Het is aangetoond dat het associëren van leverpartitie en poortaderligatie voor gefaseerde hepatectomie (ALPPS) resulteert in opmerkelijke leverregeneratie na enkele weken na de operatie in de eerste fase. Diermodellen die ALPPS hebben ondergaan, zijn ontwikkeld om het potentiële leverregeneratievermogen te onderzoeken en gunstige klinische resultaten te bereiken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muismodel van de associërende leverpartitie en poortaderligatie voor gefaseerde hepatectomieprocedure met behulp van microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hepatectomie wordt algemeen beschouwd als de primaire behandeling voor hepatische maligniteiten; Toch blijft postoperatief leverfalen een belangrijke oorzaak van perioperatieve mortaliteit, wat ernstige gevolgen heeft voor de resultaten voor de patiënt. In een robuuste leveromgeving moet het toekomstige leverrestant (FLR) meer dan 25% bedragen, en in geval van cirrose neemt deze behoefte toe tot meer dan 40%. De ontoereikendheid van FLR is momenteel een groot obstakel in de progressie van leverchirurgie.
Traditionele methoden om FLR-hypertrofie te verbeteren richten zich voornamelijk op embolisatie van de poortader (PVE), maar de effectiviteit ervan is aanzienlijk beperkt. In de afgelopen jaren zijn er talloze meldingen geweest van een nieuwe bifasische hepatectomiemethode met leverpartitionering en poortaderligatie, bekend als het associëren van leverpartitie en poortaderligatie voor gefaseerde hepatectomie (ALPPS). ALPPS overtreft PVE in het efficiënt en aanzienlijk induceren van FLR-hypertrofie. De gedetailleerde mechanismen die ALPPS-gefaciliteerde leverregeneratie aansturen, worden echter niet volledig begrepen. Het repliceren van ALPPS in diermodellen is dus cruciaal om de moleculaire mechanismen van leverregeneratie grondig te onderzoeken, wat waardevolle theoretische en praktische inzichten biedt.
Inleiding
De lever herbergt een formidabel regeneratief potentieel, waardoor de metabolische vraag snel toeneemt en wordt hersteld binnen slechts 3 maanden na resectie voor diverse leveraandoeningen. De noodzaak om de volledigheid van de tumormarges vast te stellen, vereist echter de onvermijdelijkheid van uitgebreide leverexcisie. Het waarborgen van een ruim volume van het participatieve levermilieu, bekend als het toekomstige leverrestant (FLR), is dus van het grootste belang2. ALPPS is de afgelopen decennia een baanbrekende techniek geweest in de leverchirurgie, met name op maat gemaakt voor patiënten met onvoldoende resterend levervolume na tumorresectie, aangekondigd als een van de meest veelbelovende doorbraken op het gebied van hepatische oncologische chirurgie3.
Er is opmerkelijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van ALPPS-diermodellen. Een ideaal model vereist doorgaans onafhankelijke bloedinstroom (poortader en leverslagader) en uitstroom (leverader) in de geconserveerde leverkwab en een duidelijke scheiding tussen de geconserveerde en de te verwijderen leverkwabben om collaterale circulatie te voorkomen4. Hoewel ALPPS een snelle leverregeneratie in het resterende leverweefsel stimuleert, zijn de specifieke mechanismen van dit proces nog onduidelijk.
Momenteel worden ALPPS-modellen onderverdeeld in drie typen: grote diermodellen (bijv. varkens en schapen), middelgrote modellen (bijv. konijnen en knaagdieren) en kleine modellen (bijv. muizen)5. Het gebruik van muizen, met hun snelle voortplanting en gemakkelijke genetische modificatie, is bijzonder effectief voor diepgaande studies van leverregeneratiemechanismen6. Bovendien lijkt de leverstructuur van muizen, met name hun middelste leverader, sterk op die van mensen, waardoor ze zeer geschikt zijn voor de ontwikkeling van ALPPS-modellen.
Het is belangrijk op te merken dat de meeste patiënten met hepatocellulair carcinoom in de klinische praktijk onderliggende leveraandoeningen hebben, in tegenstelling tot de gezonde levermodellen die doorgaans in onderzoeken worden gebruikt. Het gebruik van muizen die geconditioneerd zijn met leverfibrose of virale infecties kan dus de chirurgische reacties en postoperatieve leverregeneratie nauwkeuriger simuleren die worden gezien bij patiënten met verschillende leverziekten. Deze benadering zou nieuwe therapeutische doelen van klinisch belang kunnen onthullen.
Tot nu toe hebben enkele gerenommeerde onderzoeksgroepen, zoals die van de Universiteit van Zürich en de Universiteit van Tokio, met succes ALPPS-modellen voor muizen 9,10 ontwikkeld. Het creëren van een gestandaardiseerd muizenmodel onder gecontroleerde omstandigheden zou ons begrip van de snelle leverregeneratie die wordt waargenomen na ALPPS-procedures kunnen vergroten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten in dit protocol zijn goedgekeurd door de veterinaire autoriteiten van het Jiangxi Provincial People's Hospital (nummer 70/2022). Bovendien werden alle experimentele stappen uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Start van de operatie
OPMERKING: Mannelijke C57BL/6-muizen met een gewicht van 20-22 g werden gehuisvest in een goed geventileerde kooi, gehouden in een standaard pathogeenvrije omgeving met een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur. De dieren kregen ad libitum toegang tot voedsel en water bij een gecontroleerde omgevingstemperatuur van 22 ± 1 °C. De operatie werd uitgevoerd in een speciale microchirurgische kamer met behulp van een chirurgische microscoop (Figuur 1). De muizen in de schijngroep werden alleen geopereerd door middel van laparotomie, maar er werd geen operatie aan de lever uitgevoerd. In de PVL-groep werd een deel van de poortadertakken geligeerd en in de ALPPS-groep werd de middelste leverkwab doorgesneden op basis van poortaderligatie (PVL).
- Onderwerp de muizen aan een preoperatieve vastenperiode van 4-6 uur.
OPMERKING: Vasten is vereist omdat eten bij muizen maaguitstulping veroorzaakt, het resulteert in een slecht operatieveld en vatbaar is voor onopzettelijke schade aan de maagwand. - Plaats steriele chirurgische instrumenten, waaronder een micropincet, een schaar, abdominale retractors en vooraf voorbereide 8-0 poortader ligatuur hechtingen, op een bijzettafeltje. Week intraoperatief materiaal, bestaande uit steriel gaas en wattenbolletjes, in een zoutoplossing van 37 °C.
- Stel de dieren voor inductie gedurende 30 s bloot aan 5% v/v isofluraan, gevolgd door onderhoudsanesthesie met 3 vol% isofluraan totdat een diepe anesthesietoestand is bereikt. Onderzoek de teenknijpreflex om het niveau van anesthesie vast te stellen. Subcutaan medetomidine injecteren in een dosis van 5 mg/kg tijdens de inductiefase.
- Breng zalf aan op de ogen van de dieren en injecteer subcutaan 1 ml Ringer-lactaatoplossing gemengd met 5% glucose, waarbij de dosis aan elke kant gelijkmatig over de onderbuik wordt verdeeld.
- Scheer de buikstreek zorgvuldig met een tondeuse van klein dierenhaar, die een lateraal gebied van 2 cm omvat van het xiphoid-proces tot het genitale gebied.
- Desinfecteer de operatieplaats 3 keer grondig met afwisselende rondes povidon-jodium en alcohol.
- Maak een incisie in de middellijn van 2,5-3,0 cm op de huid met behulp van een chirurgisch scalpel en gebruik vervolgens een chirurgische schaar om de buikholte voorzichtig te openen.
- Gebruik de abdominale retractor om de incisie uit te zetten en de zachte tractie van de twaalfvingerige darm en een deel van de dunne darm te vergemakkelijken met behulp van steriele, vochtige wattenstaafjes. Bedek deze structuren met het vooraf voorbereide steriele gaas en leg tegelijkertijd het leversegment van de poortader bloot.
2. Ligatie van de poortader (PVL)
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle handelingen gedurende de hele procedure zacht zijn. Gebruik bevochtigde wattenbolletjes bij het manipuleren van leverweefsel.
- Verwijder het buikvlies en het darmkanaal en zorg ervoor dat de poortader volledig bloot ligt.
- Tijdens het blootleggen van de hoofdpoortader, gaat u verder met het omcirkelen van de takken met behulp van langzame, opzettelijke voorwaarts duwende en spreidende bewegingen.
- Identificeer achtereenvolgens de verschillende vertakkingen van de poortader in de volgende volgorde: (1) de rechter achterste tak, (2) de gecombineerde linker laterale en linker mediane takken, en (3) de caudate tak (Figuur 2A).
3. Dissectie van de rechter achterste tak van poortadervertakkingen
- Bij het doorkruisen van het leverhilum via de hoofdpoortader, observeert u een opvallende tak van de rechter achterkwab die zichtbaar is geworden.
- Gebruik bevochtigde wattenbolletjes als vulmiddel en scheid de middelste kwab van de lever en de rechter achterkwab om mogelijk letsel te voorkomen.
- Zorg ervoor dat u langs het kapsel van Glisson (het buikvlies dat zich uitstrekt over het oppervlak van de lever) ontleedt en trek een zijde van 1,5 cm om rond de takken van de poortader te binden.
- Maak de rechter achterste tak van de poortader los met 8-0 zijden hechtdraad. Een betrouwbare indicator voor een succesvolle ligatie van de poortader is zichtbare bleekheid van de lever.
4. Dissectie van de linker laterale en linker mediale takken van de poortader
- De linker zijkwab (LLL) en linker mediale kwab (LML) takken delen een gemeenschappelijke hoofdpoortader. Zorg ervoor dat u elke mogelijke tussenruimte tussen de LLL en de caudate kwab ontleedt.
OPMERKING: Ligatie van de LLL- en LML-takken van de poortader is het moeilijkst in dit chirurgische model, omdat de micropincet de ruimte rond de poortader moet doorkruisen en leverbeschadiging moet voorkomen. - Steek de micropincet in stap 4.1 door de ingang en beweeg de hand langzaam, want zelfs de kleinste weerstand wijst op de mogelijke nabijheid van de lever of bloedvaten.
- Wanneer weerstand wordt gevoeld, past u de micropincet iets aan om naar voren en door het oppervlak van Glisson's capsule van de rechter mediale kwab (RML) te bewegen (Figuur 3C).
- Maak gebruik van de voorbereide 8-0 zijden hechtdraad om rond de poortader van de LLL en LML-takken te binden. Zoek naar een opvallende ischemische afbakening in de middenkwab van de lever, terwijl de linkerkwab bleekheid aanneemt bij ligatie van de poortadertakken.
5. Dissectie van de caudate tak van de poortadertakken
- Ontleed de caudatuskwab en gebruik een wattenstaafje om de potentiële ruimte tussen de hoofdpoortader en de caudatuskwab op te vullen.
- Verwijder het buikvlies van de caudatuslobben om de poortadertakken van de lob te visualiseren.
- Gebruik een hechtdraad in plaats van een band om de caudate tak vast te binden, en zorg ervoor dat het naaldpad de caudate tak van de poortader adequaat omwikkelt.
OPMERKING: De moeilijkheid om de caudatustak van de poortader af te binden is omdat de caudate kwab poortader het leverweefsel inkapselt en zich dicht bij de hoofdpoortader bevindt. Een naaldpenetratiediepte van 1 mm wordt aanbevolen.
6. Levertranssectie en cholecystectomie
- Observeer een duidelijke demarcatielijn in de middelste leverkwab en voer de doorsnede langs deze lijn uit (Figuur 2B).
- Gebruik een elektrocauterisatiepen om een voorgesneden lijn van 0,5 mm langs de demarcatielijn te maken.
- Gebruik een microtang en een elektrocauterisatiepen om leverweefsel te snijden en breng wattenstaafjes aan om het bloeden te stoppen.
OPMERKING: De moeilijkheid bij de doorsnede is om de diepte onder de knie te krijgen. Het doel is om de lever zo dicht mogelijk bij de vena cava te splitsen. Intraoperatieve bloedingen zijn moeilijk te vermijden en vereisen herhaalde oefening om de diepte van de doorsnede onder de knie te krijgen. Hete verbranding, wattenstaafjes en gelatinesponzen kunnen worden gebruikt om te helpen bij hemostase. - Verwijder de galblaas als laatste, omdat dit zorgt voor een goed trekpunt tijdens de hele operatie.
- Gebruik een wattenstaafje om gecontroleerde druk uit te oefenen voor hemostase, en als de bloeding aanhoudt, is de inferieure vena cava gewond en zal het effect van hechtingsherstel slecht zijn; Euthanaseer het dier zonder aarzeling.
7. Laatste stappen van de operatie
- Zorg voor een zorgvuldige plaatsing van de dunne darm in de buikholte voordat u deze sluit.
- Sluit het buikvlies en de buikwand stevig af met 6-0 resorbeerbare hechtingen en de huid met 4-0 resorbeerbare hechtingen.
- Desinfecteer het huidoppervlak opnieuw om een optimale reinheid te garanderen.
- Subcutaan 1 ml zoutoplossing en fentanyl 0,02 mg/kg plus meloxicam 4 mg/kg toedienen op de incisieplaats om postoperatieve pijn te verlichten en eventueel aanvullend intraoperatief vochtverlies aan te pakken.
- Plaats het dier op een verwarmd oppervlak om natuurlijk ontwaken te vergemakkelijken en controleer de bloedtoevoer naar hun ledematen. Huisvest ze vervolgens individueel in kooien voor verdere observatie terwijl ze weer bij bewustzijn komen.
- Subcutaan medetomidine injecteren in een dosis van 4 mg/kg bij herstel, en doorgaan gedurende 24 uur postoperatief.
8. Intraoperatieve meting van leverregeneratie en leverfunctie
- Euthanaseer de muizen en verzamel lever- en bloedmonsters met tussenpozen van 1, 2, 3 en 7 dagen na de operatie.
- Voer een HE-kleurings- en leverfunctietest uit en onderzoek serumontstekingsmarkers, waardoor extra validatie wordt geboden voor de impact van de modelconstructie.
- Documenteer de dagelijkse variaties in het lichaamsgewicht en de FLR/BW-verhouding (lichaamsgewicht) van de muizen gedurende een periode van 1 week na de chirurgische ingreep.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In tegenstelling tot de PVL (protocolstappen 2,3,4 en 5), vertoonden de muizen die werden onderworpen aan de chirurgische ingreep ALPPS (stappen 2,3,4,5 en 6) een verhoogde neiging tot cellulaire proliferatie. Figuur 2 schetst de ischemische afbakening van de middelste leverkwab na het afbinden van de poortader, samen met het gezichtsveld tijdens levertranssectie, dat een belangrijk onderscheid vormt tussen ALPPS en PVL. Met name de niveaus van ontstekingsme...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie presenteert een protocol voor de beginfase van ALPPS-chirurgie bij muizen, waarbij gedeeltelijke ligatie van de poortader en deling van de mediane leverkwab wordt betrokken. Deze methode lijkt sterk op de menselijke ALPPS-procedure, waarbij de unieke lobulaire structuur van de muizenlever en de dubbele portale veneuze toevoer naar de mediaankwab zorgen voor een duidelijke bloedstroom nade operatie. Het is opmerkelijk dat de ALPPS-procedure uit twee ver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5% glucose injectie (500 mL) | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20003666 | Efficiënt, goedkoop, gemakkelijk toegankelijk |
| anesthesiemachine | RWD (www.rwdls.com) | R500 | lage prijs en waardevolle kwaliteit. Het is geschikt voor operaties met beginners |
| C57 BL/6 | The Jackson Lab | 22349-2023 | Stabiliteit van stammen |
| isofluraan | KCSW (kcsw.szqisoubao.com) | H19980141 | duurzaam, kosteneffectief |
| meloxicam | Boehringer-Ingelheim | H20020217 | Duurzaam en efficiënt |
| microforceps | maydeal | 60018920 | Duurzaam en efficiënt |
| micro-instrument | CH microsurgical instrument factory | HC-A804-1 | duurzaam, kosteneffectief |
| sodium lactate ringer | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20193277 | Efficiënt, goedkoop, gemakkelijk toegankelijk |
| naadlijn | CH microsurgical instrument factory | 6-0/8-0 | hoge prestatie-prijsverhouding |
| topische antilichamen | chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com) | H20020217 | Incisie-infectie effectief voorkomen |
Referenties
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: Biological and pathological mechanisms and implications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (1), 40-55 (2021).
- Chapelle, T., et al. Estimation of the future remnant liver function is a better tool to pr edict post-hepatectomy liver failure than platelet-based liver scores. Eur J Surg Oncol. 43 (12), 2277-2284 (2017).
- Isfordink, C. J., et al. Portal vein ligation versus portal vein embolization for induction of hypertrophy of the future liver remnant: A systematic review and meta-analysis. Surg Oncol. 26 (3), 257-267 (2017).
- Linecker, M., et al. Risk adjustment in alpps is associated with a dramatic decrease in ear ly mortality and morbidity. Ann Surg. 266 (5), 779-786 (2017).
- Darnis, B., et al. Subtotal hepatectomy in swine for studying small-for-size syndrome and portal inflow modulation: Is it reliable. HPB (Oxford). 17 (10), 881-888 (2015).
- Casellas, J. Inbred mouse strains and genetic stability: A review. Animal. 5 (1), 1-7 (2011).
- Zhang, J., et al. Evolution of associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy from 2012 to 2021: A bibliometric analysis. Review. Int J Surg. 103, 106648(2022).
- Parola, M., Pinzani, M. Liver fibrosis: Pathophysiology, pathogenetic targets and clinical iss ues. Mol Aspects Med. 65, 37-55 (2019).
- Kikuchi, Y., et al. Impact of associating liver partition and portal vein occlusion for st aged hepatectomy on tumor growth in a mouse model of liver metastasis. Eur J Surg Oncol. 44 (1), 130-138 (2018).
- Schlegel, A., et al. Alpps: From human to mice highlighting accelerated and novel mechanism s of liver regeneration. Ann Surg. 260 (5), 839-846 (2014).
- Dili, A., Lebrun, V., Bertrand, C., Leclercq, I. A. Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepate ctomy: Establishment of an animal model with insufficient liver remnan t. Lab Invest. 99 (5), 698-707 (2019).
- Schadde, E., Hertl, M., Breitenstein, S., Beck-Schimmer, B., Schläpfer, M. Rat model of the associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (alpps) procedure. J Vis Exp. (126), e55895(2017).
- Allaire, M., et al. New frontiers in liver resection for hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2 (4), 100134(2020).
- Memi, F., Ntokou, A., Papangeli, I. Crispr/cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations. Semin Perinatol. 42 (8), 487-500 (2018).
- Saviano, A., Henderson, N. C., Baumert, T. F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology. J Hepatol. 73 (5), 1219-1230 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
