Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Visualisatie van eiwitten in levende cellen met behulp van GFP (Green Fluorescent Protein) en andere fluorescerende tags heeft het begrip van eiwitlokalisatie, dynamiek en functie sterk verbeterd. In vergelijking met immunofluorescentie geeft live beeldvorming de lokalisatie van eiwitten nauwkeuriger weer zonder mogelijke artefacten die voortvloeien uit weefselfixatie. Belangrijk is dat live beeldvorming kwantitatieve en temporele karakterisering van eiwitniveaus en lokalisatie mogelijk maakt, cruciaal voor het begrijpen van dynamische biologische processen zoals celbeweging of -deling. Een belangrijke beperking van fluorescerende tagging-benaderingen is echter de noodzaak van voldoende hoge eiwitexpressieniveaus om een succesvolle visualisatie te bereiken. Bijgevolg kunnen veel endogeen gelabelde fluorescerende eiwitten met relatief lage expressieniveaus niet worden gedetecteerd. Aan de andere kant kan ectopische expressie met behulp van virale promotors soms leiden tot verkeerde lokalisatie van eiwitten of functionele veranderingen in fysiologische contexten. Om deze beperkingen aan te pakken, wordt een benadering gepresenteerd die gebruik maakt van zeer gevoelige antilichaam-gemedieerde eiwitdetectie in levende embryo's, waarbij in wezen immunofluorescentie wordt uitgevoerd zonder de noodzaak van weefselfixatie. Als bewijs van het principe kan de endogeen GFP-gelabelde Notch-receptor die nauwelijks detecteerbaar is in levende embryo's met succes worden gevisualiseerd na injectie van antilichamen. Bovendien werd deze benadering aangepast om posttranslationele modificaties (PTM's) in levende embryo's te visualiseren, waardoor temporele veranderingen in tyrosinefosforyleringspatronen tijdens de vroege embryogenese konden worden gedetecteerd en een nieuwe subpopulatie van fosfotyrosine (p-Tyr) onder apicale membranen kon worden onthuld. Deze aanpak kan worden aangepast om andere eiwitspecifieke, tag-specifieke of PTM-specifieke antilichamen te accommoderen en moet compatibel zijn met andere injectie-ontvankelijke modelorganismen of cellijnen. Dit protocol opent nieuwe mogelijkheden voor live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of PTM's die voorheen moeilijk te detecteren waren met behulp van traditionele fluorescerende tagging-methoden.
Inleiding
Immunofluorescentie is een hoeksteentechniek van de moderne celbiologie, oorspronkelijk ontwikkeld door Albert Coons, die de detectie van moleculen in hun oorspronkelijke cellulaire compartimenten en karakterisering van de moleculaire samenstellingen van subcellulaire organellen of machinerieën mogelijk maakt. In combinatie met genetische manipulaties helpt immunofluorescentie bij het vestigen van het nu algemeen aanvaarde concept dat eiwitlokalisatie essentieel is voor zijn functie2. Afgezien van specifieke primaire antilichamen en heldere fluorescerende kleurstoffen, is het succes van deze techniek afhankelijk van een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedkeuring van de School of Life Sciences, SUSTech University. Het gebruikte organisme is Drosophila melanogaster en de genotypen zijn Notch-Knockin-GFP (chromosoom X) en Sqh-sqh-GFP (chromosoom II), genereus geleverd door de laboratoria van respectievelijk Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) en Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Hoewel dit protocol zich voornamelijk richt op aspecten van de etikettering van antilichamen en live beeldvorming, verwijzen wij u naar gepubliceerde rapporten voor meer gedetailleerde beschrijvingen van het verzamelen en injecteren van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de voordelen van de antilichaaminjectiemethode ten opzichte van op fluorescerende tags gebaseerde live beeldvorming of immunofluorescentie aan te tonen, worden twee casestudy's gegeven die de dynamische lokalisatie van een transmembraanreceptor met lage abundantie, Notch, en een type posttranslationele modificatie genaamd tyrosinefosforylering in levende embryo's karakteriseren.
Notch-signaleringsactiviteit speelt een belangrijke rol bij het bepalen van het lot van cellen tijdens embryogene.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze gepresenteerde procedure schetst de gespecialiseerde methode van fluorescentie-etikettering met aangepaste antilichamen en daaropvolgende injectie in Drosophila-embryo's in een vroeg stadium. Deze techniek vergemakkelijkt real-time visualisatie van eiwitten of posttranslationele modificaties die in kleine hoeveelheden voorkomen en doorgaans moeilijk te observeren zijn via conventionele GFP/mCherry-taggingmethoden.
Voorzichtigheid is geboden bij het uitbreiden van deze methode om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Jennifer A. Zallen bedanken voor het leveren van de Sqh-GFP Drosophila-lijn en ondersteuning voor de eerste ontwikkeling van deze techniek, en Dr. Francois Schweisguth voor het leveren van de Notch-GFP Drosophila-lijn . Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Natural Science Foundation of China (32270809) aan HHYU, genereuze financiële en personeelssteun van de School of Life Sciences, SUSTech, en financiering aan Y. Yan van de Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | De zuiveringskolom uit stap 1.6 is inbegrepen in deze kit |
| Biologische Microscoop | SOPTOP | EX20 | Oculair: PL 10X/20. Objectief: 10x/0.25 |
| Bleekmiddel | Clorox® | ||
| Borosilicaat glazen capillairen | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Celzeef | FALCON | 352350 | |
| Uitdrogingskamer | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissectiemicroscoop | Mshot | MZ62 | Oculair: WF10X/22mm. |
| Dubbelzijdig plakband | Scotch | 665 | |
| Fijne Super Pincet | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Dekglas: Rechthoeken | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscoopglazen | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Pincet | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon olie 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon olie 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptaan | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptaan lijm is gemaakt van dubbelzijdig plakband ondergedompeld in heptaan |
| Uitdrogingsreagens | TOKAI | 1-7315-01 | Vul tot 90% volume van de uitdrogingskamer |
| Manuele Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipet aantrekker | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: stap 1, Hitte: 290, Kracht:300, Afstand:1.00, Wachttijd:50. Stap 2, Hitte: 290, Kracht:300, Afstand:2.21, Wachttijd:50 |
| Pneumatische picopomp | World Precision Instruments | PV 830 | Uitstoten: 20 psi; Bereik: 100ms; Duur: getimed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Vierkante petrischalen | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Referenties
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., D....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
