Methodenartikel

Ultra High-Performance Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie en Zelf-Opgezette Database Analyse van Chinese Kruidengeneeskunde Componenten

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66091

⸱

3 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, 2General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een algemeen protocol en een systematisch ontwerp dat kan worden toegepast om complexe componenten in het duizendbladkruid, Achillea millefolium L., een Chinees kruidengeneesmiddel, te scheiden en te herkennen.

Samenvatting

Chinese kruidengeneeskunde is complex en heeft tal van onbekende verbindingen, waardoor kwalitatief onderzoek cruciaal is. Ultra-high-performance vloeistofchromatografie quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) is de meest gebruikte methode bij de kwalitatieve analyse van verbindingen. De methode omvat gestandaardiseerde en geprogrammeerde protocollen voor monstervoorbehandeling, MS-afstemming, MS-acquisitie en gegevensverwerking. De voorbehandelingen van het monster omvatten verzameling, verpulvering, oplosmiddelextractie, echografie, centrifugeren en filtratie. De nabewerking van gegevens werd in detail beschreven en omvat het importeren van gegevens, het zelf opzetten van databases, het opzetten van methoden, gegevensverwerking en andere handmatige bewerkingen. Het bovengrondse deel van het duizendbladkruid, Achillea millefolium L., wordt gebruikt om ontstekingen, gastro-intestinale stoornissen en pijn te behandelen en de 3-oxa-guaianoliden kunnen nuttige aanknopingspunten zijn voor de ontwikkeling van ontstekingsremmende geneesmiddelen. Er werden drie representatieve verbindingen in AML geïdentificeerd, waarbij TOF-MS werd gecombineerd met een zelf opgezette database. Bovendien werden de verschillen met de bestaande literatuur, optimalisatie van vloeistoffaseparameters, selectie van scanmodi, geschiktheid voor ionenbronnen, aanpassing van de botsingsenergie, isomeerscreening, methodebeperking en mogelijke oplossingen besproken. Deze gestandaardiseerde analysemethode is universeel en kan worden toegepast om complexe verbindingen in de Chinese kruidengeneeskunde te identificeren.

Inleiding

De Chinese geneeskunde heeft de rijkste empirische kennis ter wereld vergaard1. Kwalitatieve analyse van chemische componenten in de traditionele Chinese kruidengeneeskunde is een cruciaal onderwerp geworden in onderzoek2. Het onderscheiden van chemische verschillen in de Chinese kruidengeneeskunde is moeilijk vanwege de complexiteit van de categorie en de diversificatie van de oorsprong3. De belangrijkste soorten verbindingen in de Chinese kruidengeneeskunde zijn alkaloïden, saponinen, flavonoïden, anthrachinonen, terpenoïden, coumarines, lignanen, polysachariden, polypeptiden en eiwitten1. De scheiding van verbindingen en de identificatie van isomeren belemmeren echter de ontwikkeling van kwalitatief onderzoek naar Chinese kruidengeneeskunde.

De combinatie van ultra-high-performance vloeistofchromatografie (UPLC) met geschikte chromatografiekolommen biedt een sterke ondersteuning voor de scheiding van complexe verbindingen in de Chinese kruidengeneeskunde4. In de afgelopen jaren is massaspectrometrie met hoge resolutie steeds populairder geworden in de kwalitatieve analyse van de Chinese kruidengeneeskunde. Veelgebruikte massaspectrometriemethoden met hoge resolutie zijn onder meer quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (Q-TOF-MS)5, orbitrap massaspectrometrie (Orbitrap-MS)6 en Fourier-transform ionencyclotron massaspectrometrie (FT-ICR-MS)7. FT-ICR-MS heeft de hoogste resolutie, maar brengt kostbare exploitatie- en onderhoudskosten met zich mee8. Orbitrap-MS heeft voordelen bij het detecteren van kleine moleculaire verbindingen, vooral bij molecuulgewichten onder 500 Da9. Q-TOF-MS is de meest gebruikte methode in de kwalitatieve analyse van de serumfarmacochemie10,11. In vergelijking met de traditionele netwerkdatabase of commerciële database is gezamenlijke analyse met een zelf opgezette database voor gegevensverwerking steeds populairder geworden.

Alpenduizendbladkruid, Achillea millefolium L. (AML), een soort Chinees kruidengeneesmiddel, groeit voornamelijk in Xinjiang, Binnen-Mongolië en de noordoostelijke gebieden van China12. Het bovengrondse deel van AML wordt veel gebruikt voor de behandeling van ontstekingen, gastro-intestinale stoornissen en pijn, waaronder reuma, kiespijn en buikpijn13. De 3-oxa-guaianoliden van AML bieden een groot potentieel als aanknopingspunten voor de ontwikkeling van ontstekingsremmende geneesmiddelen14. Huidige studies naar chemische componenten in AML richten zich op sesquiterpenen, monoterpenen, flavonoïden en fenolische verbindingen15. Voor de identificatie van verbindingen in AML is er echter geen systematisch kwalitatief inductieschema beschikbaar dat voor andere Chinese kruidengeneesmiddelen zou kunnen worden gebruikt. Deze studie heeft tot doel een gestandaardiseerde identificatie van chemische componenten in de Chinese kruidengeneeskunde te bieden door Q-TOF-MS te combineren met zelfontwikkelde database-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monster voorbehandeling

  1. Inzameling van Chinese kruidengeneeskunde AML
    1. Plant alpenduizendblad Kruid, Achillea millefolium L. (AML) zaden in de grond in februari. Verzamel het bovengrondse deel van AML in juli van hetzelfde jaar (Figuur 1A).
      OPMERKING: AML die in dit artikel wordt gebruikt, is verzameld in een bergachtig gebied op een hoogte van 400 m in Mianyang, Sichuan, China.
  2. Drogen behandeling
    1. Was alle verzamelde AML in zuiver water om bezinksel en onzuiverheden te verwijderen. Droog de AML gedurende 24 uur in een oven bij 50 °C (Figuur 1B).
  3. Poeder bereiding
    1. Vermaal AML na droging tot een grof poeder met behulp van een multifunctionele breker met hoge snelheid. Haal het poeder door een zeef met 50 mazen (figuur 1C).
  4. Extractie van oplosmiddelen
    1. Breng 1 g nauwkeurig afgewogen AML-monster in een conische kolf met 30 ml van een 75% ethanol-wateroplossing (figuur 2A).
    2. Extraheer het mengsel in een ultrasone sonicator gedurende 30 minuten bij 25 °C (Figuur 2B).
    3. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 14.000 × g (Figuur 2C).
    4. Plaats een injectiespuit met een microporeus membraanfilter (0,22 μm, alleen biologisch) en filtreer het bovenstaande in een monsterflesje van 2 ml (Figuur 2D).

2. MS melodie

  1. Start de LC-MS-besturingssoftware (Afbeelding 3A). Open de MS tune-module en spoel de 1 ng/μL leucine-encefalin (LE)-oplossing twee keer.
  2. Stel in het LockSpray Flow Control-paneel een debiet van 50 μl/min in en klik op de Flow-knop om de LE-oplossing de massaspectrometer binnen te laten gaan (Afbeelding 3B).
  3. Klik op de knop LockSpray Source Setup om de MS-tune in de positieve modus te voltooien (Afbeelding 3C). Klik op het minpictogram om de ionenmodus te schakelen. Klik op de knop LockSpray Source Setup om de MS-tune in de negatieve modus te voltooien.

3. Overname van MS

  1. Stel een sequentietabel in, inclusief bestandsnaam, MS-methode, inlaatbestand, injectieflacon en volume. Klik op de knop Opslaan om de sequentietabel op te nemen.
  2. Klik achtereenvolgens op de knop Uitvoeren en de knop Start (Afbeelding 3D). Selecteer de optie Alleen voorbeeldgegevens verkrijgen . Klik op de knop OK om de gegevensverzameling te starten.
  3. Klik op de chromatogramknop om het venster real-time totale ionenchromatogram (TIC) te openen (Afbeelding 3E). Klik achtereenvolgens op de knop Weergave en de TIC-knop . Selecteer de optie BPI-chromatogram en klik vervolgens op de knop OK om het venster voor het basispiekchromatogram (BPI) weer te geven (Afbeelding 3F).

4. Gegevensverwerking

  1. Start de software voor gegevensanalyse.
  2. Klik op de knop Mijn werk en de knop MassLynx-gegevens importeren om achtereenvolgens het onderliggende venster te openen (Afbeelding 4A). Selecteer de onbewerkte gegevensbestanden en voer de naam van de sampleset in en klik vervolgens op de knop UNIFI-sampleset maken om de onbewerkte gegevens van MS-spectra te importeren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de positieve en negatieve onbewerkte gegevens afzonderlijk worden geïmporteerd.
  3. Opzetten van een database
    1. Klik op de knop Beheer in het beginvenster (Figuur 4B). Klik op de knop Bibliotheekitems importeren . Selecteer het databasesjabloonbestand in .xlsx-formaat met alle gescheiden samengestelde structuren in .mol-formaat in dezelfde map.
    2. Voer een naam in voor de database. Klik op de knop Verifiëren om er zeker van te zijn dat alle verbindingen worden weergegeven. Klik op de knop Importeren om het bouwen van een zelf op te zetten database te voltooien.
      OPMERKING: Alle verbindingen in onafhankelijke bestanden in .mol-formaat die in de database moeten worden geïmporteerd, worden voorbereid op basis van de literatuurverwijzingen. Samengestelde structuurbestanden worden door uzelf getekend met behulp van tekensoftware.
  4. Klik op de knop Analysemethode maken om een onderliggend venster te openen. Klik op de knop Een methode voor alleen processen genereren om een gegevensverwerkingsmethode in te stellen.
  5. Gegevensanalyse
    1. Klik op de knop Analyse maken om een onderliggend venster te openen.
    2. Klik op de knop Analyse maken van bestaande gegevens en selecteer vervolgens de geïmporteerde gegevens en de vastgestelde methode.
    3. Klik op de knop Proces om een lange gegevensberekening te starten (Figuur 4D).
    4. Klik op de knop Onderzoeken om naar het TIC-venster te gaan.
    5. Klik op de knop Sporen selecteren en selecteer de TOF MSE BPI. Klik op de knop Alles vervangen om de BPI te bekijken.
  6. Klik met de rechtermuisknop en selecteer de optie Kolom toevoegen | informatie over de verbinding weergeven, waaronder de naam van de verbinding, de natuurlijke massa, de waargenomen m/z, de massafout, de waargenomen retentietijd (RT), het aantal detectoren, de respons, adducten, alternatieve toewijzingen en het totale aantal gevonden fragmenten (Afbeelding 4E).
  7. Selecteer de optie Fragmenten met hoge energie om de secundaire massaspectrumfragmenten van de geselecteerde verbinding weer te geven (Afbeelding 4F).
  8. Teken handmatig de moleculaire splitsingspaden volgens elk secundair fragment (Figuur 4G).
    OPMERKING: Voorbeelden worden in detail beschreven in het gedeelte over representatieve resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Duizendbladkruid werd als model gebruikt om het representatieve resultaat weer te geven. Zoals te zien is in figuur 4G, veranderde quercetine-3'-O-glucoside met m/z = 463.08935 in een tussenproduct met m/z = 300.02828 via verlies van een hexosemolecuul tijdens de hydrolysereactie. In een andere route leidde de verbreking van de C-C-binding in het skelet van de flavonoïde structuur tot de vorming van een tussenproduct met m/z = 223,06232, waarbij hydroxymethy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Massaspectrometrie met hoge resolutie in combinatie met een zelf opgezette database biedt een systematische kwalitatieve technologie om chemische componenten in de Chinese kruidengeneeskunde te identificeren. In tegenstelling tot een commerciële database, die gangbare traditionele Chinese geneeskunde bevat, biedt een zelf opgezette database die gebruikmaakt van verbindingen die in de literatuur worden gerapporteerd, meer nauwkeurigheid bij de analyse van zeldzame of etnische geneeskunde<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de China Postdoctoral Science Foundation (2022MD713780), het Inheritance and Innovation Team van TCM Treatment of Immune Diseases, het Chongqing Medical Scientific Research Project (gezamenlijk project van de Chongqing Health Commission en het Science and Technology Bureau) (2022DBXM007) en de Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2018jcyjAX0370). Een speciaal project voor prestatieprikkels en begeleiding van het Chongqing Scientific Research Institute (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethylacetaatChuandongChemicalCAS 141-78-6
vloeistofchromatograafWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butylalcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleumetherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight massaspectrometrieWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData-analysesoftware

Referenties

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

UPLC Q TOF MSanalyse van kruidenverbindingenmonstervoorbehandelingdatabaseconstructieisomerenscreeningbotsingsenergieontstekingsremmende verbindingen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen