Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën die worden aangetroffen in de epidermis van het plantenblad. Regulering van de huidmondjesopening is niet alleen van cruciaal belang voor het balanceren van de opname van kooldioxide voor fotosynthese en transpiratief waterverlies, maar ook voor het beperken van bacteriële invasie. Terwijl planten huidmondjes sluiten bij herkenning van microben, pathogene bacteriën, zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO), heropen de gesloten huidmondjes om toegang te krijgen tot het binnenste van de vleugel. In conventionele tests voor het beoordelen van stomatale reacties op bacteriële invasie, worden epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie gezweefd en vervolgens worden huidmondjes onder een microscoop geobserveerd, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie in een blad dat aan de plant vastzit. Onlangs is een draagbaar beeldvormingsapparaat ontwikkeld dat huidmondjes kan observeren door in een blad te knijpen zonder het los te maken van de plant, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die is ontworpen om automatisch de huidmondopening te meten op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd. Voortbouwend op deze technische vooruitgang wordt hier een nieuwe methode geïntroduceerd om de stomatale respons op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana te beoordelen. Deze methode bestaat uit drie eenvoudige stappen: sprayinoculatie van Pto die natuurlijke infectieprocessen nabootst, directe observatie van huidmondjes op een blad van de Pto-geïnoculeerde plant met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat en geautomatiseerde meting van de huidmondjesopening door de beeldanalysepijplijn. Deze methode werd met succes gebruikt om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie aan te tonen onder omstandigheden die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootsen.
Inleiding
Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën omgeven door een paar wachtcellen op het oppervlak van bladeren en andere bovengrondse delen van planten. In steeds veranderende omgevingen is de regulering van de huidmondjesopening van cruciaal belang voor planten om de opname van kooldioxide te regelen die nodig is voor fotosynthese ten koste van waterverlies via transpiratie. De kwantificering van de huidmondjesopening is dus van groot belang geweest voor het begrijpen van de aanpassing van het milieu aan planten. Het kwantificeren van de huidmondjesopening is echter inherent tijdrovend en omslachtig, omdat het menselijke arbeid vereist om stomatale poriën te herkennen en te meten in een bladbeeld dat door een microscoop is vastgelegd. Om deze beperkingen te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de kwantificering van de stomatale opening in Arabidopsis thaliana te vergemakkelijken, een modelplant die op grote schaal wordt gebruikt om de stomatale biologie 1,2,3,4,5,6 te bestuderen. Een porometer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de transpiratiesnelheid te meten als maatstaf voor stomatale geleiding. Deze methode geeft echter geen directe informatie over het huidmondgetal en de opening die de huidmondgeleiding bepalen. Sommige onderzoeken hebben confocale microscopietechnieken gebruikt die de stomatale poriën benadrukken met behulp van een fluorescerende actinemarker, een fluorescerende kleurstof of celwandautofluorescentie 1,2,3,4,5. Hoewel deze benaderingen de detectie van huidmondjes vergemakkelijken, kunnen de kosten van zowel het exploiteren van een confocale microscopiefaciliteit als het voorbereiden van microscopiemonsters een obstakel vormen voor routinematige toepassing. In een baanbrekend werk van Sai et al. werd een diep neuraal netwerkmodel ontwikkeld om automatisch de stomatale opening te meten op basis van helderveldmicroscopische beelden van A. thaliana epidermale peelings6. Toch ontslaat deze innovatie onderzoekers niet van de taak om een epidermale peeling voor te bereiden op microscopische observatie. Onlangs werd dit obstakel overwonnen door een draagbaar beeldvormingsapparaat te ontwikkelen dat huidmondjes kan observeren door in een blad van A. thaliana te knijpen, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die automatisch de huidmondopening meet op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd7.
Huidmondjes dragen bij aan de aangeboren immuniteit van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers. De sleutel tot deze immuunrespons is stomatale sluiting die het binnendringen van bacteriën door de microscopisch kleine porie in het binnenste van het blad beperkt, waar bacteriële ziekteverwekkers zich vermenigvuldigen en ziekten veroorzaken. Stomatale sluiting wordt geïnduceerd na herkenning van microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMP's), immunogene moleculen die vaak gemeenschappelijk zijn voor een klasse van microben, door plasmamembraan-gelokaliseerde patroonherkenningsreceptoren (PRR's)9. Een epitoop van 22 aminozuren van bacterieel flagelline, bekend als flg22, is een typische MAMP die stomatale sluiting induceert door de herkenning ervan door de PRR FLS210. Als tegenmaatregel kunnen bacteriële ziekteverwekkers zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO) en Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria hebben virulentiemechanismen ontwikkeld om huidmondjes te heropenen 9,11,12. Deze huidmondjes op bacteriële pathogenen zijn conventioneel geanalyseerd in tests waarbij epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie worden gezweefd en vervolgens huidmondjes worden waargenomen onder een microscoop, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie die optreden in een blad dat aan de plant is bevestigd.
Hier wordt een eenvoudige methode gepresenteerd om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie te onderzoeken onder de voorwaarde die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootst. Deze methode maakt gebruik van het draagbare beeldvormingsapparaat voor directe observatie van A. thaliana huidmondjes op een blad dat is bevestigd aan de plant die is geïnoculeerd met Pto, samen met de beeldanalysepijplijn voor geautomatiseerde meting van de huidmondaopening.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Planten kweken
- Om de kiemrust te doorbreken, resuspendeert u de zaden van A. thaliana (Col-0) in gedeïoniseerd water en broedt u ze gedurende 4 dagen in het donker uit bij 4 °C.
- Zaai de zaden op de grond en kweek in een kamer die is uitgerust met wit fluorescerend licht. Houd de volgende groeiomstandigheden aan: temperatuur van 22 °C, lichtintensiteit van 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) gedurende 10 uur en relatieve vochtigheid van 60%.
- Geef de planten indien nodig water met een vloeibare meststof. Geef geen water van 1 week tot 2 dagen voorafgaand aan de inoculatie en geef 1 dag voor de inoculatie goed water.
2. Bereiding van bacterieel entmateriaal
- Streep Pto uit de glycerolvoorraad op gestold King's B (KB) medium (20 g trypton, 1,5 g K2HPO4 en 15 g glycerol voor 1 l, 1,5% agar) met 50 μg/ml rifampicine en incubeer gedurende 2 dagen bij 28 °C.
- Inoculeer een enkele kolonie met 5 ml KB vloeibaar medium met 50 μg/ml rifampicine en incubeer bij 28 °C met schudden bij 200 tpm tot de late logaritmische groeifase.
- Centrifugeer de cultuur gedurende 2 minuten op 6.000 x g , gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel water. Herhaal deze stap nog een keer.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml huidmondjesopeningsbuffer (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) en meet de OD600.
- Verdun de suspensie tot OD600 0,2 met een huidmondjesopening die 0,04% siliconen oppervlakteactieve stof bevat.
3. Spray-inoculatie van bacteriën
- Stel planten vanaf 1 dag voor inoculatie tot het einde van het experiment bloot aan een lichtintensiteit van ongeveer 10.000 lux (ca. 170 μmol/m2/s).
- Om ervoor te zorgen dat de meeste huidmondjes open zijn, bewaart u de planten op een bak bedekt met een transparant deksel onder het licht gedurende ten minste 3 uur voordat u ze spuit.
- Verwijder het deksel en gebruik een airbrush om de abaxiale zijde van bladeren te besproeien met 2,5 ml bacteriële suspensie per drie planten op een enkele pot.
- Incubeer de geënte planten op een tray bedekt met een transparant deksel om een relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 85% te behouden.
- Maak beelden van huidmondjes 1 uur en 3 uur na het inoculeren met de spray volgens de methode beschreven in rubriek 4.
4. Directe observatie van huidmondjes met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat
NOTITIE: Het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat is uitgerust met een LED-lampje en een cameramodule en kan 2.592 × 1.944 (hoogte × breedte; pixels) beelden maken met een resolutie van ongeveer 0,5 μm/pixel.
- Sluit het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat aan op een pc (pc) die is uitgerust met beeldacquisitiesoftware.
- Verwijder voorzichtig maar volledig waterdruppels van de geënte bladeren met een stuk papier.
- Open de bovenklep van het apparaat, plaats de vleugel op de tafel en sluit de bovenklep (Figuur 1).
- Pas de focus van de afbeelding aan door de stelschroef te manipuleren en klik vervolgens op de Afbeelding opslaan knop op het pc-scherm. Het beeld wordt onmiddellijk verkregen. Doorgaans bevat een scherp beeld ongeveer 10 analyseerbare huidmondjes. Om robuuste resultaten te verkrijgen, maakt u huidmondjes van zes bladeren van drie verschillende planten (twee bladeren per plant).
5. Handmatige meting van de stomatale opening
OPMERKING: De ImageJ-software kan worden gedownload op https://imagej.nih.gov/ij/download.html
- Open een afbeeldingsbestand in de ImageJ.
- Open de ROI-manager door Analyze > Tools > ROI Manager te selecteren.
- Gebruik het selectiegereedschap Rechte lijn om een lijn te tekenen die overeenkomt met de breedte van een stoma (Figuur 2) en registreer de ROI door op Toevoegen te klikken in de ROI Manager.
- Trek een lijn die overeenkomt met de lengte van dezelfde stoma (figuur 2A) en registreer de ROI zoals beschreven in stap 5.3.
- Klik op Meten in de ROI Manager om de breedte en lengte te meten.
- Deel de breedte door de lengte om de huidmondjesopening (verhouding) te verkrijgen. Gebruik voor een robuuste kwantificering 60 of meer huidmondjes voor elke behandeling en elk tijdstip. Kies geen premature of onduidelijke huidmondjes voor de analyse (Figuur 2B, C).
6. Geautomatiseerde meting van de stomatale opening
OPMERKING: De pijplijn voor beeldanalyse wordt uitgevoerd in Google Colaboratory, een uitvoerbare omgeving in de cloud-programmeertaal Python. Gebruikers moeten een geldig Google-account hebben met een werkende Google Drive, Google Chrome-browser en een stabiele internetverbinding als vereiste.
- Download het Google Colaboratory-notitieblok van Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) en open het notitieblok.
- Maak een lokale kopie van het notitieblok naar Google Drive door Bestand te selecteren > Een kopie opslaan in Drive te selecteren. Nadat er een nieuw tabblad is verschenen, sluit u het tabblad van het oorspronkelijke notitieboek veilig.
- Druk eenmaal op de knop Uitvoeren onder de sectie Omgevingsinstellingen in het notitieblok zonder de celblokken uit te vouwen om de vereiste bibliotheken te importeren.
- Voer het gedeelte Directory-instellingen uit om drie mappen te maken die worden gebruikt voor analyse (bijvoorbeeld example_result, inference_results en model) in Google Drive.
OPMERKING: In dit geval worden de mappen met de naam example_result, inference_results en model gebruikt als de bovenliggende map, waarin respectievelijk deductieresultaten en getrainde modellen worden opgeslagen. Dit notitieblok toont een voorbeeld van het maken van mappen als een representatieve procedure. Als u de naam wilt wijzigen, herschrijft u het pad pardir, infdir of modeldir . - Verplaats volgens de sectie Voorbereiding van de afbeeldingen de verkregen afbeeldingen naar example_result, gegroepeerd in afbeeldingstitels per behandeling of steekproef (bijv. mock_1h_XXXXXX.jpg) voor het genereren van de uiteindelijke grafiek. Voorbeeldfoto's zijn verkrijgbaar bij Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
- Voer het gedeelte Getrainde modellen downloaden uit om de ONNX-bestanden van de getrainde modellen van Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) te downloaden en onder de modelmap te plaatsen.
- Voer het gedeelte Inferentie en meting van stomatale opening uit om de stomatale opening te kwantificeren op basis van afzonderlijke afbeeldingen. De resulterende afbeeldingen met overlappende deductie en het csv-bestand met de naam example_result.csv worden geëxporteerd naar de map inference_results.
- Voer de sectie Grafiekgeneratie uit om een grafiek te maken over de stomatale diafragmaverhouding, geëxporteerd naar de map inference_results .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na spray-inoculatie van Pto werden huidmondjes op bladeren die aan de geïnoculeerde planten waren bevestigd, direct waargenomen door het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat. Met behulp van handmatige en geautomatiseerde metingen werden dezelfde bladafbeeldingen gebruikt om de huidmondjesopening te berekenen door verhoudingen van breedte tot lengte van ongeveer 60 huidmondjes te nemen. Handmatige en geautomatiseerde metingen duidden consequent op een afname van de huidmondjesopening in Pto-geïnoculeerde pla...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerdere studies gebruikten epidermale schillen, bladschijven of losse bladeren om stomatale reacties op bacteriële invasies te onderzoeken 9,11,12. De methode die in deze studie wordt voorgesteld, maakt daarentegen gebruik van het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat om huidmondjes direct te observeren op een blad dat aan de plant is bevestigd na spray-inoculatie van Pto, waardoor natuurlijke omstandigheden van bac...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We danken alle leden van het onderzoeksproject, 'Co-creatie van plant adaptieve eigenschappen via assemblage van plant-microbe holobiont', voor vruchtbare discussies. Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 en 21H05149 aan AM en 21H05152 aan Y.T.) en Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 aan A. M.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessoire kits voor SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plantengroeikamerbehuizing met witte fluorescentielamp |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | Een set van bak en deksel |
| Hyponex | Hyponex | Geen catalogusnummer beschikbaar | Verdun de oplossing van Hyponex in een verhouding van 1:2000 in gedeïoniseerd water voor het bewateren van planten |
| Image J | Natinal Institute of Health | Downloaden op https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Gebaat voor handmatige meting van stomata opening |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | Voor MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | Voor MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Bestel op https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Oplossen in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | Silicone oppervlakteactieve stof gebruikt bij spuit inoculatie |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush gebruikt voor spuit inoculatie |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mengen met Vermiculite G20 in gelijke verhoudingen voor het bereiden van aarde |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | Geen catalogusnummer beschikbaar | Mengen met Super Mix A in gelijke verhoudingen voor het bereiden van aarde |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Gebaat voor Biotron |
Referenties
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576(2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
