Methodenartikel

Meting van Poly A-staartlengte van Drosophila-larvehersenen en cellijn

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66116

⸱

12 januari 2024

 , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft een efficiënte en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de poly(A)-lengte van het gen van belang uit het Drosophila-zenuwstelsel , die gemakkelijk kan worden aangepast aan weefsels of celtypen van andere soorten.

Samenvatting

Polyadenylering is een cruciale posttranscriptionele modificatie die poly(A)-staarten toevoegt aan het 3'-uiteinde van mRNA-moleculen. De lengte van de poly(A)-staart wordt strak gereguleerd door cellulaire processen. Ontregeling van mRNA-polyadenylering is in verband gebracht met abnormale genexpressie en verschillende ziekten, waaronder kanker, neurologische aandoeningen en ontwikkelingsafwijkingen. Daarom is het begrijpen van de dynamiek van polyadenylatie van vitaal belang voor het ontrafelen van de complexiteit van mRNA-verwerking en posttranscriptionele genregulatie.

Dit artikel presenteert een methode voor het meten van poly(A)-staartlengtes in RNA-monsters geïsoleerd uit Drosophila-larvale hersenen en Drosophila Schneider S2-cellen. We gebruikten de guanosine/inosine (G/I) tailing-benadering, waarbij G/I-residuen enzymatisch worden toegevoegd aan het 3'-uiteinde van mRNA met behulp van gistpoly(A)-polymerase. Deze modificatie beschermt het 3'-uiteinde van het RNA tegen enzymatische afbraak. De beschermde poly(A)-staarten over de volledige lengte worden vervolgens omgekeerd getranscribeerd met behulp van een universele antisense-primer. Vervolgens wordt PCR-amplificatie uitgevoerd met behulp van een genspecifieke oligo die zich richt op het gen van belang, samen met een universele sequentie-oligo die wordt gebruikt voor reverse transcriptie.

Dit genereert PCR-producten die de poly(A)-staarten van het gen in kwestie omvatten. Aangezien polyadenylering geen uniforme modificatie is en resulteert in staarten van verschillende lengtes, vertonen de PCR-producten een reeks maten, wat leidt tot een uitstrijkpatroon op agarosegel. Ten slotte worden de PCR-producten onderworpen aan capillaire gelelektroforese met hoge resolutie, gevolgd door kwantificering met behulp van de afmetingen van de poly(A) PCR-producten en het genspecifieke PCR-product. Deze techniek biedt een eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel voor het analyseren van poly(A)-staartlengtes, waardoor we diepere inzichten kunnen krijgen in de ingewikkelde mechanismen die de mRNA-regulatie regelen.

Inleiding

De meeste eukaryote mRNA's worden posttranscriptioneel gepolyadenyleerd aan hun 3′ eindpunt in de kern door toevoeging van niet-getemplatede adenosines door canonieke poly(A)-polymerasen. Een intacte poly(A)-staart is cruciaal gedurende de hele levenscyclus van mRNA, omdat het essentieel is voor de nucleaire export van mRNA1, de interactie met poly(A)-bindende eiwitten vergemakkelijkt om de translationele efficiëntie te verbeteren2 en weerstand biedt tegen afbraak3. In bepaalde gevallen kan de poly(A)-staart ook extensie ondergaan in het cytoplasma, gefaciliteerd door niet-canonieke poly(A)-polymerasen4. In het cytoplasma verandert de lengte van de poly (A) staart dynamisch en beïnvloedt de levensduur van het mRNA-molecuul. Van talrijke polymerasen en deadenylasen is bekend dat ze de staartlengte 5,6,7 moduleren. De verkorting van poly(A)-staarten correleert bijvoorbeeld met translatie-repressie, terwijl de verlenging van poly(A)-staarten de translatie verbetert 8,9.

Accumulerende genomische studies hebben de fundamentele betekenis van de poly(A)-staartlengte aangetoond in verschillende facetten van de eukaryote biologie. Dit omvat rollen in de ontwikkeling van kiemcellen, vroege embryonale ontwikkeling, neuronale synaptische plasticiteit voor leren en geheugen, en de ontstekingsreactie10. Er zijn tal van methoden en assays ontwikkeld voor het meten van poly(A)-staartlengtes. De RNase H/oligo(dT)-assay maakt bijvoorbeeld gebruik van RNase H in de aan- of afwezigheid van oligo(dT) om poly(A)-staartlengte11,12 te bestuderen. Andere methoden om poly(A)-staart te bestuderen zijn onder meer de PCR-amplificatie van 3'-uiteinden, zoals snelle amplificatie van cDNA-uiteinden, poly(A)-test (RACE-PAT)12,13 en de ligase-gemedieerde poly(A)-test (LM-PAT)14. Verdere wijzigingen van de PAT-test zijn onder meer ePAT15 en sPAT16. Enzymatische G-tailing17,18 of G/I-tailing van het 3'-uiteinde zijn andere variaties van de PAT-test. Verdere modificatie van deze technieken omvat het gebruik van fluorescerend gelabelde primers samen met capillaire gelelektroforese voor analyse met hoge resolutie, ook wel de hoge-resolutie poly(A)-test (Hire-PAT) genoemd19. Deze PCR-gestuurde assays maken een snelle en zeer gevoelige kwantificering van poly(A)-lengtes mogelijk.

Met de ontwikkeling van sequencing van de volgende generatie maakt een high-throughput sequencingmethode, zoals PAL-seq20 en TAIL-seq21, polyadenylatieanalyses op transcriptoombrede schaal mogelijk. Deze methoden bieden echter slechts korte sequentiemetingen van 36-51 nucleotiden. Daarom is FLAM-Seq22 ontwikkeld voor globale staartlengteprofilering van mRNA van volledige lengte en biedt het lange lezingen. Nanopore-technologie23 biedt PCR-onafhankelijke, directe RNA- of directe cDNA-sequencing voor schattingen van poly(A)-staartlengtes. Deze high-throughput methoden zijn echter niet zonder beperkingen. Ze vereisen grote hoeveelheden uitgangsmateriaal, zijn duur en tijdrovend. Bovendien kan het analyseren van zeldzame transcripten een enorme uitdaging zijn met high-throughput-methoden, en PCR-gebaseerde methoden met lage doorvoer bieden nog steeds een voordeel wanneer een klein aantal transcripten moet worden geanalyseerd, voor pilot-experimenten en validatie van andere methoden.

We hebben onlangs aangetoond dat Dscam1-mRNA's korte poly(A)-staarten bevatten in Drosophila, wat een niet-canonieke binding van het cytoplasmatische poly(A)-bindende eiwit op Dscam1 3'UTR vereist met behulp van de G/I-tailing-methode24. Hier bieden we een gestroomlijnde procedure voor weefselvoorbereiding en het kwantificeren van poly(A)-lengte van mRNA's van het Drosophila-zenuwstelsel en Drosophila S2-cellen.

Protocol

1. Kweken en selecteren van Drosophila-larven

  1. Onderhoud/kweek de vliegenstam (w1118, wildtype) op standaard vliegenvoermedium bij 25 °C in een bevochtigde incubator.
  2. Selecteer 10 zwervende larven van de 3einstar 72 uur na het leggen van de eieren.
  3. Plaats de larven in een lege petrischaal van 35 mm en was ze voorzichtig door de larven met een pincet over te brengen naar de nieuwe schaal met kraanwater. Doe dit 2x om eventueel achtergebleven voedsel te verwijderen.

2. Isolatie van de hersenen van Drosophila-larven (Figuur 1)

figure-protocol-1
Figuur 1: Dissectie van de hersenen van de Drosophila-larven uit het 3e zwerfstadium van de instar. (A) Schematische tekeningen van de larve van Drosophila. (B-G) Larve dissectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Leg 10 larven op een dissectieschaal met ijskoude PBS.
  2. Plaats de larve met de achterkant naar boven (te herkennen aan tracheale buizen die over de lengte lopen) en speld elk uiteinde vast aan de onderkant van de schaal, gevolgd door een kleine incisie te maken in de lichaamswand aan het achterste uiteinde.
  3. Knip de lichaamswand langs de dorsale middellijn naar het voorste uiteinde met behulp van een microdissectieschaar.
  4. Spoel het inwendige van de larve kort door met een Pasteur pipet 3x met PBS in de schaal om de hersenen bloot te leggen.
  5. Lokaliseer en til de hersenen op met behulp van de pincet en isoleer ze zorgvuldig met een microdissectieschaar.
  6. Breng de ontlede hersenen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met ijskoude PBS op ijs; Verzamel alle larvenhersenen. Ga verder met RNA-extractie met behulp van een RNA-microprep-kit zoals beschreven in sectie 4.
    OPMERKING: Voer binnen 15 minuten een dissectie uit van 10 larven om weefselbeschadiging en RNA-afbraak te voorkomen.

3. Drosophila S2 Schneider-cellen

  1. Kweek Drosophila S2-cellen in het medium van Drosophila Schneider aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 25 °C in een bevochtigde incubator tot een dichtheid van 8 × 106 tot 10 × 106 cellen/ml met een levensvatbaarheid van minimaal 90%.
  2. Verdun de cellen in een steriel conisch buisje van 50 ml tot 2,5 × 106 cellen/ml met Schneider's Drosophila-medium aangevuld met 10% FBS dat is voorverwarmd tot 25 °C.
  3. Breng 8 ml van de celsuspensie (20 × 106 cellen) over in een kweekplaat van 100 mm en voeg 4 ml medium toe om tot 12 ml te komen (dag 1).
  4. Incubeer de gekweekte cellen bij 25 °C in een bevochtigde incubator.
    NOTITIE: Cellen hechten zich losjes aan de plaat na 12-16 uur (dag 2).
  5. Transfecteer de cellen met de juiste DNA-plasmiden24.
  6. Incubeer gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator.
  7. Verzamel na incubatie cellen door 5 ml ijskoude PBS toe te voegen door voorzichtig te pipetteren (dag 4).
  8. Breng de cellen over in een buisje van 15 ml.
  9. Pelleteer de cellen door te centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  10. Spoel de cellen 2x af met ijskoud PBS door voorzichtig pipetteren en verzamel de cellen door ze te centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  11. Voer RNA-extractie uit met behulp van een RNA miniprep-kit.
    NOTITIE: Voer de volgende stappen uit in een steriele laminaire stroomkap.

4. Totale RNA-extractie uit de hersenen en S2-cellen van Drosophila-larven

  1. Larvale hersenen: Verwijder PBS door kort te centrifugeren (8 s kort centrifugeren bij 5.000 × g).
  2. Voeg 600 μL RNA-lysisbuffer toe en homogeniseer 10x met een plastic stamper. Inspecteer de buis visueel onder een stereomicroscoop om volledige lysis te garanderen.
  3. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om weefselresten te verwijderen. Breng het geklaarde supernatans over in een nucleasevrije microcentrifugebuis.
  4. Isoleer RNA met behulp van een RNA-microprepkit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Het gebruik van een RNA-microprep-kit is essentieel voor de larvale hersenmonsters vanwege de kleine hoeveelheid RNA die in de monsters aanwezig is.
  5. S2-cellen: Verwijder PBS en isoleer RNA volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Meet de RNA-opbrengst en -kwaliteit door middel van spectrofotometrie en agarosegelelektroforese.
    1. Bepaal de zuiverheid en hoeveelheid geëxtraheerd RNA door de optische dichtheid van het geëxtraheerde RNA te meten bij respectievelijk A260 nm en A280 nm. Zorg ervoor dat de A260 nm/A280 nm-verhouding ≥2.0 is en dat de RNA-concentratie >350 ng/μL is voor stroomafwaartse toepassingen.
      OPMERKING: Een typische RNA-opbrengst van 10 Drosophila-larvenhersenen is ~500-800 ng/μL of 2,5-4 μg in 5 μL. Voor S2-cellen is de opbrengst ~2-3 μg/μL (15-30 μg in 15 μL). Geïsoleerd RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C voor langdurige opslag.

5. Bereiding van RNA-gel en elektroforese

  1. 1,5% denaturerende RNA-gel (100 ml)
    OPMERKING: Formaldehyde is giftig bij contact met de huid en inademing van dampen; Hanteer het in een chemische zuurkast.
    1. Los drie agarosetabletten (1,5 g) op in 82 ml MOPS-buffer (aanvullend bestand 1) totdat de tabletten volledig uiteenvallen en fijne deeltjes vormen.
    2. Verwarm de agarose-suspensie in een magnetron tot de oplossing helder is en alle deeltjes volledig zijn opgelost.
    3. Koel de oplossing af tot ~60 °C.
    4. Voeg 18 ml 37% formaldehyde toe en meng door zachtjes te draaien. Giet de oplossing in de gietbak en laat het stollen in een zuurkast.
  2. Voorbereiding van RNA-monsters en elektroforese
    1. Verdun het RNA-monster tot 200 ng (in 5 μL) en voeg 5 μL 2x RNA-laadkleurstof toe.
    2. Verwarm de monsters op 70 °C gedurende 5 minuten in een droog bad.
    3. Laad 2 μL RNA-ladder in de eerste baan en 10 μL monsters in de aangrenzende banen.
    4. Voer elektroforese uit in MOPS-buffer bij 100 V gedurende 60 minuten voor een gel van 5 x 6 cm.
      NOTITIE: Pas de elektroforesevoorwaarden aan afhankelijk van de amplicongroottes.
    5. Visualiseer de gel op een UV-transilluminator.
      OPMERKING: De aanwezigheid van een enkele band ~600 nucleotidegrootte duidt op intacte RNA-bereiding (zie figuur 2A).

6. Poly(A) staartlengtemeting

figure-protocol-2
Figuur 2: Voorbereiding van RNA-monsters en de poly(A)-staarttest. (A) De RNA-gelbeelden tonen totaal RNA van de hersenen van de Drosophila-larve (links) en S2-cellen (rechts) op een 1,5% formaldehyde-agarosegel. Enkelstrengs RNA-laddergroottes worden weergegeven in nucleotiden op baan M. Let op een belangrijke RNA-banding op ~600 nt, die afkomstig is van rRNA. (B) Schema's van de poly(A)-staartanalyse. Afkorting: G/I = guanosine/inosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. GI-residu (figuur 2B)
    1. Bewaar de reagentia op ijs en bereid het volgende mengsel (20 μL): tot 14 μL totaal RNA-monster (1 μg), 4 μL 5x Tail-buffermix en 2 μL 10x Tail-enzymmix.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten in een thermocycler.
    3. Voeg 1,5 μL van de staartstopoplossing toe; Blijf 2 minuten op ijs staan.
      NOTITIE: Ga verder met omgekeerde transcriptie of bewaar de GI-staart RNA-monsters bij -80 °C totdat ze klaar zijn om door te gaan met omgekeerde transcriptie.
  2. Reverse transcriptie en PCR-amplificatie
    1. Synthetiseer cDNA door het mengsel te bereiden en te incuberen onder de omstandigheden beschreven in aanvullend bestand 1.
    2. Verdun de cDNA-monsters en voer PCR uit om DNA te amplificeren zoals aangegeven in aanvullend bestand 1.

7. PCR-productanalyse door middel van agarosegelelektroforese

  1. Analyseer een kleine portie (2-5 μL) van de PCR-producten uit stap 6.2.2 op een agarosegel van 2,5% door elektroforese bij 100 V gedurende 45 minuten voor kwaliteitscontrole.
  2. Controleer de specificiteit van PCR voor genspecifieke en staartspecifieke reacties door de volgorde van de gelgeëxtraheerde PCR-banden te bepalen.

8. Capillaire elektroforese

  1. Voer gelelektroforese met hoge resolutie uit op 1 μL PCR-producten (0,5-5 ng/μL) van genspecifieke en poly(A)-specifieke PCR met behulp van de bioanalysator met een hooggevoelige DNA-kit. Zoek naar goed opgeloste pieken die duiden op een succesvolle run.

9. Data-analyse: poly(A)-staartlengtemeting (figuur 3)

figure-protocol-3
Figuur 3: Poly(A) staartlengte en piekwaarde meting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Toegang tot gegevens
    1. Om toegang te krijgen tot de gegevens, opent u het xad-bestand in de software.
    2. Selecteer de naam van het voorbeeld of de ladder in het deelvenster Boomstructuur.
      OPMERKING: Dit toont het resultaat als elektroferogrammen of gelachtige afbeeldingen voor de geselecteerde monsters. De onderste marker 35 basenpaar (bp) en de bovenste marker 10.380 bp zijn de interne standaarden die worden gebruikt om de laddergegevens (50-7.000 bp) af te stemmen op de gegevens van de monsterputten.
    3. Zoom in en uit op de elektroferogrammen en gelachtige afbeeldingen om de details weer te geven.
  2. Uitvoeren van piek- en uitstrijkjes
    1. Om de piekmaten te verkrijgen, opent u het elektroferogram van een geselecteerd monster.
    2. Klik met de rechtermuisknop op het elektroferogram en selecteer handmatige integratie om handmatig pieken te selecteren door de horizontale lijn te slepen.
    3. Let op de piekwaarden in de tabel Piek. Identificeer de piek met de grootste piekhoogte. Dit is een piek van poly(A)-staartlengte voor een individueel monster. In het getoonde voorbeeld is dat 346 bp.
    4. Schakel het pictogram Setpoints weergeven/verbergen in het bovenste menu in en wacht tot er aan de rechterkant een nieuw paneel verschijnt.
    5. Selecteer Geavanceerd, scrol omlaag naar Uitstrijkje uitvoeren en schakel het selectievakje in. Hiermee wordt de tabel Regio toegevoegd aan het tabblad Elektroferogram.
    6. Selecteer een elektroferogram uit een voorbeeld en ga naar de tabel Regio, die de menu's Van [bp] en Naar [bp] toont. Om het begin en einde [bp] in te stellen, klikt u met de rechtermuisknop op het elektroferogram en selecteert u Regio om Regio toevoegen toe te voegen.
    7. Klik met de rechtermuisknop op een cel in de tabel Regio en selecteer Regio's wijzigen om een klein nieuw venster te laten verschijnen waarin aangepaste regio's kunnen worden ingesteld.
      OPMERKING: We hebben bijvoorbeeld een regio van 300 bp tot 550 bp gebruikt voor GAPDH. De genspecifieke GAPDH PCR leverde een piek op bij 265 bp. De universele primer (tabel 1) verlengt de lengte van poly(A)-PCR met 35 bp via gloeien naar G/I-staart-RNA's. Het eerste adeninenucleotide op GAPDH-RNA begint dus bij 300 bp (265 + 35). We hebben de maximale poly(A) staartlengte willekeurig beperkt tot 250 (300 + 250 = 550). Uit de regiotabel retourneert het programma de gemiddelde grootte binnen de regio als 387 bp.
    8. Gebruik vergelijking (1) om de poly(A)-staartlengte op het mRNA van belang te berekenen:
      Poly(A) staartlengte = (A - B - 35) (1)
      Waarbij A de gemiddelde bp is van poly(A)-specifiek PCR-product van elektroferogram (d.w.z. 387 bp voor GAPDH), B de piekbp van genspecifiek PCR-product van elektroferogram (d.w.z. 265 bp voor GAPDH), en "35" de lengte is van de universele omgekeerde primertag.
      OPMERKING: Uit de bovenstaande berekening blijkt dat de gemiddelde poly(A)-staartlengte van GAPDH 387 - 265 - 35= 87 bp is.

10. Visualisatie van de lengteverdeling van de poly(A)staart

  1. Gegevens exporteren als csv-bestand onder Bestand | Exporteren | Voorbeeldgegevens om voorbeeldgegevens op te halen.
    OPMERKING: Het geëxporteerde csv-bestand geeft de looptijd weer in plaats van bp op de X-as.
  2. Ga naar een elektroferogram van een monster en vink Maten weergeven aan op het tabblad Elektroferogram om de regiotabel op de regiotabel automatisch te converteren van bp naar runtime. In het voorbeeld komen 70,39 s tot 86,28 s overeen met 300 bp tot 550 bp.
  3. Open het csv-bestand en selecteer de waarden van 70,39 s tot 86,28 s looptijd om een grafiek te genereren. Als u bp-grootten wilt visualiseren op de X-as in de grafiek, exporteert u het elektroferogram met bp-grootten als een afbeeldingsbestand en legt u het over de grafiek die in de spreadsheet is gegenereerd. Dit komt overeen met de bp-maten op de poly(A)-staartverdeling.

Resultaten

Hier analyseerden we de poly(A) staartlengte van Dscam1 en GAPDH uit de larvale hersenen van Drosophila (Figuur 4). Geïsoleerde RNA's werden gevisualiseerd op een agarosegel voor kwaliteitscontrole. Een enkele RNA-band met een nucleotidegrootte van ongeveer 600 duidt op intacte RNA-voorbereiding (Figuur 2A). RNA's werden onderworpen aan de G/I-tailing en capillaire elektroforese met hoge resolutie met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer. De gelbeelden werden geëxporteerd met behulp van de Agilent 2100 Expert Software en dienovereenkomstig geassembleerd. De PCR-producten van GAPDH en Dscam1 genspecifieke primerparen vertoonden een duidelijke enkele band, terwijl die van de genspecifieke/universele primerparen verschillende uitstrijkpatronen vertoonden (Figuur 4A en Tabel 1), wat wijst op differentiële poly(A)-lengte van GAPDH - en Dscam1-mRNA's . In figuur 4B werd de uitstrijkanalyse gebruikt om gemiddelde poly(A)-staartlengtes te verkrijgen van GAPDH en Dscam1. De elektroferogrammen werden geëxporteerd en aangepast om de poly(A)-staartlengtes weer te geven (figuur 4C).

Op dezelfde manier voerden we een poly(A)-staartlengteanalyse uit op S2-cellen (Figuur 5). Om de rol van Dscam1 3'UTR bij het verkorten van poly(A)-staarten te bepalen, werden S2-cellen getransfecteerd met de DNA-plasmiden die Dscam1-coderend gebied bevatten met SV40 3'UTR of Dscam1 3'UTR. De minimale SV40 3'UTR werd geselecteerd voor de controle van Dscam1 3'UTR, aangezien SV40 3'UTR op grote schaal wordt gebruikt als een minimale transcriptiebeëindiging en polyadenylatiesignaal voor recombinante DNA-plasmiden. Totaal RNA werd geëxtraheerd en onderworpen aan RT-PCR, G/I-tailing en capillaire elektroforese met hoge resolutie (Figuur 5). Het resultaat toont aan dat de poly(A)-staartlengteverdeling van het SV40 3'UTR-plasmide een vergelijkbaar patroon volgde als dat van het endogene GAPDH , terwijl de poly(A)-staartlengteverdeling van het Dscam1 3'UTR-plasmide een vergelijkbaar patroon volgde als dat van endogene Dscam1-mRNA uit de larvale hersenen.

figure-results-1
Figuur 4: Poly(A)-staartlengtemeting van GAPDH en Dscam1 uit de larvale hersenen. (A) Capillaire gelelektroforese lost het genspecifieke PCR-product op als een discrete band (eerste en tweede baan) voor GAPDH2 en Dscam1. Het PCR-product met behulp van universele omgekeerde primer vertoont een uitstrijkverdeling (derde en vierde rijstrook). * niet-specifieke band. (B) De gemiddelde lengte van de poly(A)-staart werd berekend met behulp van de uitstrijkanalyse. (C) De verdeling van de poly(A)-staartlengte werd gereconstrueerd aan de hand van het geëxporteerde csv-bestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 5: Poly(A)-staartlengtemeting van getransfecteerd Dscam1-DNA-plasmide. Gekweekte Drosophila S2-cellen werden geco-transfecteerd met de Dscam1-constructies die het coderende gebied van Dscam1 en de 3′UTR van Dscam1 of SV40 bevatten. (A) Capillaire gelelektroforesebeelden worden getoond voor het genspecifieke PCR-product als een discrete band (eerste en tweede baan) voor SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) en Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). Het PCR-product met universele omgekeerde primer vertoont een uitstrijkpatroon (derde en vierde rijstrook). * niet-specifieke band. (B) De gemiddelde lengte van de poly(A)-staart werd berekend met behulp van de uitstrijkanalyse. (C) De poly(A)-staartlengteverdeling werd gereconstrueerd op basis van het geëxporteerde csv-bestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dscam1 zei:
Voorwaartse primer (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG
Omgekeerde Primer (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC
SV40
Voorwaartse primer (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC
Omgekeerde primer (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
GAPDH
Voorwaartse Primer (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC
Omgekeerde primer (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC
Universele omgekeerde primer
Omgekeerde Primer (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCTT

Tabel 1: Primers die in dit protocol worden gebruikt.

Aanvullend dossier 1: Samenstelling van oplossingen en PCR-opstelling. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In dit protocol beschrijven we de techniek om het larvale brein van Drosophila te ontleden uit het zwervende 3e instar-stadium, evenals de monstervoorbereiding van Drosophila S2-cellen. Vanwege de labiele aard van mRNA's vereist het verzamelen van monsters extra voorzichtigheid. Voor larvale hersendissectie mogen de hersenen niet worden beschadigd tijdens isolatie en mogen ze niet voor langere tijd in oplossing worden bewaard. Het is essentieel om de dissectietijd te beperken tot 8-10 minuten voor een dissectieronde. Het kan ook nuttig zijn om de dissectieoplossing aan te vullen met RNAaseremmers. Wat betreft de S2-celkweek en transfectie, voert u alle stappen uit in de laminaire stromingskap.

De RNA-isolatiestap vereist extra aandacht. We raden aan om een cleanroom van het laminaire stromingstype te gebruiken die is voorbehandeld met RNase-verwijderende oplossingen. Afgezien van de RNA-opbrengst, is het essentieel om de RNA-integriteit te controleren om er zeker van te zijn dat het monster niet is afgebroken tijdens de dissectie- en isolatiestappen. RNA-integriteit kan worden gevisualiseerd door agarosegelelektroforese te denatureren. Het totale RNA van Drosophila vertoont een enkel bandprofiel omdat 28S rRNA is gedissocieerd in twee even grote subeenheden, wat overeenkomt met het 18S rRNA25. Dit kan worden gezien als een enkele band van ongeveer 600 nucleotiden bij gebruik van een enkelstrengs RNA-ladder (Figuur 2A).

Geïsoleerde RNA-monsters worden onderworpen aan de G/I-staart (Figuur 2B). Guanosine- en inosineresiduen worden aan het 3′-uiteinde van RNA's toegevoegd door gistpoly(A)polymerase (PAP)17, dat het 3′-uiteinde van RNA beschermt tegen enzymatische afbraak. De nieuw gesynthetiseerde G/I-tag-beschermde RNA's van volledige lengte worden omgekeerd getranscribeerd om cDNA-monsters op te leveren met behulp van de universele omgekeerde primer (3'-gelabeld C10T2). Gevolgd door een PCR met de genspecifieke voorwaartse/achterwaartse primers direct stroomopwaarts van de polyadenylatieplaats om een PCR-product te genereren dat een scherpe band vertoont. De PCR-reacties van een genspecifieke voorwaartse en de universele omgekeerde primers genereren ongedefinieerde lengtes van DNA-moleculen als een uitstrijkje op de gel, dat verschillende lengtes van poly(A)-staarten weerspiegelt. De PCR-producten werden vervolgens geanalyseerd door middel van capillaire gelelektroforese.

Bij het ontwerpen van primers is het belangrijk op te merken dat de amplicongrootte met genspecifieke voorwaartse/achterwaartse primers in het bereik van 50-300 bp moet liggen. Het testen van meerdere voorwaartse primers geeft de mogelijkheid om de beste primer te vinden die werkt voor poly(A)-staartbeoordeling. We raden aan om een omgekeerde primer te ontwerpen voor genspecifieke producten net stroomopwaarts van de voorspelde poly(A)-startplaats, omdat dit de mogelijkheid biedt voor een eenvoudige berekening van de poly(A)-staartlengtes. Bij het uitvoeren van PCR-reacties is het belangrijk om een "no reverse transcriptase control" uit te voeren om amplificatie van besmet genoom-DNA uit te sluiten. PCR-optimalisatie met een gloeitemperatuurgradiënt wordt sterk aanbevolen. Gezien de aard van deze methodologie vereist het analyseren van poly(A)-staartlengtes van alternatief gepolyadenyleerde mRNA-soorten aanvullende overweging. Veel genen ondergaan bijvoorbeeld alternatieve polyadenylering om verschillende 3'UTR-soorten te genereren26. We raden aan om verschillende PCR-primersets te gebruiken om individuele 3'UTR-soorten te bestuderen.

We raden ten zeerste aan om het genspecifieke PCR-product op capillaire gelelektroforese in elke run op te nemen, aangezien er in elke run een potentieel migratieverschil van een paar nucleotiden is. Het is essentieel dat bij de berekening van de poly(A)-staartlengte de werkelijke grootte van het basenpaar van de genspecifieke PCR wordt gebruikt in plaats van de theoretische grootte.

Sommige RNA's ondergaan aanvullende posttranscriptionele modificaties, waaronder terminale uridylering27. De G/I-staartmethode is mogelijk niet geschikt voor het meten van poly(A)-staartlengte wanneer het mRNA wordt geuridyleerd. Dit komt omdat de universele omgekeerde primer de mRNA-soort die niet-adeninenucleotiden aan het 3'-uiteinde heeft, mogelijk niet efficiënt amplificeert. De G/I-tailing is een op PCR gebaseerde methode, die mogelijk ongewenste vertekening creëert door kortere fragmenten efficiënter te versterken. Gebruikers moeten dus voorzichtig zijn bij het interpreteren van het resultaat.

Met behulp van de hier gepresenteerde methode hebben we aangetoond dat de G/I-staart efficiënt kan worden gebruikt om poly(A)-staartlengte te meten van het Drosophila-zenuwstelsel en S2-cellen. De methode is zeer kwantitatief in combinatie met capillaire elektroforese. Hoewel high-throughput-analyses een globale poly(A)-staartanalyse bieden, is de low-throughput PCR-gebaseerde methode G/I-tailing nog steeds zeer nuttig voor single-transcript-analyse, pilot-experimenten en validatie van andere methoden. Samengevat hangt de keuze van de methode af van de specifieke onderzoeksvragen en doelen. Onderzoekers moeten de methode kiezen die het beste past bij hun experimentele behoeften en middelen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 aan JK, en de Cellular and Molecular Imaging Core-faciliteit aan de Universiteit van Nevada, Reno, die werd ondersteund door National Institutes of Health Grant P20GM103650 en gebruikt voor onderzoek dat in deze studie werd gerapporteerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)Research Product Internation (RPI)M92020
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies 5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demoAgilent Technologieshttps://www.agilent.com/nl/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA LadderGenesee Scientific19-109
BioanalyzerAgilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Research Product Internation (RPI) D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)New England biolabs B7024S
Drosophila S2 cell lineDrosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s MediumThermo Fisher Scientific21720024
Ethidium bromideGenesee scientific 20-276
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF4135
Forceps Dumont 5  Fine Science tools 11254-20
Nuclease free waterThermo Fisher Scientific AM9932
PBS 10xResearch Product Internation (RPI) P32200
Poly(A) Tail-Length Assay KitThermo Fisher Scientific 764551KT
RiboRuler Low Range RNA LadderThermo Fisher Scientific SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher Scientific R0641
RNA microprep kitZymoresearch R1050 
RNA miniprep kitZymoresearch R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting EdgeFine Science tools 15000-08
TopVision Agarose TabletsThermo Fisher ScientificR2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)Thermo Fisher ScientificB49

Referenties

  1. Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
  2. Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).
  3. Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
  4. Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622(2021).
  5. Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
  6. Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
  7. Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
  8. Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
  9. Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
  10. Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
  11. Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
  12. Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
  13. Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
  14. Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
  15. Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
  16. Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
  17. Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
  18. Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57(2001).
  19. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  20. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
  21. Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
  22. Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
  23. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  24. Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
  25. Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294(2015).
  26. Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
  27. Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

PolyadenyleringsanalyseDrosophila breinDrosophila S2 cellenGI tailingmRNA regulatiecapillaire gelelektroforesePCR amplificatiereverse transcriptiegenexpressie
Meting van Poly A-staartlengte van Drosophila-larvehersenen en cellijn
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.