvoering van necroptose 11,12,13,14 bevordert.

Hoewel de focus van de huidige onderzoeksgroep ligt op de rol van RIP1 bij celdood, zijn andere redenen om RIP1 te bestuderen de rol ervan bij ontsteking en infectie. Bij activering door doodreceptoren zoals TNF-receptoren, bevordert RIP1 de activering van de NF-KB-signaleringsroute, die de transcriptie van pro-inflammatoire cytokines, chemokinen en andere moleculen die essentieel zijn voor de rekrutering van immuuncellen en de versterking van de ontstekingsreactieactiveert 15. Naast NF-KB-activering kan RIPK1 ook MAPK-signaleringsroutes activeren, waardoor de ontsteking verder wordt versterkt15,16. Wat betreft zijn rol bij reacties op infectie, fungeert RIP1 als een cruciale mediator van de ontstekingsreactie van de gastheer, met name als reactie op pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) die worden herkend door patroonherkenningsreceptoren (PRR's) zoals Toll-like receptoren (TLR's)17. Bovendien wordt RIP1 tijdens sepsis geactiveerd door signalering via doodsreceptoren zoals de TNF-receptor, wat leidt tot het initiëren van pro-inflammatoire cascades. RIPK1 bemiddelt de activering van de NF-KB- en MAPK-routes en bevordert de productie van pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α, IL-1β en IL-6, die belangrijke aanjagers zijn van de systemische ontstekingsreactie die kenmerkend is voor sepsis18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische weergave van de procedure is weergegeven in figuur 1. Gids-RNA (gRNA) en de doelsequentie worden gegeven in tabel 1. Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Oogsten van RIP1-gerichte CRISPR gRNA lentivirale expressievector die Cas9-endonuclease en puromycineresistentie bevat uit Escherichia coli

  1. Kwadrantstreep E. coli met lentivirale vector gRNAop LB-agarplaten aangevuld met 100 μg/ml ampicilline.
  2. Incubeer de platen gedurende 1-2 dagen bij 37°C totdat individuele kolonies zichtbaar zijn in het meest verdunde gebied op de plaat.
  3. Selecteer een enkele kolonie met een steriele lus en voeg elke kolonie afzonderlijk toe aan 5 ml LB-bouillon aangevuld met 100 μg/ml ampicilline in een conische buis van 50 ml. Zorg ervoor dat u grondig op en neer pipeteert na het toevoegen van de enkele kolonie om homogenisatie te garanderen.
  4. Ontlucht en plak de dop van de conische buis van 50 ml vast en incubeer in een orbitale schudder bij 37°C en 225 tpm gedurende 8 uur.
  5. Voeg tijdens de incubatie van 8 uur bij 37°C 40 ml LB-bouillon aangevuld met 100 μg/ml ampicilline toe aan elk van de vier afzonderlijke conische buisjes van 50 ml.
  6. Na de incubatie van 8 uur bij 37°C neemt u 40 μL gekweekte E. colicultuur en voeg het toe aan alle vier de conische buizen van 50 ml.
  7. Ontlucht en plak de doppen van de conische buizen van 50 ml vast en incubeer ze in een orbitale schudder bij 37°C en 225 tpm gedurende 12-16 uur.
  8. Na deze incubatie bij 37°C worden alle buizen 20 minuten bij 3220 x g in een draaiende emmerrotor gecentrifugeerd om de gekweekte E. coli-bacterie te pelleteren.
  9. Decanteer supernatanten in een afvalbeker en combineer vervolgens alle vier de pellets in 10 ml LB-bouillon aangevuld met 100 μg/ml ampicilline.
  10. Draai de gecombineerde pellets opnieuw op maximale snelheid in een slingerende emmerrotor gedurende 20 minuten om een enkele pellet te krijgen.
  11. Gooi zoveel mogelijk van de bovenstaande middelen in de afvalbeker en ga verder met een van de volgende opties: (1) Vries natte pellets in bij -80° gedurende maximaal 1 maand. (2) Ga verder met de zuivering van lentiviraal vectorplasmide.
    OPMERKING: Als optie 1 wordt gekozen, kan het protocol hier worden gepauzeerd.

2. Transfectie van HEK293T cellen met gezuiverde CRISPR gRNA lentivirale expressievector gericht op RIP1

  1. Zaai HEK293T cellen 's nachts met een concentratie van 3 × 106 tot 5 × 106 cellen in een plaat van 10 cm die DMEM bevat met 4,5 g/l D-glucose, L-glutamine, 110 mg/l natriumpyruvaat en 10 % door warmte geïnactiveerde FBS.
  2. Zorg er de volgende dag voor dat de platen ongeveer 70%-90% samenvloeien en ga dan verder met het protocol.
  3. Stel de transfectie van de cellen in met een verhouding van 1:1:1:1 van plasmiden (experimenteel CRISPR-plasmide: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) met behulp van het transfectiereagens in een verhouding van 3:1 (3 delen reagens: 1 deel plasmide-DNA), samen met verminderd serummedium.
    OPMERKING: Het pLP1: pLP2: pLP/VSVG-gedeelte van de verhouding is een lentivirale verpakkingsmix.
    1. Breng het transfectiereagens, het verminderde serummedium, het CRISPR-plasmide-DNA en de lentivirale verpakkingsmix in evenwicht tot kamertemperatuur voorafgaand aan het opzetten van transfectie.
    2. Meng 75 μL van het transfectiereagens, 2500 μL gereduceerd serummedium en 25 μg totaal DNA (berekening op basis van spectrofotometeranalyse voor CRISPR-plasmide-DNA en 1:1:1:1-verhouding met lentivirale verpakkingsmix).
    3. Laat dit mengsel 15-30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Piteer voorzichtig het volledige volume van dit mengsel op de confluente HEK293T celplaat rechtstreeks in de media (u hoeft de media niet te vervangen).
  4. Draai voorzichtig de plaat om adequate homogenisatie van de transfectiemix en plaatmedia te verzekeren. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C.

3. Lentivirale transductie van U937-cellen of doelwitcellen

  1. Zodra de incubatie van 48 uur bij 37 °C is voltooid, brengt u de media van de producent over HEK293T celplaat in een conische buis van 15 ml.
  2. Centrifugeer het volume op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de resterende HEK293T cellen te pelleteren. Verwijder al het virusbevattende supernatant, zorg ervoor dat u de gepelleteerde HEK293T cellen niet verstoort en bewaar het in een aparte conische buis van 15 ml. Ontsmet vervolgens de pellethoudende buis en gooi deze weg in de daarvoor bestemde afvalcontainer voor biologisch gevaarlijk afval.
    OPMERKING: Op HIV gebaseerde lentivirus-supernatanten kunnen worden bewaard bij -80°C; Dit brengt echter een risico met zich mee van maximaal 55% verlies van virusstabiliteit na de eerste vries-/dooicyclus19.
  3. Tel en verkrijg een pellet van 2 × 106 U937-cellen in een conische buis van 15 ml door een geschikt volume gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 400 x g te centrifugeren en het bovenstaande te decanteren, waarbij de celpellet in de buis blijft.
  4. Resuspendeer de U937-celpellet met al het virusbevattende supernatans en centrifugeer de buis vervolgens gedurende 60 minuten bij 290 x g .
  5. Gebruik na het centrifugeren een pipet om de pellet te resuspenseren met het virusbevattende supernatans dat zich al in de buis bevindt.
  6. Plaats de buis gedurende 60 minuten op een end-over-end rotator (of een soortgelijk roterend apparaat).
    1. Na deze incubatie centrifugeren de buisjes bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
    2. Resuspendeer de celpellet met een mediamengsel van 1:1 van zowel virusbevattende supernatanten als volledige RPMI-1640-media aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerde FBS.
  7. Breng het celmengsel over op een weefselkweekplaat van 10 cm en incubeer gedurende 48 uur bij 37°C.
  8. Na deze incubatie centrifugeren de U937-cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g en verwijderen we het supernatant.
    1. Resuspendeer de pellet met volledige RPMI-1640-media aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerde FBS en 5 μg/ml puromycine en breng de cellen over in een T25-kolf.
    2. Incubeer de cellen 2-3 weken onaangeroerd bij 37 °C en controleer ze elke 1-2 dagen op tekenen van celgroei.
      OPMERKING: Zodra cellen confluent worden en een gezonde omlooptijd hebben na een eerste passage, kunnen ze worden getest op de effectiviteit van het voltooide protocol.

4. Testen van de effectiviteit van het voltooide protocol bij het creëren van RIP1 CRISPR-mutantcellen met behulp van Western blot-analyse

  1. Genereer cellulaire eiwitlysaten van wild-type (WT) U937-monocyten, niet-gerichte controle (NTC) CRISPR-cellen en de RIP1 CRISPR-mutantcellen 11,12,13.
  2. Voer deze lysaten uit op een SDS-PAGE-gel en ga verder met de Western blot-analyse14.
    1. Normaliseer monsters eerst naar een huishoudelijk eiwit.
    2. Analyseer na normalisatie monsters op RIP1-eiwitexpressieniveaus om het succes van het maken van een RIP1 CRISPR-mutante cellijn14 adequaat te bepalen.
  3. Na de conformatie van de western blot-analyse kunnen cellen worden gebruikt voor experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de productie van een confluente populatie van RIP1 CRISPR-mutante U937-cellen, werden SDS-PAGE- en Western blot-analyse uitgevoerd. De Western blot-analyse werd gebruikt om de succesvolle creatie van een RIP1 CRISPR-mutante cellijn te bepalen door het verlies van RIP1-eiwitexpressieniveaus te beoordelen. Deze bepaling werd gedaan op basis van het vergelijkende resultaat van WT U937-monocyten en NTC-cellen. In figuur 2 werd de expressie v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol heeft tot doel gedetailleerde instructies en analyses te geven van mogelijke valkuilen in de efficiëntie en betrouwbaarheid van lentivirale transfectie en transductie om een RIP1 knock-out U937-cellijn te creëren. Hoewel deze methode van transfectie en transductie arbeids- en tijdsintensief is, wordt het over het algemeen beschouwd als een efficiënte manier om het gekozen gRNA en Cas9-endonuclease op te nemen in moeilijk te transfecteren cellijnen<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) van de National Institutes of Health (NIH), subsidienummer NIH 2R15-HL135675-02 aan T.J.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adjusted DMEM MediumGibco11995-040
AmpicillinSigmaA1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochlorideSigmaB2261
Complete RPMI-1640 MediumSigmaR6504
CRISPR NTC gRNA E.coli StraintransOMICTELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli StraintransOMICTEVH-1162203
End-over-end RotatorThermo Scientific
EVOS FL Fluorescence MicroscopeLife Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep KitSigmaPLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugateSigmaAP307P
HEK293T CellsATCC
Incubator ShakerNew Brunswick Scientific
LB AgarBD244520
LB BrothBD244610
LV-MAX Lentiviral Packaging MixGibcoA43237
MitoSOX RedMedChemExpressHY-D1055
NanoDrop SpectrophotometerThermo Scientific
Necrostatin-1MedChemExpressHY-14622A
OPTI-MEMGibco31985-062
PuromycinSigmaP7255
Rabbit anti-human RIP1 mAbCell Signaling Technology3493
SDS-PAGE and western blot equipmentBioRad
TNF-αMedChemExpressHY-P7058
U937 Human MonocytesATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay SystemTaKaRaMK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection ReagentRoche Diagnostics6365779001
z-VAD-FMKAPExBIOA1902

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gostimskaya, I. CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing. Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. What is CRISPR/Cas9. Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).
  5. Ebrahimi, S., et al. In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis. Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).
  6. Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization. Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).
  7. Lim, J. M., Kim, H. H. Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing. Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).
  8. Han, X., et al. CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation. Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).
  9. Sano, S., et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. (152), e59977(2019).
  10. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).
  11. Mccaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Dis. , 1-14 (2018).
  12. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis. Cell Death Dis. 6 (1), (2020).
  13. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis. Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).
  14. LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis. J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).
  15. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  16. Yang, Y., et al. A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage. Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).
  17. Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions. Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).
  18. Liu, X., et al. RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond. Front Immunol. 14, 1114103(2023).
  19. Kowolik, C. M., Yee, J. -K. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).
  20. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165(2021).
  21. Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. Transfecting Macrophages. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).
  22. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo. models. 159 (147), (2015).
  23. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).
  24. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).
  25. Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RIP1 KnockoutCRISPR Cas9U937 CellsGene KnockoutLentiviral PackagingGuide RNACell DeathNecroptosis InductionFluorescence MicroscopyReactive Oxygen Species

Gerelateerde artikelen